Abstract
Los recientes avances en la aplicación de las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) para el tratamiento de las lesiones del tendón y ligamento en el caballo sugieren mejoraron las medidas de resultado en los dos estudios experimentales y clínicos. Aunque el BMMSC se implantan en la lesión del tendón en grandes cantidades (generalmente 10 - 20 millones de células), sólo un número relativamente pequeño sobrevivir (<10%), aunque estos pueden persistir por hasta 5 meses después de la implantación. Esto parece ser una observación común en otras especies donde BMMSC se han implantado en otros tejidos y es importante para entender cuando se produce esta pérdida, cuántos sobreviven el proceso de implantación inicial y si las células se borran en otros órganos. El seguimiento del destino de las células se puede lograr mediante la radiomarcación de BMMSC antes de la implantación que permite no invasiva de imágenes in vivo de la localización celular y cuantificación del número de células.
Este protocolo describe un labeli celularng procedimiento que utiliza tecnecio-99m (Tc-99m), y el seguimiento de estas células después de la implantación en tendones flexores heridos en caballos. Tc-99m es un (t 1/2 de 6,01 hr) de isótopos de corta duración que emite rayos gamma y puede ser internalizada por las células en presencia de la oxima hexametilpropilenamina compuesto lipófilo (HMPAO). Estas propiedades lo hacen ideal para su uso en las clínicas de medicina nuclear para el diagnóstico de muchas enfermedades diferentes. El destino de las células marcadas se puede seguir en el corto plazo (hasta 36 hr) por escintigrafía gamma para cuantificar tanto el número de células retenidas en la lesión y la distribución de las células en los pulmones, tiroides y otros órganos. Esta técnica es una adaptación del etiquetado de los leucocitos de la sangre y podría ser utilizado para BMMSC imagen implantado en otros órganos.
Introduction
Estrategias regenerativas para la reparación de los tejidos enfermos o dañados se basan en células madre multipotentes derivadas de una variedad de tejidos e implantado en la zona afectada. Los recientes avances en la aplicación de autóloga BMMSC para el tratamiento del tendón y lesiones de ligamentos en el caballo han demostrado la mejora de las medidas de resultado, tanto experimental 1-5 y estudios clínicos 6. El caballo es un modelo especialmente atractivo para la evaluación de la eficacia de las células madre tratamientos relacionados, ya que sufre de edad y sobreesfuerzo lesiones relacionadas a los tendones de la extremidad anterior distal, es un animal atlético, y es una recuperación grande, facilitando la médula ósea y implantación precisa. Lesiones del tendón de sanar de forma natural con la fibrosis, pero el tendón sanado es funcionalmente inferior 7 y tiene un alto riesgo de una nueva lesión 8. El tendón flexor digital superficial (TFDS) se ve afectado con mayor frecuencia, ya que ha evolucionado para actuar como una energía elásticatienda y experiencias de alta carga hincapié para lograr la eficiencia energética y la locomoción de alta velocidad. Restaurar la función después de la lesión tanto, es fundamental. Estas lesiones son similares a los que afectan el tendón de Aquiles en los seres humanos, que realiza una función similar 9. No hay buenas opciones de tratamiento para tratar o lograr buenas condiciones para este tipo de lesiones, por lo tanto, las estrategias de regeneración basada en células ofrecen una atractiva oportunidad para mejorar los resultados y reducir una nueva lesión.
En la mayoría de estudios de 5 - 20 millones de BMMSC autólogo se inyectan directamente en la lesión que por lo general se produce dentro del núcleo del cuerpo del tendón que por lo tanto actúa como un receptáculo para las células. El destino de las células una vez inyectadas no es métodos claros y distintos etiquetado celular para rastrear las células se han descrito recientemente. Las células marcadas con una etiqueta de fluorescencia, se mostró a sobrevivir sólo en un número relativamente pequeño (<10%) 10,11. Etiquetas de fluorescencia requierenla extracción de tejidos y seccionamiento para el análisis histológico, que es mucho tiempo y no facilita fácilmente análisis temporal en un modelo animal de gran tamaño o en casos clínicos. En un trabajo más reciente se ha utilizado el 99m Tc radioisótopos para etiquetar células y seguir su destino por gamma gammagrafía 1. Este método permite comparaciones rápidas que se hagan entre las diferentes vías de administración de células, incluyendo intralesional, intravenosa a través de la vena yugular 1 o perfusión regional vía intra-arteriales 12 o intravenosos 1,12 inyecciones. La persistencia y la distribución de células pueden obtenerse imágenes por escintigrafía gamma de varios órganos. Esto ha demostrado que sólo el 24% de las células inyectadas intralesional permaneció en la lesión por 24 hr 1 y esto se apoya en otro estudio usando lesiones experimentalmente creados y utilizando el mismo marcador radiactivo 5. Además, las células muestran una capacidad limitada para el hogar en las lesiones del tendón cuando delivered por perfusión regional o por vía intravenosa, pero se dispersan en los pulmones por los últimos 4 rutas.
BMMSC marcado con nanopartículas de hierro es un método alternativo para realizar un seguimiento de las células implantadas en los tendones de las extremidades anteriores 13. Aunque las células marcadas de nanopartículas de hierro permiten el seguimiento de células in vivo por resonancia magnética, los estudios temporales en un animal grande están limitadas por el número de veces que la anestesia se pueden administrar en cada punto de tiempo para la realización de las exploraciones de MRI. Además, las nanopartículas de hierro son hipointensa en la RM que limita la información sobre la migración de células marcadas en el cuerpo del tendón. Otros radioisótopos que se pueden utilizar incluyen indio-111, pero esto tiene la desventaja de una semivida más larga que Tc-99m (2,8 días vs 6,0 hr) y mayor energía de emisión de rayos gamma. Además, la viabilidad celular se ha informado de que se reduce cuando marcado con indio-111 14. Tc-99m, por otro lado, se utiliza rutinariamente en tanto nuclear equina y humanamedicina para marcar las células mononucleares de sangre periférica y sigue su distribución in vivo mediante gammagrafía. Puede ser relativamente fácil captado por las células utilizando HMPAO como una molécula de enlazador para unir el tecnecio, como Tc-99m-HMPAO, a las células. Tc-99m-HMPAO etiquetado BMMSC mostrar buena viabilidad y puede proliferar in vitro 4. Este protocolo se detalla el etiquetado y el seguimiento de BMMSC autólogo equina implantado en las lesiones que ocurren naturalmente en el TFDS extremidad anterior.
Es importante tener en cuenta que el protocolo está solamente destinado a ser utilizado como una herramienta de investigación. Su uso como una modalidad terapéutica clínica no se recomienda como el efecto de la radiomarcador en el fenotipo celular no ha sido totalmente dilucidado.
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Protocol
Los casos descritos en este documento se realizaron siguiente permiso ético otorgado por el Comité de Ética Animal y el Bienestar del Colegio de Veterinarios de Málaga, España, y el Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Los procedimientos utilizados en los caballos se basan en los protocolos aprobados que son utilizado en la clínica en caballos que reciben terapias basadas en células madre, que incluye la sedación, la aspiración de médula ósea, la inyección intra-tendinosa, perfusión regional, la inyección intravenosa, la gestión y el tratamiento del dolor post-procedimiento y el seguimiento después de la implantación.
1. Disposiciones clave para hacerse con anticipación
- Busque ética institucional y la aprobación del bienestar animal y cumplir con los requisitos legales locales antes de comenzar el trabajo.
- Buscar la aprobación institucional para trabajar con radiaciones ionizantes según lo dictado por las regulaciones locales y legales, incluyendo el nivel adecuado de protección del personal y el medio ambiente y la eliminación de contamresiduos inated.
- Utilice los siguientes criterios de inclusión: caballos presentan con una lesión sobreesfuerzo no traumática (tendinopatía o desmopatía) al tendón digitales flexor superficial de la extremidad anterior y las lesiones resultantes de un defecto en el tendón y el defecto está rodeado de tendón y / o paratenon intacta .
Nota: El examen y el diagnóstico de este tipo de lesiones y la preparación clínica de los caballos para la implantación de células se ha detallado en otra parte 6,15.
Nota: El aislamiento y expansión en cultivo de BMMSC derivado de la médula ósea de los caballos se ha detallado previamente 6,16. El protocolo actual para inyectar BMMSC por lesiones TFDS en el caballo utiliza 10 millones de células por ml 4 de sobrenadante de médula ósea autólogo (BMS) 16. - Utilice células que han sufrido no más de 4 pasajes para la implantación in vivo para evitar la posible fenotipo celular o alteraciones genéticas asociadas con el número de alto pasaje cells.
- Entregar el número requerido de células en el BMS (a menos de 24 hr en una caja de enfriamiento a las 4 - 8 ° C) a la clínica veterinaria, donde la implantación de células se va a realizar.
Nota: El uso clínico de células madre mesenquimales en el sobrenadante de médula ósea es un procedimiento patentado propiedad de ReCellerate Inc (EE.UU.) y su uso puede requerir la autorización.
Nota: Tc-99m es un emisor gamma (140 keV) con una vida media relativamente corta (6,0058 hr, por lo tanto, casi el 94% de los que se descompone a su forma estable de 99 Tc en 24 hr). La energía gamma hace que sea adecuado para la detección mediante cámaras gamma (gammagrafía) y los cortos resultados de vida media en el tiempo de exposición de radiación muy limitado tanto para el caballo y el personal de manejo de animales. Este protocolo describe el etiquetado in situ de células utilizando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado con Tc-99m (como pertecnetato de sodio)]. - Pide el Tc-99m fresca del proveedor de tal manera que se entrega y se utiliza para etiquetar el ingenio de las célulashin 2 hr de elución del generador de Tc-99m. Asegúrese de que el Tc-99m se suministra como 1 GBq en (tampón estándar del proveedor) a 1 ml de solución.
- Utilice todos los tampones a RT. Realice el procedimiento de etiquetado, la implantación de las células y de imagen (gammagrafía) en un ambiente de contención de isótopos con todo el equipo se limpia con toallitas con alcohol antes del inicio de los trabajos.
2. Preparación del Caballo y La ecografía de la extremidad anterior del tendón
- Ecografías Registro de primer ingreso por lesiones (cuando es aspirado de médula ósea) y luego en el punto de tiempo en que se inyectan células radiomarcados.
- Realizar la ecografía y la implantación de las células con el caballo la carga de peso de manera uniforme en un puesto de pie y bajo sedación (en vez de la anestesia general). Administrar la sedación usando una mezcla de detomidina HCl y tartrato de butorfanol, cada uno a 0,01 a 0.02 mg / kg IV.
Nota: La recuperación es rápida y post-quirúrgica de tratamiento no requiereConsideraciones Especiales. - Después de la anestesia perineural se aplica (paso 2.6) en el miembro afectado, mantener el caballo en la estación bajo sedación para reducir el movimiento del caballo durante el tratamiento. Compruebe visualmente el nivel adecuado de sedación juzgar por la posición de la cabeza baja y la actitud del caballo y que el caballo es cómodo durante la inyección de células y los movimientos de la cámara gamma durante la adquisición de imágenes gammagráficas.
Nota: No es necesario aplicar ungüento veterinario en los ojos (para prevenir la sequedad) porque bajo sedación parpadeo no se ve afectada y el caballo es capaz de mantener la hidratación de los ojos. El seguimiento después de la implantación de las células no es invasivo (ecografía y gammagrafía gamma). - Clip de cerca el pelo que recubre el tendón (con cortar el pelo de caballo) y luego limpie el área recortada utilizando una combinación de un lavado quirúrgico clorhexidina y finalmente alcohol.
- Aplicar gel de acoplamiento acústico al área yanalizar metódicamente para grabar las exploraciones de la región metacarpiana palmar completa, niveles secuencialmente marcadas 1 - 7 de 17, con un transductor lineal (12 MHz o similar) para obtener serie transversal en la incidencia y las imágenes longitudinales. Almacenar las imágenes digitalmente de modo que el área de sección transversal y la zona de lesión máxima 4 se pueden obtener con la ayuda de software de análisis de imagen.
- Prepare el área que recubre los nervios palmares inmediatamente distal al carpo para inyección aséptica de anestésico local para garantizar la desensibilización completa de la piel que recubre el tendón y el tendón flexor digital superficial. Inyectar 2 ml de mepivicaine tanto por vía subcutánea y adyacente a los nervios palmares (en su localización sub-fascial) entre los tendones flexores y el ligamento suspensorio inmediatamente distal al carpo en ambos lados de la extremidad.
- Una vez que la exploración preliminar se ha realizado preparar el sitio de implantación por la depuración del área con una clorhexidina s quirúrgicoscrub solución durante al menos 5 min y finalmente alcohol con una gasa empapada. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica.
3. Tc-99m-etiquetado de las células madre mesenquimales Equina
Nota: Los pasos de etiquetado de células se pueden realizar durante la ecografía de la extremidad anterior, ya que la decadencia de isótopos minimizará entre el etiquetado celular y la implantación de células marcadas en el tendón.
- Retire el BMS de las células ya que interfiere con la absorción de isótopo. Para ello, recuperar el vial de BMMSC (10 millones de células en 1 ml de BMS) de la caja de enfriamiento y sedimentar las células en una microcentrífuga a 350 xg durante 5 min a TA. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una 18G o 19G aguja (unida a una jeringa 2 ml), dejando una pequeña gota (≤ 0,1 ml) en el tubo para ayudar a la resuspensión celular. Guardar el sobrenadante (BMS) en un tubo de microcentrífuga estéril y mantener en hielo para su reutilización posterior.
- Resuspender las células en la gotita residual del sobrenadante por flIcking el tubo suavemente con los dedos (en lugar de vórtice) y dejar el tubo en una gradilla a TA. Asegúrese de que las células se volvieron a suspender por completo y que no existen grupos de células visibles.
- Preparar el Tc-99m de la siguiente manera. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnecio en un vial de HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja. Mezclar suavemente pero a fondo y dejar actuar durante 5 minutos detrás de blindaje de plomo. Nota: Este paso se puede realizar mientras que las células están girando en el paso 2.1.
- Añadir toda la mezcla de Tc-99m-HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja a las células y mezclar suavemente. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente detrás de blindaje de plomo.
- Para los pasos siguientes, utilizar un fórceps (o un trozo de papel de seda) para abrir la tapa del tubo de microcentrífuga para minimizar la contaminación del isótopo (enguantada) pulgar y posteriormente otros equipos. Utilice una jeringa de 2 ml y 21 G aguja para añadir o eliminar tampón de lavado.
Nota: Se recomienda el uso de un monitor de campo de isótopos para vigilar la contaminación de superficies y equipos. Añadir 1 ml de PBS a la mezcla de células HMPAO Tc 99m, cerrar la tapa, mezclar suavemente y girar para sedimentar las células como en el paso 3.1. - Retire con cuidado la PBS a un nuevo tubo (guardar esta detrás de blindaje de plomo y la etiqueta como W1). Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS fresco. Centrifugar el tubo y eliminar el sobrenadante que el anterior (salvo esto y etiqueta como W2).
- Calcular la eficiencia del etiquetado mediante la medición de los recuentos en tubos de W1 y W2 y en el sedimento celular. Haga esto colocando cada tubos en una dosis de isótopos instrumento calibrador del pozo y de la grabación de la radiactividad como cuentas por minuto (CPM). Calcular la eficiencia de etiquetado (radiactividad como CPM de las células) / (La radiactividad de las células + sobrenadante) x 100.
- Resuspender las células a fondo en el PBS residual y luego añadir el BMS salvó de paso 3.1. Las células están listas para la implantación intralesional.
4. implantación de células-99m-HMPAO marcados con Tc
- Implantación intralesionalen el tendón bajo guía ecográfica
- Introducir lentamente una pulgada 1,5 o 2 (50 mm) 20 G aguja en la zona de máxima lesión de la lesión en una orientación longitudinal con el transductor de ultrasonidos, cubierto en un campo estéril, en línea con la aguja de modo que la longitud de la aguja puede ser identificado por ecografía y la punta si la aguja está situado con precisión en el centro de la lesión.
- El uso de protección adecuada, recoger las células en un 2 ml jeringa (Luer-lock, para minimizar el riesgo de contaminación externa y en una cubierta de la jeringa plomo blindado) utilizando una aguja de calibre 20. Deseche la aguja con cuidado de no perder el fluido. Ahora coloque la jeringa con las células marcadas en la aguja pre-ubicado en el tendón.
- Coloque la sonda de ultrasonido debajo de la aguja de modo que el trayecto de la aguja en el tejido es claramente visible. Inyectar las células a un ritmo lento pero constante en la lesión. Asegúrese de que no hay resistencia a la inyección. Si esto se encontróreposicionar cuidadosamente la aguja bajo control ecográfico. Compruebe que la expulsión de fluido en la lesión es visible en la imagen de la ecografía como fluido anecoica que contiene burbujas de aire hiperecogénicas.
- Retire la aguja y colocar inmediatamente presión sobre el orificio de la aguja para evitar la pérdida de las células inyectadas y para minimizar la propagación de isótopo sobre la superficie externa de la extremidad. Vestir Inmediatamente la extremidad con una capa de vendaje autoadhesivo. El caballo está ahora listo para gammagrafía. Realizar esto inmediatamente.
Nota: Después de la inyección de las células en el tendón, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa.
- Perfusión regional de las células-99m-HMPAO marcados con Tc
- Siga el paso 2.4.
- Aplique una 100 mm vendaje torniquete de goma en el metacarpo proximal con de dos 100 mm rollo de algodón vendaje de gasa colocada medial y lateral.
- Asépticamente preparar ªe la piel sobre la vena digitales palmares lateral a nivel del hueso sesamoideo proximal lateral por la depuración del área con una solución de lavado quirúrgico de clorhexidina durante al menos 5 min y finalmente con una gasa empapada en alcohol. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica.
- Preparar una extensión de 100 mm engastado con un 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) aguja de mariposa para la venopunción rellenando con solución salina estéril heparinizada y luego introducir la aguja en la vena digitales palmar lateral. Sangre Una vez introducida la vena se llene parcialmente el juego de extensión. En el conector de cierre Luer adjuntar una tapa de caucho de bloqueo Luer para facilitar la posterior inyección de células marcadas.
- Diluir las MSCs en 19 ml de PBS mediante la recopilación de las células en una jeringa de 20 ml precargada con el PBS. Aplicar las células a través de la copa de goma utilizando un 18 G (1,2 x 40 mm) aguja hipodérmica a una velocidad lenta pero constante (30 - 40 seg). Lave el catéter con 1 ml de PBS precargados en un syringmi.
- Retire la aguja e inmediatamente aplique presión en la piel sobre el agujero de la aguja con una capa de cinco 4 x 4 gasas de algodón. A continuación, coloque un vendaje ligero con adhesivo elástico sobre el área sesamoideo proximal y dejar el torniquete en el lugar durante 30 minutos después de la inyección.
- Suelte el torniquete después de 30 minutos. El caballo está ahora listo para gammagrafía.
Nota: Después de la inyección de las células, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa.
5. gammagrafía Gamma
- Imágenes gammagrafía
- Adquirir imágenes gammagrafía planar con una cámara gamma (fijado en 140 KeV pico fotoeléctrico utilizando una ventana simétrica 20%), equipado con una energía baja, colimador agujero paralelo.
- Obtener todas las imágenes después de la hora 0 en caballos sedados como en el paso 2.2 de pie. Después del tiempo de 0 gammagrafía, reemplace el vendaje luz sobre la si la implantaciónde TE con un vendaje acolchado. Eliminar este vendaje antes de cada examen de gammagrafía.
- Adquirir imágenes estáticas durante 60 segundos cada uno (256 por 256 de la matriz), utilizando el software de procesamiento con el "adquirir" - "la selección de estudios" - opciones "hueso estáticos". Es esencial que el caballo no se mueve durante el período de adquisición de la imagen porque la opción de modo estático no tiene un módulo para la corrección de movimiento.
- Para la inyección intralesional, obtener imágenes laterales de la zona de la lesión del carpo de la extremidad distal, el área equivalente de la extremidad contralateral, el campo y el pulmón izquierdo tiroideo izquierdo. Durante la adquisición de imágenes extremidades anteriores, posicionar una pantalla de plomo entre las piernas para evitar la formación de imágenes del contralateral extremidad. Adquirir las imágenes en 5 min después de la inyección (tiempo 0), y después a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 hr.
- Para la perfusión regional, obtener imágenes gamma laterales y dorsales que para 5.1.1.3. Obtener imágenes 5 min afliberación del torniquete ter. Este será el tiempo 0. Puede ser útil a la imagen de la extremidad inmediatamente después de la inyección de las células para evaluar los recuentos antes de la liberación del torniquete. Obtener imágenes gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la administración de las células.
- Después de que las imágenes han sido adquiridos, procesar las imágenes de forma manual utilizando la opción de "procesamiento" del software con las opciones seleccionadas por el color "Sokoloff" y el color "Invertir". A continuación, seleccione la "región de interés" (ROI) y "elipse" ya que esto permite la remodelación de la máscara de la selección y el movimiento sobre el área de la lesión. Obtener los recuentos sobre el retorno de la inversión por la elección de la opción "añadir a las estadísticas". Asegurar que las regiones de tamaño idéntico de interés (ROI) se registran para cada animal en los diferentes puntos de tiempo.
- A continuación, corregir los recuentos de la decadencia predicha del tecnecio en cada punto de tiempo. Utilice la siguiente ecuación para corregir la decadencia:A = A o E - (0.693t / T 1/2), donde A es o la actividad inicial del isótopo, A es la decadencia corrigió la radiactividad en el tiempo cero, t es el tiempo transcurrido y T es la media media -La vida del isótopo. Entonces expresar las cuentas corregidas en cada punto de tiempo como un porcentaje de la ROI en el tiempo 0 para calcular el porcentaje de células restantes, usando la siguiente fórmula:
- Adquirir imágenes gammagrafía planar con una cámara gamma (fijado en 140 KeV pico fotoeléctrico utilizando una ventana simétrica 20%), equipado con una energía baja, colimador agujero paralelo.
% de células restante (T) = 100 - {[(descomposición predicho (t) - desintegración (t)) / decaimiento predijo (t)]} x 100
decaimiento (t) = ROI (t) / retorno de la inversión (0) x 100.
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Representative Results
Tc-99m-HMPAO incorporación en BMMSs no afecta negativamente a su capacidad de adherirse al plástico de cultivo de tejidos y mientras ellos demuestran la capacidad de proliferación para formar monocapas (Figura 1) que no tienen plenamente determinado si las tasas de proliferación u otros fenotipos celulares se ven afectados. Su morfología es similar a las células no marcadas con una forma típica de husillo. La eficiencia de marcaje celular (es decir., La absorción de la etiqueta) varía típicamente desde alrededor de 1,5% a 25%. La principal razón para la baja eficiencia de marcaje se relaciona con el retraso en la entrega de la 99m Tc a la clínica desde el sitio en el que el generador de Mo-99 / Tc-99m se ha eluido. Retrasos de más de 2 horas como resultado una disminución importante en el etiquetado de las células. Sin embargo, suficiente isótopo se incorpora en las células para llevar a cabo la gammagrafía gamma durante un máximo de 36 hr (Figura 2). Los factores que pueden mejorar la eficiencia de etiquetado se detallan en la discusión.
1 (directamente en la lesión) o por perfusión regional a través de una vena digital de 1 o de la arteria 12. Implantación intralesional es posible cuando la lesión está en el núcleo del tendón y rodeado por tejido del tendón intacto que actúa como receptáculo para las células. La perfusión regional es una ruta más fácil de administrar las células a medida que se inyectan en un vaso sanguíneo, pero el método se basa en la expectativa de que las MSC son capaces de "home-in" a la lesión del tendón. Hay pruebas limitadas de que las MSC pueden específicamente hogar en sitios de lesiones tendinosas, pero este método proporciona un enfoque experimental útil para el desarrollo de aplicaciones que pueden aumentar la capacidad de recalada de MSC.
Con la ruta de entrega intralesional, las células se verán como una esfera de actividad de la señal que permanece relativamente localizada con decir el tiempo., Hay s limitadospread o la migración de las células en el tejido del tendón circundante. Por el contrario, habrá una reducción gradual de la señal con el tiempo en el sitio de la inyección cuando las células son administradas por perfusión regional a través de la vena palmar digital (Figura 2). Es común con la inyección intralesional de los campos pulmonares ser negativo pero en algunos casos en los puntos de tiempo muy tempranos del pulmón pueden mostrar señal de isótopo que puede ser focal y luego se convierte más generalizada (Figura 3). La tiroides sigue siendo negativa con esta vía de administración. La perfusión regional de manera similar puede mostrar señal focal en los pulmones que luego se convierte más difusa pero la señal es significativamente más intensa en comparación con la observada con la ruta intralesional. La tiroides puede a menudo también muestran señales focal.
El recuento de radioisótopos total inicial de las células (tiempo 0, pre-inyección) y los recuentos de la gammagrafía gamma inicial en la región de interés (tiempo 0, poste i-njection) se observan y se utiliza para calcular el porcentaje de disminución en los recuentos en cada punto de tiempo. Esto se utiliza para comparar a la decadencia predicha de la Tc-99m partir de los recuentos iniciales (Figura 4). La curva calculada seguirá la curva predicha. Sin embargo, después de tomar la decadencia predicho en cuenta, la persistencia de las células que quedan en el sitio de inyección después de la administración intralesional es de aproximadamente 32% (a 12 h) y 24% (a 24 hr) (Figura 4).
Figura 1. Etiquetado celular, Inyección y Gamma gammagrafía (A) Transferencia de BMMSC en una microcentrífuga antes del marcaje con Tc-99m-HMPAO detrás de plomo forradas blindaje (pantalla y soporte de jeringa) y el monitor de radiación y de microcentrífuga.; (B) una alícuota de células marcadas con Tc-99m-HMPAO sembradas en un cultivo de tejido espectáculo plato de buen morphology, la viabilidad y la proliferación; (C) La inyección de células Tc-99m-HMPAO etiquetados bajo guía ecográfica en el sitio de la lesión de la extremidad anterior derecha TFDS; (D) Gamma gammagrafía de la extremidad anterior. La cámara gamma está posicionado con precisión utilizando un brazo hidráulico maniobrable y cualquier potencial etiquetados células en la extremidad contralateral se eliminan por un escudo de plomo celebrada entre las piernas. La cámara gamma se coloca de manera similar en el pecho para controlar el campo de pulmón o en el cuello para controlar el campo de la tiroides. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ultrasonido y Gamma gammagrafías del TFDS. Ultrasonographs típicos de la extremidad anterior de la región a mediados de metacarpiano en (A (B). La lesión en el TFDS se ve claramente como un área hipoecoica (hacia la parte superior de la exploración) en comparación con el no lesionado (normal) la integridad del tejido del tendón flexor digital profundo (TFDP) adyacente y por debajo de la TFDS. El área de la lesión y las posiciones relativas de los tendones se representan en el esquema a continuación. Scintigraphs gamma realizados a los 3, 6 y 12 horas después de la inyección de células radiomarcados se muestran para las células inyectadas (C) en la lesión o (D) por perfusión regional intravenosa a través de la vena palmar digital. En el caso mostrado, no hubo absorción de células radiomarcados en el sitio de lesión en el TFDS (flechas sólidas). Persistencia de la absorción por la vena digitales palmar se denota por la flecha discontinua. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Gamma gammagrafías del pulmón y tiroides. Escaneos típicos de los puntos de tiempo tempranos se muestran tanto para la inyección intralesional y perfusión regional de células marcadas. Tenga en cuenta la coordinación y la señal difusa de los campos pulmonares y de la tiroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Decaimiento de radiactividad registrados a partir de las Regiones de interés después de la inyección intralesional. En este caballo, se midieron los recuentos de gammagrafía gamma del TFDS más de 36 horas después de la inyección en la lesión. Panel izquierdo: la radiactividad en cada punto de tiempo se calcula con el valor de tiempo 0. Entoncesdecaimiento atural en radiactividad de 99m Tc se muestra para la comparación. Panel derecho: el porcentaje estimado de las células restantes. Esto se calcula a partir del nivel de radiactividad de las regiones de interés. En este caso el porcentaje restante de las células a las 24 horas fue aproximadamente 24%. Hemos realizado este protocolo (etiquetado de MSC y la implantación) en 21 caballos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Además de la médula ósea, las células madre aisladas a partir de fuentes tales como el tejido adiposo son adecuados para el etiquetado con este protocolo. Además, las células de un estado congelado pueden ser revividos y se expandieron en cultivo para los números deseados para los estudios de etiquetado 12.
Un factor crítico que determina la eficiencia de marcaje del BMMSC es el tiempo entre la elución de la Tc-99m desde el generador de molibdeno en la radiofarmacia, la preparación de Tc-99m-HMPAO y el uso del radiofármaco en la clínica. Hay una relación inversa entre la eficiencia y el tiempo de etiquetado después de Tc-99m de elución del generador de tal manera que retrasos más allá de este período pueden afectar significativamente la eficiencia del etiquetado celular. Por lo tanto, se requiere una estrecha coordinación entre la entrega de las células de laboratorio y la entrega del Tc-99m a la clínica el día en que las células serán radiomarcado e implantado. El tiempo de transporte a la cliniPor lo tanto, c es un factor importante. Hoja de datos del proveedor especificar que el decaimiento de la Tc-99m reduce la pureza de la radioquímica después de 2 h post-elución que puede interferir con la unión del HMPAO a la Tc-99m y posteriormente la cantidad de Tc-99m-HMPAO tomado por las células. También hemos observado que el etiquetado de las células cultivadas en un entorno de laboratorio dio etiquetado más eficiente que en la clínica. Esto también ha informado por otro estudio en caballos 5, donde se marcaron las células en un entorno de laboratorio. Además, en nuestra experiencia, la etiqueta se recoge más eficientemente por las células que están etiquetados inmediatamente después de la preparación de muestras de sangre o tejidos en comparación con las células preparadas a partir de la cultura. Sin embargo, incluso con baja eficiencia de etiquetado no es suficiente etiqueta unido a las células para llevar a cabo la gammagrafía durante 36 hr.
Eficiencia de etiquetado de 40% - 80% pueden ser alcanzados por los leucocitos si el Tc-99m se utiliza desde unfresca eluido del generador dentro de 30 min y la reacción se realiza en un volumen pequeño (1 - 0,5 ml) 18. Eficiencias de etiquetado de 47% - 71% se han logrado para equina MSC 19 lo que demuestra que es posible aumentar la eficiencia etiquetado de las MSC en condiciones ideales.
Rutinariamente implante 20 millones de células para el tratamiento de lesiones centrales TFDS aunque hasta 40 millones de células se han implantado para las lesiones más grandes. Un número similar de células podría ser implantado a través de perfusión regional aunque este método no se usa comúnmente debido al procedimiento más complejo. Sin embargo, puede ser útil para lesiones que se extienden a la periferia de la superficie del tendón con la expectativa de que las células suficientes casa en la lesión. Seguimiento de las células por gammagrafía puede proporcionar información útil sobre el movimiento de las células administradas por diferentes rutas. En este protocolo, las células implantadas por vía intralesional son mostly retenido en el lugar de la inyección por vía intralesional. Señal de radioisótopos se puede observar en los campos pulmonares en algunos casos, pero parece que, en general, hay poca migración de las células lejos del sitio de la lesión. Entrega de BMMSC por perfusión regional sugiere que puede haber retención de las células en el sitio de la lesión, pero cuando se suministra mediante inyección intravenosa 4 no hemos observado homing de las células. La etiqueta de Tc-99m-HMPAO no afecta a la capacidad de migración células 20 y, como el Tc-99m-HMPAO es internalizado por las células y se retiene en el citoplasma, es poco probable que interfiera con las propiedades de adhesión.
El cálculo de la señal de las regiones de interés puede ser una subestimación, ya que es posible que que puede haber disociación significativa de la etiqueta a partir de células (liberado de las células muertas u otros mecanismos de liberación de las células vivas). La tiroides captura de isótopos libre (Tc-99m) liberado de las células muertas o moribundas, y Tc-99m-HMPAO puede ser eliminada por el riñón y el intestino. Estos tejidos pueden ser monitoreados por gammagrafía para evaluar la pérdida potencial de la etiqueta.
El procedimiento de marcaje de células puede ser adaptado para el ensayo de retención celular y la absorción en diversos sitios (órganos y lesiones) utilizando diferentes rutas de entrega. La naturaleza focal de la señal en los pulmones puede ser indicativo de agregados de células que presumiblemente se rompen con el tiempo o entran en la lisis celular. La tiroides, que captura isótopo libre, presumiblemente muestra un aumento en la absorción después de la perfusión regional debido a que las células inyectadas y los escombros resultantes de las células muertas tienen una ruta más accesible a la tiroides a través de la circulación. Aunque sólo el 24% de las células se mantienen después de 24 horas, la ruta intralesional en el tendón es la ruta de entrega más eficaz que la mayoría de los casos no mostraron libre Tc-99m en la tiroides. La información obtenida a partir de la utilización de estos protocolos puede informar futuro diseño y desarrollo de aplicaciones de células madre para more terapias clínicas efectivas.
El protocolo de marcaje de células fue adaptado para su uso en el caballo de etiquetado Tc-99m-HMPAO de leucocitos en aplicaciones médicas humanas. Su uso en este protocolo demuestra aplicabilidad en un animal grande en la que la enfermedad del tendón ocurre espontáneamente para las investigaciones de terapias basadas en células. El reclutamiento de casos clínicos puede ayudar a compensar los mayores costos asociados con el trabajo con un animal más grande. El procedimiento de etiquetado para su uso como una modalidad de imagen ha sido descrita en modelos animales pequeños 21 y creemos que el protocolo de manera similar puede ser utilizada en animales más grandes tales como las ovejas para las investigaciones de otras enfermedades de los tendones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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