Protocol
OPMERKING: Alle experiment protocollen werden goedgekeurd door de Franse Dierproeven en ethische commissie en gevalideerd door de "Service Protection et Santé Animales, Environnement" met nummer A-75-2065. Steekproefomvang gekozen reproduceerbaarheid van de proeven te waarborgen, en volgens de 3R dieren ethische regelgeving.
1. Voorbereiding van de Muis
- Anesthesie
- Voor korte beeldvorming (minder dan 1 uur), verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 200 pl van een zoutoplossing met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
- Alternatief, gedurende langere beeldvorming (maximaal 4 uur), verdoven de muis met een inhalatie van isofluraan 2.5% verdampt in een 70/30 mengsel van O2 / N2 O, via een aangepaste masker.
- LET OP: Op deze manier zorgt voor meer stabiele bewusteloosheid en vermijdt seriële intraperitoneale injectie van drugs. Zodra de muis wordt verdoofd, controleert bewusteloosheid door stimulatie van de voet pad met een kniptang.
- Vaatverkleuring / extra kleuring
- Voor vaatverkleuring: Injecteer intraveneus in de staartader, 200 ui Rhodamine-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in zoutoplossing buffer).
- Voor neutrofiel kleuring: injecteer 2 ug Ly6G-PE (kloon 1A8) in 100 pl zoutoplossing intraveneus in de staartader.
- Immobilisatie
- Voor immobilisatie, gebruik dan een op maat gemaakte stereotactische houder aangepast aan de microscoop en de narcosegas inhalator.
OPMERKING: De sterotactic houder is een metalen steun met twee metalen plaat beugels, een wordt vast en de andere verwijderbare en aanpasbaar, aan het hoofd van het dier vast te zetten. - Installeer het hoofd van de muis tussen de vasthoudplaten tot isolatie zorgen van de ademhaling bewegingen. Draai de oren tussen behoud van platen en ga naar het sk rekkenin. Controleer voor stabiliteit en ademhaling welzijn van het dier.
- Voor immobilisatie, gebruik dan een op maat gemaakte stereotactische houder aangepast aan de microscoop en de narcosegas inhalator.
- Verwijder de hoofdhuid
- Zorgvuldig gebruik van ethanol 70% aan het haar van de hoofdhuid te bevochtigen met een steriele applicator, het vermijden van contact met de ogen.
- Snijd de huid met een steriele schaar en tangen op de hoofdhuid van de achterlijke van de pariëtale bot volledig te verwijderen om de frontale bot. Weg te houden tot 3 mm van de ogen en oren om uitgebreide bloeden te voorkomen. Verwijder de losse bindweefsel die de schedel (periost). Spoel de resterende haren met warm PBS-doordrenkte papieren handdoek.
- Onderdompeling systeem opgezet
- Plak een rubberen ring van 18 mm diameter met chirurgische lijm direct op de schedel met een kleine naald om de distributie te beheersen. Lijm de gehele omtrek van de rubberen ring om lekkage te voorkomen (30 ui moet voldoende zijn).
- Reinig de schedel onder de ring nog een laatste keer met PBS-doordrenkte papieren handdoek en voeg dan 37 ° C PBS voor een volledige onderdompeling van deschedel. Voeg een daling van 0,9% NaCl-oplossing of specifieke oogzalf op elk oog van de muis om droge ogen te voorkomen. Sleep de stereotactische houder onder de doelstelling.
- Ongeveer positioneren het veld met behulp van de microscoop oculair door rechtstreekse toezending.
2. Twee-foton Imaging Acquisition
- Gebruik een multifoton microscoop in combinatie met een Ti: Sapphire crystal laser, die 140fs pulsen van NIR licht geeft, selectief regelbaar van 680 tot 1080 nm, en een akoestisch-optische modulator voor laser power control. Gebruik een configuratie met 3 externe niet descanned detectoren (NDD) met een combinatie van 2 dichroïsche spiegels (565 nm en 690 nm), 565/610 en 500/550 banddoorlaatfilters (dat gelijktijdige opname van 3 fluorescerende kanalen inschakelen), en een 485 korte pass filter, met een plan apochromaat × 20 (NA = 1) water immersie objectief.
- Zet de verwarming kamer om goede homeothermie van de ANAES toestaanthetized muis.,
LET OP: De temperatuur kan worden ingesteld 1 uur voor de beeldvorming sessie voor een betere stabiliteit. In ons geval is 32 ° C gekozen optimale lichaamstemperatuur van de verdoofde muizen (36-37 ° C) af en wordt gehandhaafd gedurende 4 uur. Deze temperatuur kan worden aangepast aan het gebruikte (digitale probe kan worden gebruikt om dit punt te controleren). Bovendien, de verwarmingskamer gebruikte donker / zwart en dekt een deel van het systeem (doelstellingen en gemotoriseerd plaat) externe licht te voorkomen. - Schakel het systeem
- Zet de Ti: Sapphire laser, dan is het hele microscoop systeem. Start de acquisitie software. Stel de laser golflengte tot 870 nm. Kies de juiste NDD voor opname.
LET OP: In ons geval, tweede harmonische generatie (SHG) 19 en cyaan fluorescente eiwit (ECFP) worden gedetecteerd door de NDD na de 485 korte pass filter. ECFP wordt ook gedetecteerd door de NDD na 500/550 banddoorlaatfilter en rhodamine-dextran wordt gedetecteerd door thij NDD na de 565/610 bandfilter.
- Zet de Ti: Sapphire laser, dan is het hele microscoop systeem. Start de acquisitie software. Stel de laser golflengte tot 870 nm. Kies de juiste NDD voor opname.
- Pas overname instellingen
- Gebruik de "live-overname" imaging bevel van de software en het gebruik van de microscoop directionele controle, past u de focus op een regio met ECFP en Rhodamine signaal. Stel het laservermogen aan de minimum beste signaal-ruisverhouding met minimale foto-schade vorderen.
OPMERKING: De kracht instelling die wordt gebruikt is afhankelijk van de diepte van de regio van belang. Typisch de AOM-instellingen zijn ingesteld rond de 20%, wat een laservermogen dan de doelstelling rond 15 mW vertegenwoordigt. Het is beter om winst macht te vergroten op de PMT's voor elke NDD om foto-bleken en foto-schade te beperken. Typische overname instellingen zijn enkel scannen met een pixelverblijftijd van 1,58 microseconden, en een resolutie van 512 x 512 pixels met een 1,5 vergroting.
- Gebruik de "live-overname" imaging bevel van de software en het gebruik van de microscoop directionele controle, past u de focus op een regio met ECFP en Rhodamine signaal. Stel het laservermogen aan de minimum beste signaal-ruisverhouding met minimale foto-schade vorderen.
- Kies een regio van belang
- Zodra de opname parameters worden ingesteld, gebruik opnieuw de "live" overname commando,en enquête het weefsel tot een gewenste (x, y, z) veld worden gevolgd in real time te kiezen.
OPMERKING: Typisch, kozen we voor een gebied met inbegrip van zowel vasculaire en parenchymatisch gebieden. - Registreer het veld met de "positie" programmatuur.
LET OP: Dit commando onthoudt x, y, z-coördinaten van verschillende verafgelegen gebieden. - Selecteer en registreer extra velden van belang (maximaal 3) volgens dezelfde procedure.
- Stel een 3D z-stack met de "z-stack" programmatuur op de eerste opgeslagen positie volgens het gewenste volume met de gekozen vergroting. Onthoud diepere positie, en dan de hoogste stand. Normaliseren laservermogen met de diepte.
OPMERKING: Voor meerdere gelijktijdige beeldveld, verkrijgen we 5 segmenten gescheiden door 3 urn z-stappen voor elk veld tot een volume van 12 urn dikte te verkrijgen. Deze instellingen kunnen worden aangepast aan het type cel bestudeerd.
- Zodra de opname parameters worden ingesteld, gebruik opnieuw de "live" overname commando,en enquête het weefsel tot een gewenste (x, y, z) veld worden gevolgd in real time te kiezen.
- Overname lancering
- Selecteer220; tijdreeksen "software commando en kies de duur van de tijd interval en het aantal cycli. Begin time-lapse imaging volgens de time lapse en de duur vereist door het selecteren van de "start experiment" programmatuur.
LET OP: In ons geval hebben we een volume van elke 30 sec verwerven tijdens 60 cycli vertegenwoordigt 30 min real time. Kleinere time lapse kan worden uitgevoerd om snel cel proefbaan in het bloedvat. In dit geval dunnere z-stack en niet meer dan 2 verschillende velden worden geregistreerd op hetzelfde moment. - Regelmatige controle van de set-up.
- Let altijd op het dier om ervoor te zorgen dat het onbewuste.
LET OP: Het schudden van de snorharen of benen van het dier zijn indicatoren van opwekking. Indien de ademhaling van het dier schokkerig, kan de hoeveelheid isofluraan iets afneemt. Sterke weefsel drift tijdens acquisitie is een indicator van de muis revival. - Zorg ervoor dat het doel goed is ondergedompeld. Renew 37 ° C PBS between twee overnames (30 min).
OPMERKING: Progressieve verdwijnen van het signaal tijdens de overname is de aanduiding van PBS lekkage.
- Let altijd op het dier om ervoor te zorgen dat het onbewuste.
- Selecteer220; tijdreeksen "software commando en kies de duur van de tijd interval en het aantal cycli. Begin time-lapse imaging volgens de time lapse en de duur vereist door het selecteren van de "start experiment" programmatuur.
- Einde van de procedure
- Zodra de benodigde video's worden opgenomen, euthanaseren het dier door cervicale dislocatie snel voordat reanimatie.
OPMERKING: wondgenezing leidt tot de vorming van een korst in 24 tot 48 uur die de mogelijkheid longitudinale beeldvorming voeren beperkt.
- Zodra de benodigde video's worden opgenomen, euthanaseren het dier door cervicale dislocatie snel voordat reanimatie.
3. Data Analysis
- Drift correctie
- Gebruik Imaris Bitplane software voor 3D-automatische tracking.
- Open het 3D-beeld volgorde op Imaris. Selecteer "spot" commando, en genereert handmatig volgen (muisklik + shift) voor alle tijdstippen gedurende ten minste 4 verschillende ankerpunten zo mogelijk homogeen verdeeld in het veld.
- Breng de drift correctie met behulp van "juiste drift" opdracht in het tabblad "edit track".
- Controleer voor tHij kwaliteit van de correctie in x, y en z name om artefact wankelen voorkomen.
OPMERKING: Als de correctie niet bevredigend is, probeer dan andere ankerpunten of de video te sluiten van de analyse.
- Cell tracking
- Gebruik "add new spots" commando en selecteer "spoor vlekken na verloop van tijd" algoritme setting. Ga naar de volgende stap.
- Solliciteer automatische cell tracking procedure, hetzij op de hele kanaal van belang het gebruik van "bron kanaal" commando. Set voorwerpen (dwz cellen) diameter 10 urn. Ga naar de volgende stap.
OPMERKING: De keuze hangt af van het onderscheid tussen objecten en specificiteit van het gemeten signaal. Kortom, automatisch volgen van het gehele kanaal is alleen mogelijk als gedetecteerde signaal specifiek is voor het object of interest. Omdat zowel SHG en ECFP worden gedetecteerd door de NDD na 485 korte pass filter, zal volgen specifieker en efficiënter gebruik van de ECFP signaal opgenomen door de NDD na 5 zijn00/550 banddoorlaatfilters. Geclusterd of dichte verpakt voorwerpen zullen handmatige selectie van individuele objecten vergelijkbaar met stap 3.1.2 nodig. - Selecteer "kwaliteit" type filter, zet de drempel tot het volgen van niet-specifieke objecten uit te sluiten. Ga naar de volgende stap.
- Kies "Brownse Algorithm Motion" met nauwkeurige parameters van "Maximale afstand" en "Spleetgrootte" tussen twee plekken. Valideren spoor generatie.
- Zodra tracks automatisch worden berekend, selecteer "Tijdsduur" type filter, zet de drempel om tracks te elimineren korter dan 120 sec (die 4 keer punten).
- Verplichte: Na het automatische volgen, controleren de kwaliteit van de tracks.
- Rol de tijdbalk om te controleren of de objecten volgen het spoor paden. Zo niet, gebruik maken van de mogelijkheden van het spoor punt correctie beschikbaar op het tabblad "edit": Verwijder valse of onjuiste tracks met "delete" commando (schrappen een track point individueel met behulp van "disconnect" commando). Als pad van de track is discontinu, voeg ontbrekende tijdstippen (muisklik + shift), selecteert u alle punten op een bepaalde baan, en gebruik "connect" opdracht in het tabblad "edit track".
- Kwantificering parameters
- Selecteer het tabblad "Statistiek" in "Preferences" commando, kies de dynamische parameters die van belang in de lijst. Selecteer "Exporteer alle statistieken naar bestand" commando en sla het Excel-bestand gegenereerd.
OPMERKING: Verscheidene dynamische parameters worden direct uit de software verkregen zoals trajectlengte, instantane snelheid, gemiddelde snelheid, en volgen rechtheid. Motiliteit coëfficiënt 6, 20 kan worden bepaald, maar is niet rechtstreeks door de software. - Voor elke cel, berekent het gemiddelde van de verplaatsingen voor elke tijdsperiode (AT) (voor een 30 sec time lapse film, zal AT zijn 30, 60, 90 sec, etc).Zet de gemiddelde kwadraat van de verplaatsing als een functie van de tijd interval. Verkrijgen motiliteit coëfficiënt door het berekenen van de helling van het lineaire gedeelte van de curve.
- Selecteer het tabblad "Statistiek" in "Preferences" commando, kies de dynamische parameters die van belang in de lijst. Selecteer "Exporteer alle statistieken naar bestand" commando en sla het Excel-bestand gegenereerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muis schedel structuur biedt een goede gelegenheid om het beenmerg fysiologie te bestuderen door intravitale beeldvorming. Het bot dun rond de voorkant-parietale gebied, is het mogelijk om toegang tot medullaire niches slijtvaste van het bot krijgen. Figuur 1 een breed 2D gebied van de schedel van een MacBlue transgene muis. Het bot matrix bestaat hoofdzakelijk uit collageen I gemakkelijk door SHG 19. Injectie van rhodamine-dextran kleurt het vasculaire netwerk van het beenmerg en maakt de identificatie van parenchymale beenmerg nissen tussen de botmatrix en de vaten 14. ECFP cellen worden verdeeld in de twee compartimenten van het beenmerg, maar zijn afwezig in de botmatrix. Monocyten worden handmatig ingedeeld naar hun locatie in het weefsel. Vasculaire monocyt wordt gedefinieerd wanneer de gehele cel binnen het vaatstelsel, ongeacht de grootte van het vaartuig. Alleen grote verzamelen venulen zijn uitgesloten van onze aNALYSE. Parenchymale monocyt wordt gedefinieerd wanneer de cel zich bevindt tussen de vasculatuur en de botmatrix.
Time-lapse imaging specifieke interessegebied (aanvullende video 1 en 2) maakt de berekening van de individuele cel traject tijd voor zowel vasculaire (figuur 2A) of parenchym (figuur 2B) monocyten. De track lengte blijkt dat parenchymaal monocyten scherm verminderd verplaatsing ten opzichte van vasculaire monocyten. Analyse van de verplaatsing in de tijd vergelijkt de gemiddelde snelheid van monocyten in beide compartimenten (Figuur 2C). De gemiddelde kwadratische verplaatsing als functie van de tijd is een maat voor de ruimtelijke omvang van willekeurige beweging. Motiliteit coëfficiënt wordt bepaald door de helling van het lineaire gedeelte van de kromme is en een beter beeld van de cel verplaatsing (zie bespreking sectie). De motiliteit coëfficiënt van vasculaire monocyten (MC = 71μm² / s) hoger is dan de motiliteit coefficient van parenchymale monocyten (MC = 4.4μm² / s).
De tijdsresolutie van acquisitie worden aangepast aan de gemiddelde cel snelheid. Rolling vasculaire monocyten kan belangrijke verplaatsing maken binnen een korte tijd vertraging. Voor een nauwkeurigere cell tracking, waardoor het tijdsinterval verkrijging voorkeur. Figuur 3 toont een illustratie van monocyt volgen twee verschillende tijd-resoluties. Een 30 sec tijdinterval vermindert de nauwkeurigheid en de lengte van de paden (groene stippellijn) vergeleken met 10 sec tijdsinterval.
Tenslotte illustreert figuur 4 de mogelijkheid om een cel subsets gelijktijdig analyseren monocyten. Ly6G is een specifieke marker van volwassen muis neutrofielen. De injectie van anti-Ly6G gecombineerd met een fluorochroom (hier Phyco-erythrin) 5 minuten voor de beeldvormingssequentie vlek neutrofielen direct in vivo. Deze benadering geeft een extra dimension analyse en de mogelijkheid te vergelijken het gedrag van de andere cel subsets. Deze aanpak kan worden gebruikt om subsets in de monocyt compartimenten definiëren.
Figuur 1. Brede gebied van de schedel beenmerg organisatie. In vivo twee-foton laser scanning microscopie beeld van de schedel steady-state beenmerg van MacBlue muis. Vaatstelsel (in het rood) wordt gekleurd door de staart ijdele injectie van 2MDa Rhodamine-Dextraan 5 min voor de beeldvorming sessie. Het bot wordt gevisualiseerd door tweede harmonische generatie (blauw). ECFP + monocyten (cyaan) bevinden zich binnen parenchymaal niches (donkere gebieden tussen bloedvaten en bot) en binnen de vaten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Real-time cell tracking. Vertegenwoordiger spoor paden langs tijd van monocyten binnen (A) het vaatstelsel en (B) het parenchym. Tracks (groene lijn) voor elke cel worden automatisch gegenereerd door de software. Rode vlekken vertegenwoordigen het massamiddelpunt van bijgehouden cellen. (C) gemiddelde snelheid vergelijking van vasculaire parenchymale en monocyten. Mann-Whitney statistische analyse uitgevoerd, *** betekent p <0,001. (D) gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) als functie van de tijd is vertegenwoordigd vasculaire parenchymale en monocyten. Asymptotische curve geeft de beperkte verplaatsing van de cellen in de tijd, terwijl lineaire curve geeft random walk in een niet-ingeperkte omgeving. Motiliteit coëfficiënt geeft de mate van cel verplaatsing en wordt bepaald door de helling van de c Urve berekend door lineaire regressie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Tijdsinterval resolutie in de studie van het rollend monocyten. Representatief beeld sequenties laten zien dat verhoogde tijdsresolutie verbetert de nauwkeurigheid van de rollende cel van de bal. (Up) Afbeelding reeks met 10 sec tijdsintervallen. (Omlaag) Afbeelding volgorde met 30 sec tijdsintervallen. De kwaliteit van het spoor pad wordt verbeterd en het risico van het onderzoek van twee verschillende cellen voor dezelfde of de tegenovergestelde verminderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
Figuur 4. In vivo co-lokalisatie van medullaire neutrofielen en monocyten. Deze figuur illustreert de mogelijkheid een andere cel subsets in vivo detecteren gelijktijdig met monocyten, door injectie specifiek monoklonaal antilichaam in combinatie met een fluorochroom. 2 ug Ly6G-PE antilichaam werd intraveneus geïnjecteerd 5 min voordat schedel beenmerg beeldvorming van de MacBlue muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende Video 1. migratiegedrag van parenchymale monocyten. In vivo 3D-beeldvorming van de steady-state trekkende activiteit van monocyten in de schedel beenmerg parenchym van een MacBlue muis. De ECFP + signaal is in cyaan. Trekroutes voor elke cel (rode stip) verschijnen in het groen.
Aanvullende video 2. migratiegedrag van vasculaire monocyten. In vivo 3D-beeldvorming van de steady-state trekkende activiteit van monocyten in de schedel beenmerg vasculatuur van een MacBlue muis. De ECFP + signaal is in cyaan. (2M Da) rhodamine-dextran geïnjecteerd voordat de opnamesessie op het beenmerg vasculatuur (rood) onderscheiden. Trekroutes voor elke cel (rode stip) verschijnen in het groen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische punten in vivo beeldvorming methodologie stabiliteit van de focus, teneinde de duur van beeldvorming maximaliseren en het risico van bacteriële besmetting en ontsteking, die de dynamiek van de ontstekingscellen kan van invloed minimaliseren. Beeldvorming van de schedel beenmerg volgt deze doelstellingen als de operatie uitgevoerd om toegang tot het beenmerg krijgen is minimaal. Het gebruik van steriel materiaal en antiseptica is essentieel om het risico van infectie die storing kunnen veroorzaken in celhomeostase beperken.
De ontwikkeling van de stereotactische houder kan een uitdaging en vereist specifieke maat voor elk systeem (afstand tussen objectief en gemotoriseerde fase van de microscoop, gebruik van gas inhalator voor anesthesie). Het is belangrijk om het hoofd van de muizen krijgen zo horizontaal mogelijk een bredere toegang beeld-vormoppervlak. Zodra het dier is gepositioneerd, is het waarschijnlijk dat enkele minuten requir kaned om een goede stabiliteit van de focal plane te verkrijgen. Daarom is het raadzaam om te controleren of het weefsel drift voor de lancering van de overname opname. Omdat dit proces samen met de selectie van gebieden die van belang een tijdje kan duren, is het ook aan te raden om regelmatig te controleren dat het dier bewusteloos is als Ketamin / Xylazin zijn gebruikt, en om te controleren of de juiste onderdompeling van de doelstelling zoals lekkage en verdamping kan voordoen.
De goede positionering van de rubberen ring op de schedel is een belangrijke stap in het proces. Cyanoacrylaat lijm zorgt voor goede resultaten in termen van stabiliteit en afdichting, maar men nodig heeft om overmatige belasting van lijm, die de schedel en blokkeren de toegang tot de regio van belang van het weefsel zou kunnen dekken te voorkomen. Het voordeel van directe onderdompeling van de schedel zonder glazen dekglaasje is toegang tot diepere regionen van het bot krijgen. Bovendien, omdat de schedel geen vlak oppervlak, zal dit niet het opnamegebied beperken tot de concontactoppervlak tussen de schedel en het dekglaasje, waardoor een brede beeldvorming veld, zoals weergegeven in figuur 1.
Voor alle beeldvormende technieken, de keuze tussen overname snelheid en kwaliteit resolutie is een compromis. Zo is het aantal en de kwaliteit van de beelden per tijdseenheid beperkt, en de keuze hangt af van de wetenschappelijke vraag behandeld. Typisch, worden de vasculaire monocyten snel rollen cellen, terwijl parenchymatische monocyten zijn traag beweeglijk of zittend. Een nauwkeurig volgen van rollend cellen vereist een hogere tijdsresolutie van verwerving, zie figuur 2. Hoog imaging tarief sessiele cellen nutteloos en hoog x, y, z resolutie kan de voorkeur verdienen om stuwende werking van dendrieten bijvoorbeeld analyseren. Snelle cellen zou dikker volume tot een langere volgen van hun verplaatsing te krijgen in z vereisen.
De gemiddelde kwadratische verplaatsing als functie van de tijd wordt niet door de software Imaris. De Principle van deze representatie gebaseerd op het feit dat een voorwerp ballistisch reizen zonder enige ontmoeting of structurele vernauwing, de afstand reisde zou evenredig met het tijdsinterval (Figuur 2D) zijn. Aldus lineariteit van de helling geeft een random walk in een niet-ingeperkte omgeving. Daarentegen zou asymptotische vorm van de curve een beperkte verplaatsing in de tijd van de celpopulatie weerspiegelen. Het tweede voordeel van deze berekening is dat de snelheid soms wordt overschat door artefactual verplaatsing van het centrum van de massa. Dit is vooral belangrijk voor langzaam bewegende cel met stuwend activiteit. Aldus berekening van de motiliteit coëfficiënt door de helling van de kromme berekend door lineaire regressie geeft een echt verplaatsing van de cellover tijd 21.
Ly6G kleuring in vivo illustreert de mogelijkheid om een nieuwe parameter analyse tijdens het belichtingsproces toe (Figuur 3 et al in druk). Hoewel meer dan 98% van vasculaire neutrofielen correct geëtiketteerd, de kleuring van beenmerg neutrofielen minder efficiënt, en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit sterk verminderd, wat suggereert verminderde toegang van het antilichaam tegen het beenmerg parenchym (gegevens niet getoond). Rhodamine dextran, quantum dots of andere specifieke kleurstoffen van apoptotische of necrotische cellen zoals Dapi, propidiumjodide, Sytox 22 of fluorescente reporter voor celfuncties zoals productie van reactieve zuurstof species 23 kan intraveneus worden toegevoegd via de staartader gedurende beeldvorming proces en bieden een goede gelegenheid om de functionele eigenschappen zoals celdood, fagocytose en neutrofielen extracellulaire val te kwantificeren. Mazo et al 12 keurig gebruikte twee verschillende vasculaire kleurstoffenmet een laag en hoog molecuulgewicht beter contrast parenchym en vasculatuur. De keuze van de fluorescente kleurstof is kritisch voor gelijktijdige verwerving van de verschillende fluorescente reporters mogelijk. Inderdaad, de excitatiegolflengte dienovereenkomstig worden gekozen om het beste compromis tussen alle gebruikte fluorescerende kleurstoffen krijgen.
Het protocol hierin gebruikt is het mogelijk te analyseren in vivo de biologische activiteit van een cel compartiment studie die moeilijk dusver. Histologische analyse van het beenmerg weefsel vereist gewoonlijk een lange bereiding van botontkalking tot dunne gedeelte staan, en geeft slechts een statische weergave van het weefsel. De dynamische visie benadrukt de snelheid van de cel-uitwisseling tussen het parenchym en het beenmerg sinusoïden. Deze snelle proces is een cruciale stap om te ontcijferen, om een beter begrip van de cel mobilisatie mechanisme op inflammatoire signaal 5 of conditioneringscycli myeloaplasive chemotherapie hebbenRegime 6. We hebben bij cel intravasation 6 gemeld, maar dit proces nauwelijks detecteerbaar door de lage frequentie steady state. Het is echter waarschijnlijk versterkt bij inflammatoire signalering. Chemokinereceptoren zoals CCR2, CX3CR1 of CXCR4 zijn sterk betrokken bij het proces van intravasation, vandaar het gebruik van genetische vervallen van deze receptoren zou nieuwe fundamentele inzichten in de paden van celmigratie bieden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen Anne Daron en Pierre Louis Loyher bedanken voor redactionele ondersteuning, het Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) voor hulp bij de twee-foton microscoop en het dier faciliteit "NAC" en Camille BAUDESSON voor muizen fokken hulp. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de financiering van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap ontvangen (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 304.810 - RAID's, en n ° 241440-Endostem, van INSERM aan de Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", van la" Ligue contre le cancer ", van" Association pour la Recherche sur le Cancer "en van" Agence Nationale de la Recherche "Programma Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH werd ondersteund door la "Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
