Abstract
התקדמות ביישום של תאי גזע mesenchymal מח עצם (BMMSC) לטיפול בפציעות גיד ורצועה בסוס מציעה שיפור מדדי תוצאה בשני מחקרים ניסיוניים וקליניים. למרות BMMSC מושתל לתוך נגע הגיד במספרים גדולים (בדרך כלל 10-20,000,000 תאים), רק מספר קטן יחסית לשרוד (<10%) אם כי אלה יכולים להימשך עד 5 חודשים לאחר השתלה. זה נראה תצפית נפוצה במינים אחרים שבי BMMSC כבר מושתלת לתוך רקמות אחרות וזה חשוב להבין, כאשר אובדן זה מתרחש, כמה לשרוד את תהליך ההשתלה הראשוני והאם התאים נמחקים לאיברים אחרים. מעקב הגורל של התאים יכולים להיות מושגת על ידי radiolabeling BMMSC לפני ההשתלה שמאפשרת לא פולשנית בהדמיה vivo של מיקום תא וכימות של מספרים סלולריים.
פרוטוקול זה מתאר labeli תאהליך ng המשתמש בטכנציום-99m (TC-99m), ומעקב של תאים אלה לאחר השתלה לגידים המכופפים נפצעו בסוסים. TC-99m הוא איזוטופ קצר (t 1/2 של 6.01 שעות) שפולט קרני גמא ויכול להיות מופנם על ידי תאים בנוכחות oxime מתחם lipophilic hexamethylpropyleneamine (HMPAO). תכונות אלו הופכות אותו אידיאליים לשימוש במרפאות רפואה גרעיניות לאבחון של מחלות רבות ושונות. גורלם של התאים שכותרתו ניתן בעקבות בטווח הקצר (עד 36 שעות) על ידי מיפוי גמא לכמת הן את מספר התאים נשמרו בנגע וההפצה של התאים לתוך ריאות, בלוטת התריס ואיברים אחרים. טכניקה זו מותאמת התיוג של כדוריות דם לבנות בדם ויכולה להיות מנוצלת לתמונה המושתלת BMMSC באיברים אחרים.
Introduction
אסטרטגיות משובי לתיקון רקמות חולות או פגומות מבוססות על תאי גזע multipotent נגזרים ממגוון רחב של רקמות ומושתלים לתוך האזור הפגוע. התקדמות ביישום של BMMSC אוטולוגית לטיפול בגיד ופציעות רצועה בסוס הראו אמצעים השתפרו תוצאה בשני 1-5 הניסיוניים ומחקרים קליניים 6. הסוס הוא מודל אטרקטיבי במיוחד להערכת היעילות של תאי גזע הקשורים טיפולים כי היא סובלת מגיל ולמתוח יתר על המדה פציעות הקשורות לגידים של forelimb דיסטלי, זה בעלי חיים ספורטיביים, וזה התאוששות גדולה, להקל על מח עצם ו השתלה מדויקת. פציעות גיד להחלים באופן טבעי עם סיסטיק אבל הגיד נרפא מבחינה פונקציונלית נחותה 7 ויש לו סיכון גבוה לפגיעה מחדש 8. הגיד המכופף הדיגיטלי השטחי (SDFT) המושפע ביותר בכינויו זה התפתח לפעול כאנרגיה אלסטיתחנות וחוויות גבוהה טעינה מדגישה להשיג אנרגיה יעילה ותנועה במהירות גבוהה. שחזור פונקציה לאחר פציעה לכן קריטי. פגיעות אלה דומות לאלה המשפיעים על גיד אכילס בבני אדם שמבצע פונקציה דומה 9. אין אפשרויות טיפול טובות לטיפול או להשיג תיקון טוב לפציעות כגון, אסטרטגיות משובי מבוססות תאים לכן מציעות הזדמנות אטרקטיבית לשיפור תוצאות ולהפחית מחדש פציעה.
במרבית המחקרים 5-20,000,000 BMMSC אוטולוגית מוזרקים ישירות לתוך הנגע שמתרחש בדרך כלל בתוך הליבה של גוף הגיד שלכן פועל ככלי קיבול לתאים. גורלם של התאים המוזרקים פעם אחת הוא לא שיטות תיוג תא ברורות ושונות כדי לעקוב אחר התאים תוארו לאחרונה. תאים שכותרתו עם תג הקרינה הוצגו לשרוד רק במספרים קטנים יחסית (<10%) 10,11. תוויות הקרינה מחייבותחילוץ רקמות וחתך לניתוח היסטולוגית שזה זמן רב ולא בקלות להקל על ניתוח זמני במודל חיה גדול או במקרים קליניים. בעבודה מאוחרת יותר השתמשנו 99m Tc הרדיו-איזוטופי לתייג תאים ועיקבו אחרי גורלם על ידי מיפוי גמא 1. שיטה זו מאפשרת השוואות מהירות להתבצע בין מסלולים השונים של משלוח תא, כוללים intralesional, תוך ורידי באמצעות וריד הצוואר 1 או זלוף האזורי באמצעות זריקות תוך ורידי או 12 1,12 תוך-עורקים. ההתמדה וההפצה של תאים ולאחר מכן ניתן הדמיה על ידי מיפוי גמא של איברים שונים. זה הוכיח כי רק 24% מהתאים המוזרקים נשארו intralesionally בנגע על ידי 24 שעות 1 וזו נתמכת על ידי מחקר אחר באמצעות נגעים נוצרו בניסוי ומשתמש באותו radiolabel 5. יתר על כן, התאים להראות יכולת המוגבלת לבית לנגעי גיד כאשר delivereD על ידי זלוף האזורי או לוריד, אבל הם התפזרו לריאות על ידי הנתיבים האחרונים 4.
BMMSC שכותרתו עם חלקיקי ברזל הוא שיטה חלופית כדי לעקוב אחר התאים מושתלים לגידי forelimb 13. למרות שתאי שכותרתו ננו-חלקיקי הברזל לאפשר מעקב תא in vivo על ידי MRI, מחקרים זמניים בבעלי חיים גדולים מוגבלים במספר הפעמים יכולות להינתן הרדמה בכל נקודה לביצוע סריקות MRI זמן. יתר על כן, חלקיקי ברזל הם hypointense על MRI אשר מגביל את המידע על ההגירה של תאים שכותרתו לתוך גוף הגיד. רדיואיזוטופים אחרים שניתן להשתמש בי כוללים אינדיום-111 אבל זה סובל חסרון של מחצית חיים ארוכים יותר מTc-99m (2.8 ימים לעומת 6.0 שעות) ואנרגיה פליטה קרני גמא גבוהה יותר. בנוסף, כדאיות תא דווחה להיות מופחתות כאשר כותרתו עם אינדיום-111 14. TC-99m, לעומת זאת, משמש באופן שגרתי בשני גרעיני סוסים ובני אדםרפואה לתייג תאי דם היקפי mononuclear ועיקבו אחרי ההפצה שלהם in vivo על ידי מיפוי. ניתן בקלות יחסית לקח את זה על ידי תאים באמצעות HMPAO כמולקולת מקשר לקשור טכנציום, כTc-99m-HMPAO, לתאים. TC-99m-HMPAO כותרת BMMSC להראות כדאיות טובה ויכול להתרבות במבחנה 4. פרוטוקול זה מפרט את התיוג ומעקב של BMMSC אוטולוגית סוסים מושתל לתוך נגעים טבעיים בSDFT forelimb.
חשוב לציין כי הפרוטוקול נועד רק כדי לשמש ככלי מחקר. השימוש בו ככלים טיפוליים קליניים אינו מומלץ כהשפעה על הפנוטיפ radiolabel סלולארי לא הובהרה במלואו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המקרים המתוארים במסמך זה בוצעו בעקבות אישור שניתן על ידי אתי בבעלי חיים ועדת האתיקה והרווחה של Colegio de Veterinarios דה מלאגה, ספרד, והמלכותית וטרינרית המכללה, צפון Mymms, בריטניה נהלי שימוש בסוסים מבוססים על פרוטוקולים שאושרו ש משמש במרפאת על סוסים מקבלים טיפולים מבוססים תאי גזע הכוללים הרגעה, שאיפת מח עצם, הזרקה תוך tendinous, זלוף האזורי, הזרקה תוך ורידית, ניהול טיפול וכאב שלאחר פרוצדורליים וניטור לאחר השתלה.
1. הסדרי מפתח ליינתנו מראש
- חפש אתיקה מוסדית ואישור רווחת בעלי חיים ולדבוק בדרישות חוק מקומיות לפני תחילת עבודה.
- לבקש אישור מוסדי לעבודה עם קרינה מייננת כפי שהוכתב על ידי תקנות משפטיות מקומיות וכוללים את הרמה המתאימה של הגנה על אנשים ועל הסביבה ורשות contamפסולת inated.
- השתמש בקריטריונים להכללה הבאות: סוסים הנוכחיים עם פציעה הלא-טראומטי למתוח יתר על המדה (tendinopathy או desmopathy) לגיד מכופף השטחי הדיגיטלי של forelimb ונגעים וכתוצאה מפגם בגיד והפגם מוקף גיד ו / או paratenon שלמים .
הערה: הבדיקה והאבחון לפציעות כגון וההכנה הקלינית של הסוסים להשתלת תאים שפורטו במקום אחר 6,15.
הערה: הבידוד וההרחבה בתרבות של BMMSC נגזר ממח העצם של סוסים כבר פורטו בעבר 6,16. הפרוטוקול הנוכחי להזרקת BMMSC לפציעות SDFT בסוס משתמש 10 מיליון תאים לכל מיליליטר של 4 supernatant עצם אוטולוגית מח (BMS) 16. - להשתמש בתאים שעברו לא יותר מ 4 קטעים להשתלת in vivo, כדי למנוע פנוטיפ פוטנציאל סלולארי או שינויים גנטיים הקשורים למעבר גבוה מספר גאמות.
- לספק את המספר הדרוש של תאים בBMS (בתוך 24 שעות בקופסא צינה ב4-8 מעלות צלסיוס) למרפאת הווטרינרית בי השתלת התאים היא שיש לבצע.
הערה: השימוש הקליני בתאי גזע mesenchymal בsupernatant מח עצם הוא הליך פטנט בבעלות ReCellerate Inc (ארה"ב) והשימוש בו עשוי לדרוש אישור.
הערה: TC-99m הוא פולט גמא (140 אנרגיה של keV) עם זמן מחצית חיים קצרים יחסית (6.0058 שעות, ולכן כמעט 94% ממנו דועך לצורה היציבה של 99 TC ב24 שעות). אנרגיית גמא הופכת אותו מתאימה לזיהוי על ידי מצלמות גמא (מיפוי) ואת תוצאות מחצית החיים קצרות בזמן חשיפה לקרינה מאוד מוגבל לשני הסוסים ואנשי טיפול בבעלי החיים. פרוטוקול זה מתאר את התיוג של תאים באמצעות Tc-99m-HMPAO [כותרת HMPAO עם Tc-99m (כpertechnetate נתרן)] באתר. - להזמין TC-99m הטרי מהספק כזה שהוא מועבר ומשמש לתיוג שנינות תאיםהין 2 שעות של elution מגנרטור Tc-99m. ודא שTC-99m מסופק כ1 GBq ב( חיץ הסטנדרטי של ספק) פתרון 1 מיליליטר.
- להשתמש בכל המאגרים בRT. בצע את הליך התיוג, השתלה של התאים והדמיה (מיפוי גמא) בבלימת חדר איזוטופ עם כל הציוד לנקות עם אלכוהול מגבונים לפני תחילת העבודה.
2. הכנת הסוסים ובדיקת אולטרה סאונד של גיד Forelimb
- סריקות השיא אולטרסאונד בהודאה ראשונה לפציעה (כאשר מח העצם להישאף) ולאחר מכן בנקודת הזמן שבו תאי רדיואקטיבי מוזרקים.
- לבצע בדיקת אולטרה סאונד והשתלת תאים עם נושא את הסוס במשקל באופן שווה בדוכן ותחת עומד הרגעה (ולא הרדמה כללית). לנהל הרגעה באמצעות תערובת של detomidine HCl וtartrate butorphanol, כל אחד ב0.01-0.02 מ"ג IV / קילוגרם.
הערה: השחזור הוא מהיר ולאחר ניתוח טיפול לא דורששיקולים מיוחדים. - לאחר ההרדמה perineural מוחלת (שלב 2.6) באיבר הפגוע, לשמור על הסוס בתחנה תחת הרדמה כדי להפחית תנועה של הסוס במהלך הטיפול. מבחינה ויזואלית לבדוק את הרמה המתאימה של הרגעה להישפט מתפקיד ראש המורכן והתנהגותו של הסוס ושהסוס הוא נוח במהלך הזרקת תא והתנועות של המצלמה גמא במהלך הרכישה של תמונות סינטיגרפיים.
הערה: אין צורך להחיל משחה וטרינר בעיניים (כדי למנוע יובש) כי תחת מהבהב הרגעה אינו מושפע והסוס הוא מסוגל לשמור על לחות של העיניים. הניטור לאחר ההשתלה של התאים אינו פולשני (אולטרסאונד ומיפוי גמא). - קליפ מקרוב את השיער שמעל הגיד (עם קוצץ שיער סוס) ולאחר מכן לנקות את האזור נחתך באמצעות שילוב של שיחים כירורגית chlorhexidine ולבסוף אלכוהול.
- החל ג'ל צימוד אקוסטי לאזור ולסרוק באופן שיטתי כדי להקליט סריקות באזור כף יד כף היד השלם, רמות 1 שכותרת ברצף - 7 17, עם מתמר ליניארי (MHz 12 או דומה) להשיג סידורי רוחבי ותמונות אורך על-שכיחות. אחסן את התמונות דיגיטליים כדי שניתן להשיג שטח החתך ואזור הפגיעה המקסימאלי 4 בעזרת תוכנת ניתוח תמונה.
- הכן את האזור שמעל עצבי כף היד מייד דיסטלי לעצמות שורש כף היד להזרקת ספטית של הרדמה המקומית כדי להבטיח הפחתת רגישות של העור המכסה את הגיד והגיד המכופף הדיגיטלי השטחי מלאה. להזריק 2 מיליליטר של mepivicaine שני תת עורי וסמוך לעצבי כף היד (במיקום תת-fascial) בין הגידים המכופפים והרצועה המתלה מייד דיסטלי לעצמות שורש כף היד בשני הצדדים של האיבר.
- לאחר הסריקה הראשונית שבוצעה להכין את אתר ההשתלה ע"י שפשוף האזור עם ים כירורגית chlorhexidineפתרון crub לפחות 5 דקות ולבסוף אלכוהול עם גזה רטובה. לבצע את כל השלבים הבאים באופנת ספטית.
3. Tc-99m תיוג של תאי גזע הסוסים mesenchymal
הערה: ניתן לבצע צעדי תיוג התא במהלך בדיקת אולטרה סאונד של forelimb כריקבון זה יהיה למזער איזוטופ בין תיוג תא וההשתלה של תאים שכותרתו לגיד.
- הסר את BMS מהתאים כפי שמפריע לספיגה של איזוטופ. כדי לעשות זאת, לאחזר את הבקבוקון של BMMSC (10 מיליון תאים ב 1 מיליליטר של BMS) מתיבת הצינה וגלולת התאים בmicrocentrifuge ב 350 XG במשך 5 דקות על RT. מוציא בזהירות את supernatant עם 18G או מחט 19g (מצורפת מזרק 2 מיליליטר), והשאיר טיפה קטנה (≤0.1 מיליליטר) בצינור כדי לסייע resuspension תא. שמור את supernatant (BMS) בצינור microcentrifuge סטרילי ולשמור על קרח לשימוש חוזר מאוחר יותר.
- Resuspend תאי אגל השייר של supernatant ידי flIcking הצינור בעדינות עם אצבעות (ולא מערבולת) ולהשאיר את הצינור במעמד ב RT. ודא התאים resuspended לחלוטין ושאין גושי תאים גלויים.
- הכן את Tc-99m כדלקמן. מיליליטר ההעברה 1 של טכנציום pertechnetate לתוך בקבוקון של HMPAO באמצעות מזרק 1 מיליליטר ומחט. מערבבים בעדינות אך ביסודיות ולהשאיר למשך 5 דקות מאחורי מיגון העופרת. הערה: ניתן לעשות צעד זה תוך התאים מסתובבים בשלב 2.1.
- להוסיף את כל תערובת Tc-99m-HMPAO באמצעות מזרק 1 מיליליטר ומחט לתאים ומערבבים בעדינות. דגירה של 30 דקות ב RT מאחורי מיגון העופרת.
- לשלבים הבאים, להשתמש במלקחיים (או פיסת נייר טישו) כדי לפתוח את המכסה של צינור microcentrifuge כדי למזער זיהום איזוטופ של האגודל (בכפפות) ולאחר מכן ציוד אחר. השתמש במזרק 2 מיליליטר ו -21 מחט G כדי להוסיף או להסיר חיץ לשטוף.
הערה: השימוש בצג איזוטופ השדה עודד לעקוב אחר זיהום של משטחים וציוד. הוסף 1 מיליליטר PBS לתערובת Tc-99m-HMPAO-התא, לסגור את המכסה, מערבב בעדינות וספין לגלולת התאים כמו בשלב 3.1. - להסיר את PBS בזהירות לצינור חדש (לשמור את זה מאחורי מיגון עופרת ותווית כW1). Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של PBS הטרי. צנטריפוגה הצינור ולהסיר את supernatant כאמור לעיל (לשמור את זה והתווית כW2).
- לחשב את היעילות של תיוג על ידי מדידת הספירה בצינורות W1 וW2 ובתא גלולה. לעשות זאת על ידי הצבת כל צינורות במכשיר כיול מינון איזוטופ ובכן והקלטת הרדיואקטיביות כספירות לדקה (CPM). חשב את יעילות התיוג כ( רדיואקטיביות כCPM של תאים) / (רדיואקטיביות של תאים + supernatant) x 100.
- Resuspend התאים ביסודיות בPBS השייר ולאחר מכן להוסיף את BMS הציל מהשלב 3.1. התאים מוכנים להשתלת intralesional.
4. השתלה של תאי Tc-כותרת 99m-HMPAO
- השתלת intralesionalלגיד בהנחיית אולטרסאונד
- לאט לאט להציג אינץ '1.5 או 2 (50 מ"מ) 20 מחט G לאזור הפגיעה המרבי של הנגע בכיוון אורכי עם מתמר אולטרסאונד, מכוסה בוילון סטרילי, בקו אחד עם המחט, כך שניתן לאורכו של המחט להיות מזוהה ultrasonographically והקצה אם המחט ממוקמת במדויק במרכז הנגע.
- שימוש במיגון מתאים, לאסוף את התאים לתוך מזרק 2 מיליליטר (Luer נעילה, כדי למזער את הסיכון של זיהום חיצוני ובכיסוי מזרק מוגן עופרת) באמצעות מחט 20 G. מחק את נזהרה שלא לאבד את כל נוזל המחט. עכשיו לצרף את המזרק עם התאים שכותרתו על המחט מראש ממוקם בגיד.
- מניחים את הבדיקה אולטרסאונד מתחת למחט כך שמערכת המחט ברקמה נראית בבירור. להזריק את התאים בקצב איטי אך יציב לנגע. ודא שאין התנגדות להזרקה. אם זה נתקל בלמקם בזהירות את המחט בהנחיית אולטרסאונד. בדוק ושלהוציא הנוזל לתוך הנגע גלוי על תמונת אולטרסאונד כנוזל anechoic מכיל בועות אוויר hyperechogenic.
- למשוך את המחט ומייד למקם את הלחץ מעל חור המחט על מנת למנוע אובדן של תאים מוזרקים וכדי למזער את התפשטות איזוטופ על פני השטח החיצוניים של האיבר. מייד להתלבש האיבר עם שכבה אחת של תחבושת autoadhesive. הסוס מוכן למיפוי גמא עכשיו. לבצע באופן מיידי זה.
הערה: לאחר הזרקת התאים לתוך הגיד, לרכוש ספירה של המזרק ומחט הריקים להעריך הפסד ישיר אפשרי של תאים שעלולים להישאר במזרק.
- זלוף האזורי של תאי Tc-כותרת 99m-HMPAO
- בצע את השלב 2.4.
- החל תחבושת חוסם עורקים גומי 100 מ"מ על טפח מכף-ידו הפרוקסימלי עם שתי תחבושת גזה 100 מ"מ גליל כותנה ממוקמת מדיאלית ורוחבית.
- סביבה נקיה מחיידקים להכין העור דואר על הווריד הדיגיטלי כף היד לרוחב ברמה של עצם sesamoid הפרוקסימלי לרוחב על ידי שפשוף האזור עם פתרון לקרצף כירורגית chlorhexidine לפחות 5 דקות ולבסוף עם הגזה טבולה באלכוהול. לבצע את כל השלבים הבאים באופנת ספטית.
- הכן הארכת 100 מ"מ משובץ ¾ 21 G x "(0.8 x 19 מ"מ) מחט פרפר לvenipuncture ידי מילוי עם תמיסת מלח סטרילית heparinized ולאחר מכן להציג את המחט לווריד דיגיטלי כף היד לרוחב. דם ברגע שהוא נכנס באופן חלקי הווריד ימלא את סט הארכה. במחבר מנעול Luer לצרף כובע גומי נעילת Luer להקלת ההזרקה הבאה של תאים שכותרתו.
- לדלל את תאי הגזע ב- 19 מיליליטר של PBS על ידי איסוף התאים במזרק 20 מיליליטר מראש עם PBS. החל התאים באמצעות כוס הגומי באמצעות G 18 (1.2 x 40 מ"מ) מחט מזרק בקצב איטי אך יציב (30 - 40 שניות). רוקן את הקטטר עם 1 מיליליטר של PBS שנטען מראש בsyringדואר.
- הסר את המחט ומייד להפעיל לחץ בעור מעל חור המחט בשכבה של חמש 4 x 4 gauzes כותנה. אז למקם את תחבושת אור עם דבק אלסטיות מעל אזור sesamoid הפרוקסימלי ולהשאיר את חוסם עורקים במקום למשך 30 דקות לאחר הזרקה.
- שחרר את חוסם העורקים לאחר 30 דקות. הסוס מוכן למיפוי גמא עכשיו.
הערה: לאחר הזרקת התאים, לרכוש ספירה של המזרק ומחט הריקים להעריך הפסד ישיר אפשרי של תאים שעלולים להישאר במזרק.
5. גמא Scintigraphy
- תמונות מיפוי
- לרכוש תמונות מיפוי מישוריים עם מצלמה גמא (שנקבעה בשיא הפוטואלקטרי 140 KeV באמצעות 20% חלון סימטרי) מצוידים באנרגיה נמוכה, collimator חור המקבילה.
- השג את כל התמונות לאחר זמן 0 בעומדים סוסים מסוממים כמו בשלב 2.2. לאחר scintigram זמן 0, להחליף את תחבושת האור על si ההשתלהte עם תחבושת מרופדת. הסר תחבושת זה לפני כל בחינת מיפוי.
- לרכוש תמונות סטטיות לכל 60 שניות (מטריצה 256 על ידי 256) באמצעות תוכנת העיבוד עם "לרכוש" - "בחירת מחקר" - אפשרויות "עצם סטטי". זה חיוני כי הסוס לא זז במהלך תקופת רכישת תמונה, כי באפשרות של מצב סטטי אין מודול לתיקון של תנועה.
- להזרקה intralesional, להשיג תמונות לרוחב מאזור הנגע מעצמות שורש כף היד לגפי דיסטלי, האזור שווה הערך של האיבר הנגדי, שדה הריאה השמאלית ובלוטת התריס עזב. במהלך הרכישה של תמונות forelimbs, למקם מסך ראשי בין הרגליים, כדי למנוע הדמיה של האיבר נגדי. לרכוש את התמונות ב 5 דקות לאחר ההזרקה (זמן 0), ולאחר מכן בבית 1, 3, 6, 12, 24, 36 ו -48 שעות.
- לזלוף האזורי, להשיג תמונות גמא רוחב וגב לכ5.1.1.3. להשיג תמונות 5 דקות AFשחרור חוסם עורקים ter. זה יהיה זמן 0. זה יכול להיות שימושי לתמונת האיבר מייד לאחר הזרקת התאים להעריך ספירה לפני חוסם עורקים שחרור. להשיג תמונות גמא בבית 1, 3, 6, 12, 24, 36 ו -48 שעות לאחר מתן של התאים.
- אחרי התמונות נרכשו, תהליך את התמונות באמצעות האפשרות "עיבוד" של התוכנה עם אפשרויות שנבחרו לצבע "סוקולוף" וצבע "הפוך" באופן ידני. הבא בחר את "האזור של עניין" (ROI) ו" אליפסה "כמו זו מאפשרת עיצוב מחדש של מסכת הבחירה ותנועה על פני שטח הנגע. השג את הספירה על ההחזר על ההשקעה על ידי בחירה באפשרות "הוסף לסטטיסטיקה". ודא שאזורים בגודל זהה של העניין (ROI) נרשמים עבור כל חיה בנקודתי הזמן השונות.
- בשלב הבא, לתקן את הסעיפים לריקבון החזוי של טכנציום בכל נקודת זמן. השתמש במשוואה הבאה כדי לתקן את ריקבון:= O דואר - (0.693t / T 1/2), שבו o הוא הפעילות הראשונית של איזוטופ, הוא הריקבון תיקן רדיואקטיביות בזמן אפס, לא הוא הזמן שחלף וT 1/2 הוא המחצית 'החיים של איזוטופ. אז להביע ספירה המתוקנת בכל נקודה כאחוז מההחזר על ההשקעה זמן בזמן 0 להתאמן אחוז התאים שנותרו, תוך שימוש בנוסחא הבאה:
- לרכוש תמונות מיפוי מישוריים עם מצלמה גמא (שנקבעה בשיא הפוטואלקטרי 140 KeV באמצעות 20% חלון סימטרי) מצוידים באנרגיה נמוכה, collimator חור המקבילה.
תאי% הנותרים (t) = 100 - {[(ריקבון ניבא (t) - דעיכה (t)) / חזה ריקבון (t)]} x 100
ריקבון (t) = ROI (t) / החזר על השקעה (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התאגדות TC-99m-HMPAO לBMMSs אינה משפיעה לרעה על יכולתן לעמוד בפלסטיק בתרבית רקמה ובעוד הם מראים יכולת התפשטות כדי ליצור monolayers (איור 1) שיש לנו לא נחוש באופן מלא אם שיעורי התפשטות או פנוטיפים סלולריים אחרים אינם מושפעים. המורפולוגיה שלהם דומה לתאים ללא תווית עם צורת כישור טיפוסית. יעילות התיוג הסלולרית (כלומר., הספיגה של תווית) בדרך כלל נעה בין כ -1.5% ל- 25%. הסיבה העיקרית ליעילות התיוג הנמוכה הייתה קשורה לעיכוב באספקת 99m Tc למרפאת מהאתר שבו מחולל Mo-99 / TC-99m כבר eluted. עיכובים של יותר משעה 2 יביאו לירידה משמעותית בתיוג של התאים. עם זאת, איזוטופ מספיק הוא שולב התאים לבצע מיפוי גמא לעד 36 שעות (איור 2). גורמים שיכולים לשפר את יעילות תיוג מפורטים בדיון.
ss = "jove_content"> יכולים להיות מושתל התאים שכותרתו או על ידי השתלת intralesional 1 (ישירות לתוך הנגע) או על ידי זלוף האזורי באמצעות עורק וריד 1 או דיגיטלי 12. השתלת intralesional אפשרית כאשר הפגיעה היא בליבה של הגיד ומוקף ברקמת גיד שלמה שפועלת ככלי קיבול לתאים. זלוף האזורי הוא דרך קלה יותר לניהול התאים כפי שהם מוזרקים לתוך כלי דם, אך השיטה מסתמכת על הציפייה שMSCs יכול "בית-ב" לנגע הגיד. יש ראיות מוגבלות שMSCs שיטה זו יכולה דווקא בית לאתרים של נגעי גיד אבל מספק גישה ניסויית שימושית לפיתוח יישומים אשר עשוי להגדיל את קיבולת הביות של תאי גזע.
עם מסלול משלוח intralesional, התאים שנראים כמו אזור מוקד של אות שנשארה מקומי יחסית עם כלומר זמן., יש מוגבל שלpread או הגירה של התאים לתוך רקמת הגיד שמסביב. בניגוד לכך, לא תהיה הפחתה הדרגתית של אות עם זמן במקום ההזרקה כאשר תאים מנוהלים על ידי זלוף האזורי דרך הווריד הדיגיטלי כף היד (איור 2). זה נפוץ עם הזרקת intralesional לשדות הריאות להיות שליליים אך במקרים מסוימים בנקודות הזמן מאוד המוקדמות הריאות עשויות להראות אות איזוטופ שיכול להיות מוקד ולאחר מכן הופך יותר כללי (איור 3). בלוטת התריס נשאר שלילי עם מסלול הממשל הזה. זלוף האזורי דומה יכול להראות אות מוקדי בריאות אשר לאחר מכן הופכת מפוזרת יותר, אבל האות היא באופן משמעותי יותר אינטנסיבית בהשוואה לזה שנצפה במסלול intralesional. בלוטת התריס יכול לעתים קרובות גם להראות אות מוקדי.
ספירת הרדיו-איזוטופי הכולל הראשונית של התאים (זמן 0, לפני הזרקה) והספירה מscintigram גמא הראשוני באזור של עניין (זמן 0, לאחר שnjection) מצוין ומשמש לחישוב ירידת אחוז בספירת בכל נקודת זמן. זה משמש כדי להשוות לריקבון החזוי של TC-99m מהספירה הראשונית (איור 4). העקומה מחושבת תעקוב העקומה חזתה. עם זאת, לאחר שלקח את הריקבון חזה בחשבון, ההתמדה של תאים שנותרו באתר ההזרקה לאחר מתן intralesional היא כ -32% (בשעה 12) ו -24% (24 שעות ב) (איור 4).
1. תיוג איור סלולארי, הזרקה וגמא Scintigraphy העברה (א) לBMMSC לmicrofuge לפני התיוג עם Tc-99m-HMPAO מאחורי מגן מרופד עופרת (מסך ובעל מזרק) וצג קרינה וmicrocentrifuge.; (ב) aliquot של תאי שכותרת Tc-99m-HMPAO זורעים במ 'טוב להראות צלחת תרבית רקמהorphology, כדאיות ושגשוג; הזרקה של תאי Tc-99m-HMPAO כותרת בהנחיית אולטרסאונד לאתר פציעה של SDFT forelimb ימין (C); מיפוי גמא של forelimb (ד '). האם המצלמה גמא בדיוק ממוקמת באמצעות זרוע הידראולית יכולת תמרון וכל פוטנציאל שכותרתו תאים באיבר הנגדי בוטלו על ידי מגן עופרת החזיק בין הרגליים. המצלמה גמא ממוקמת באופן דומה בחזה כדי לפקח על תחום הריאות או בצוואר כדי לפקח על תחום בלוטת התריס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Scintigrams אולטראסאונד וגמא של SDFT. Ultrasonographs אופייני של forelimb באזור אמצע כף היד-ב( ז>) סעיף אורך ו( ב) חתך. הנגע בSDFT נראה בבירור כאזור hypoechoic (לכיוון החלק העליון של הסריקה) בהשוואה לשלמות וללא כל הפגע (הרגילה) רקמה של הגיד העמוק הדיגיטלי המכופף (DDFT) הסמוך ולמתחת SDFT. האזור של הנגע ומיקומם היחסי של הגידים מתוארים בסכמטי להלן. scintigraphs גמא בוצע בבית 3, 6 ו 12 שעות לאחר ההזרקה של תאי רדיואקטיבי מוצג לתאים המוזרקים (ג) לנגע או (ד) על ידי זלוף האזורי תוך ורידי דרך וריד כף היד הדיגיטלי. במקרה שמוצג, הייתה ספיגה של תאי רדיואקטיבי באתר הנגע בSDFT (חיצים מוצקים). התמדה של ספיגה על ידי הווריד הדיגיטלי כף היד הוא כונה על ידי החץ המקווקו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
EP-together.within עמודים = "1"> 
איור 3. גמא Scintigrams של הריאות ובלוטת התריס. סריקות אופייניות מנקודות זמן מוקדמות מוצגים עבור שתי הזרקת intralesional וזלוף האזורי של תאים שכותרתו. שים לב למוקדים ואות מפוזרת בשדות ריאות ובלוטת תריס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ריקבון של רדיואקטיביות הקלטות מהאזורים של העניין לאחר הזרקת intralesional. בסוס הזה, ספירה נמדדה מscintigrams גמא של SDFT מעל 36 שעות לאחר הזרקה לתוך הנגע. לוח שמאלי: הרדיואקטיביות בכל נקודת זמן חושב על ערך זמן 0. אזריקבון atural ברדיואקטיביות של 99m Tc מוצג להשוואה. פנל ימני: אחוז המשוער של תאים הנותרים. זה מחושב מרמת הרדיואקטיביות מהאזורים של עניין. במקרה זה האחוז הנותר של תאים ב24 שעות היה כ -24%. יש לנו לבצע פרוטוקול זה (תיוג של MSC וההשתלה) על 21 סוסים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנוסף למח עצם, תאי גזע מבודדים ממקורות כגון רקמת שומן מתאימים לתיוג עם פרוטוקול זה. יתר על כן, תאים ממצב קפוא ניתן לתחייה והרחיבו בתרבות למספרים הרצויים ללימודי תיוג 12.
גורם קריטי הקובע את היעילות של תיוג BMMSC הוא הזמן בין elution של TC-99m מגנרטור מוליבדן בradiopharmacy, הכנת Tc-99m-HMPAO ושימוש בradiopharmaceutical במרפאת. יש יחס הפוך בין יעילות תיוג והזמן לאחר elution Tc-99m מגנרטור כך שעיכובים מעבר לתקופה זו באופן משמעותי יכולים לפגוע ביעילות של תיוג התא. לכן, נדרש תיאום הדוק בין המשלוח של התאים מהמעבדה והמשלוח של TC-99m למרפאת ביום שהתאים יהיו רדיואקטיבי ומושתל. זמן ההובלה לcliniג לכן גורם חשוב. גיליון נתונים של הספק לציין כי הדעיכה של TC-99m מפחיתה את טוהר של radiochemical לאחר ההודעה elution-2 שעות שיכולים להפריע את הכריכה של HMPAO לTC-99m ולאחר מכן הסכום של Tc-99m-HMPAO נלקח על ידי התאים. יש לנו גם ציינו כי תיוג של תאים בתרבית בסביבת מעבדה נתן תיוג יעיל יותר מאשר במרפאת. זה גם דווח על ידי מחקר אחר בסוסים 5 שבו התאים תויגו בסביבת מעבדה. בנוסף, בניסיון שלנו, התווית הוא נלקחה בצורה יעילה יותר על ידי תאים שמסומנים מייד לאחר הכנת דגימות דם או רקמות בהשוואה לתאים שהוכנו מהתרבות. עם זאת, אפילו עם יעילות נמוכה של תיוג יש תווית מספיק מחויבת לתאים לבצע מיפוי מעל 36 שעות.
יעילות תיוג של 40% - 80% יכולה להיות מושגת על leucocytes אם TC-99m משמש מטרי גנרטור eluate בתוך 30 דקות והתגובה ביצעה בנפח קטן (1 - 0.5 מיליליטר) 18. יעילות תיוג של 47% - 71% הושגה לMSCs סוסי 19 מדגים כי ניתן להגדיל את יעילות התיוג של תאי גזע בתנאים אידיאליים.
אנו להשתיל באופן שגרתי 20 מיליון תאים לטיפול בנגעי ליבת SDFT למרות עד 40 מיליון תאים הושתלו לנגעים הגדולים ביותר. מספר דומה של תאים יכול להיות מושתל באמצעות זלוף האזורי למרות ששיטה זו אינה נפוצה בשל ההליך המורכב יותר. עם זאת, זה עשוי להיות שימושי עבור נגעים שמשתרעים לפריפריה של משטח הגיד בציפייה שמספיק תאי הבית לנגע. מעקב של התאים על ידי מיפוי גמא יכול לספק מידע שימושי על התנועה של תאים המנוהלים על ידי מסלולים שונים. בפרוטוקול זה, התאים המושתלים על ידי מסלול intralesional הם mostly נשמרים באתר ההזרקה במסלול intralesional. אות רדיו-איזוטופי אפשר לראות בשדות הריאות במקרים מסוימים, אך הוא מופיע באופן כללי שיש הגירה קטנה של תאים ממקום הנגע. משלוח BMMSC ידי זלוף האזורי עולה כי ייתכן שיש שימור של תאים באתר הפציעה, אבל כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידית 4 שלא נצפה ביות של התאים. תווית Tc-99m-HMPAO אינה משפיעה על יכולת נדידת תאים 20 ו, כTC-99m-HMPAO מופנם על ידי התאים ונשמר בציטופלסמה, אין זה סביר להתערב עם תכונות הידבקות.
החישוב של אות מאזורים של עניין עשוי להיות אומדן חסר כפי שייתכן שייתכן שיש ניתוק משמעותי של התווית מהתאים (שוחררה מהתאים מתים או מנגנונים אחרים של שחרור מתאי חיים). בלוטת התריס לוכדת איזוטופ החופשי (TC-99m) שוחרר מהתאים מתים או גוססים, וTc-99m-HMPAO ניתן למנוע על ידי הכליות ומעיים. רקמות אלה יכולים להיות במעקב על ידי מיפוי גמא להעריך אובדן פוטנציאלי של תווית.
הליך תיוג התא יכול להיות מותאם לבדיקת שימור תא וספיגה באתרים שונים (איברים ופציעה) באמצעות נתיבי אספקה שונים. טבע המוקד של האות בריאות עלול להוות אינדיקציה לאגרגטים תא אשר ככל הנראה להיפרד זמן או להיכנס תמוגה תא. בלוטת התריס, אשר לוכד איזוטופ החופשי, ככל הנראה מצביעה על עלייה בספיגה הבאה זלוף האזורי כי יש לי התאים המוזרקים וכתוצאה מפסולת מהתאים מתים מסלול נגיש יותר לבלוטת התריס באמצעות מחזור הדם. למרות שרק כ -24% מתאים נשארים אחרי 24 שעות, מסלול intralesional לגיד הוא הדרך היעילה ביותר כמסירה רוב המקרים לא הראו Tc-99m חופשי בבלוטת התריס. מידע שנצבר מניצול פרוטוקולים כאלה יכול להודיע עיצוב ופיתוח עתידיים של יישומי תאי גזע למומחדש טיפולים קליניים יעילים.
פרוטוקול תיוג התא הותאם לשימוש בסוס מתיוג Tc-99m-HMPAO של leucocytes ביישומים רפואיים אנושיים. השימוש בו בפרוטוקול זה מדגים תחולה בבעלי חיים גדולים שבו מחלה הגיד מתרחשת באופן ספונטני לחקירות של טיפולים מבוססי תאים. הגיוס של מקרים קליניים יכול לעזור כדי לקזז את העלויות גבוהות יותר הקשורים בעבודה עם בעלי חיים גדולים יותר. הליך התיוג לשימוש כשיטת הדמיה תואר במודלים של בעלי חיים קטנים 21 ואנו מאמינים כי הפרוטוקול יכול להיות מנוצל באופן דומה בבעלי חיים גדולים יותר כגון כבשים לחקירות של מחלות גיד אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
