Abstract
Nyligen gjorda framsteg inom tillämpningen av benmärgs mesenkymala stamceller (BMMSC) för behandling av sen- och ligamentskador i hästen föreslår förbättrad effektmått i både experimentella och kliniska studier. Även om BMMSC implanteras i senan skada i ett stort antal (normalt 10 - 20 miljoner celler), bara ett relativt litet antal överleva (<10%), även om dessa kan kvarstå i upp till 5 månader efter implantation. Detta verkar vara en vanlig observation i andra arter där BMMSC har implanterats in i andra vävnader, och det är viktigt att förstå när denna förlust inträffar, hur många överlever den inledande implantationsprocessen och om cellerna rensas in i andra organ. Spårning ödet av cellerna kan åstadkommas genom radiomärkning av BMMSC före implantering vilket tillåter icke-invasiv in vivo-avbildning av cellposition och kvantifiering av cellantal.
Detta protokoll beskriver en cell labeling procedur som använder Teknetium-99m (Tc-99m), och spårning av dessa celler efter implantation i skadade flexorsenor hos hästar. Tc-99m är en kortvarig (t 1/2 av 6.01 tim) isotop som avger gammastrålning och kan internaliseras av celler i närvaro av den lipofila föreningen hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO). Dessa egenskaper gör den idealisk för användning i kliniker nukleärmedicinska för diagnos av många olika sjukdomar. Ödet för de märkta cellerna kan följas på kort sikt (upp till 36 h) genom gammascintigrafi att kvantifiera både antalet celler kvarhållna i lesionen och distributionen av cellerna i lungorna, sköldkörtel och andra organ. Denna teknik är anpassad från märkning av blodleukocyter och skulle kunna användas för att avbilda implanterat BMMSC i andra organ.
Introduction
Regenerativa strategier för reparation av sjuka eller skadade vävnader är baserade på multipotenta stamceller erhållna från en mängd olika vävnader och implanterades i det drabbade området. Nya framsteg i tillämpningen av autologa BMMSC för behandling av sen- och ligamentskador i hästen har visat förbättrade resultatmått i både experimentell 1-5 och kliniska studier 6. Hästen är en särskilt attraktiv modell för att bedöma effekten av stamcellsrelaterade behandlingar, eftersom det lider av ålder och överansträngning relaterade skador på senor i distala forelimb, är det en atletisk djur, och det är en stor, underlätta benmärgs återhämtning och korrekt implantation. Senskador läka naturligt med fibros men läkt senan är funktionellt sämre 7 och har en hög risk för re-skada 8. Den ytliga digitala flexor senan (SDFT) är oftast påverkas eftersom det har utvecklats för att fungera som en elastisk energilagra och erfarenheter hög belastning betonar att åstadkomma energieffektiv och hög hastighet förflyttning. Återställa funktion efter skada är därför avgörande. Dessa skador liknar de som påverkar hälsenan hos människor och som ger en liknande funktion 9. Det finns inga bra behandlingsalternativ för att behandla eller uppnå gott skick för sådana skador, därför cellbaserade regenerativa strategier erbjuder en attraktiv möjlighet att förbättra resultaten och minska åter skada.
I de flesta studier fem - 20 miljoner autolog BMMSC injiceras direkt in i lesionen som vanligtvis uppträder i kärnan av senan organ som således fungerar som en behållare för cellerna. Ödet för cellerna en gång injicerats är inte klart och olika cellmärkningsmetoder för att spåra celler har beskrivits nyligen. Celler märkta med en fluorescens tag visade sig överleva endast i relativt små mängder (<10%) 10,11. Fluorescens etiketter nödvändiggörvävnads utvinning och sektionering för histologisk analys som är tidskrävande och inte underlättar lätt temporal analys i en stor djurmodell eller i kliniska fall. I senare arbete har vi använt radioisotopen 99mTc att märka celler och följa deras öde genom gammascintigrafi 1. Denna metod gör det möjligt för snabba jämförelser mellan olika vägar cell leverans, inklusive intralesional, intravenösa via halsvenen 1 eller regional perfusion via intra-arteriella 12 eller intravenösa 1,12 injektioner. Persistens och distribution av celler kan sedan avbildas av gammascintigrafi av olika organ. Detta har visat att endast 24% av cellerna injicerade intralesionalt kvar i skadan med 24 tim 1 och detta stöds av en annan studie med experimentellt skapade skador och använda samma radiomärkning 5. Dessutom cellerna visar begränsad förmåga att hem till senor skador när delivered genom regional perfusion eller intravenöst men sprids i lungorna av de sistnämnda linjerna 4.
BMMSC märkta med järn nanopartiklar är en alternativ metod för att spåra celler implanterade i forelimb senor 13. Även om järn nanopartiklar märkta celler tillåter spårning cell in vivo genom MRI, är temporala studier i ett stort djur begränsas av antalet gånger anestesi kan administreras vid varje tidpunkt för att utföra de MR-undersökningar. Vidare järn nanopartiklar är hypointense på MR som begränsar informationen på migrationen av märkta celler in i senan kroppen. Andra radioisotoper som kan användas innefattar indium-111, men detta lider av nackdelen av en längre halveringstid än Tc-99m (2,8 dagar vs 6,0 h) och högre gammastråleenergiemission. Dessutom har cellviabilitet rapporterats att minska när de är märkta med indium-111 14. Tc-99m, å andra sidan, används rutinmässigt i både häst och human nukleärmedicin att märka perifera mononukleära blodkroppar och följa deras fördelning in vivo genom scintigrafi. Det kan vara relativt lätt tas upp av celler med användning av HMPAO som en kopplingsmolekyl för att binda teknetium, såsom Tc-99m-HMPAO, till celler. Tc-99m-HMPAO märkt BMMSC visa god lönsamhet och kan föröka sig in vitro 4. Detta protokoll detaljer märkning och spårning av häst autolog BMMSC implanteras i naturligt förekommande lesioner i forelimb SDFT.
Det är viktigt att notera att protokollet är endast avsett att användas som ett forskningsverktyg. Dess användning som en klinisk terapeutisk modalitet rekommenderas inte eftersom effekten av radiomärkningen på cellulära fenotypen är inte helt klarlagd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De fall som beskrivs häri utfördes efter etiska tillstånd från djuretik och välfärd kommitté Colegio de Veterinarios de Málaga, Spanien, och Royal Veterinary College, North Mymms, UK De metoder som används på hästarna är baserade på godkända protokoll som är används kliniskt på hästar som får stamcellsbaserade terapier som inkluderar sedering, benmärg aspiration, intra-tendinöst injektion, regional perfusion, intravenös injektion, efter procedur behandling och smärtlindring och uppföljning efter implantation.
1. Viktiga arrangemang som skall göras i förväg
- Söka institutionella etik och djurskydd godkännande och följa lokal lagstiftning innan arbetet påbörjas.
- Söka institutionella godkännande att arbeta med joniserande strålning som dikteras av lokala och juridiska föreskrifter, inbegripet lämplig nivå av skydd för personal och miljö och hantering av CONTAMneras avfall.
- Använd kriterierna efter integration: hästar närvarande med en icke-traumatisk överansträngning skada (tendinopati eller desmopathy) till den ytliga flexor digitala senan av forelimb och skador som resulterar i en defekt i senan och felet är omgiven av intakt senor och / eller paratenon .
Obs: undersökning och diagnos för sådana skador och den kliniska framställningen av hästar för cellimplantation har i detalj någon annanstans 6,15.
Obs: Isolering och expansion i kultur BMMSC härrör från benmärgen av hästar har i detalj tidigare 6,16. Den nuvarande protokollet för att injicera BMMSC för SDFT skador på hästen använder 10 miljoner celler per ml 4 av autolog benmärgs supernatant (BMS) 16. - Använd celler som har genomgått mer än 4 passager för in vivo implantation för att undvika potentiell cellulär fenotyp eller genetiska förändringar förknippas med hög passagenummer calnar.
- Leverera erforderligt antal celler i BMS (inom 24 timmar i ett arktiskt rutan 4-8 ° C) till veterinärklinik där cellimplantation skall utföras.
Obs: Den kliniska användningen av mesenkymala stamceller i benmärgen vätskan är en patenterad procedur som ägs av ReCellerate Inc (USA) och dess användning kan kräva tillstånd.
Obs: Tc-99m är en gammastrålare (140 keV) med en relativt kort halveringstid (6,0058 h, alltså nästan 94% av det sönderfaller till sin stabila form av 99 Tc i 24 timmar). Gamma energi gör den lämplig för detektion av gammakameror (scintigrafi) och de korta halveringstid resulterar i mycket begränsad tid strålningsexponering för både hästen och djurhantering personal. Detta protokoll beskriver märkning på plats av celler med användning av Tc-99m-HMPAO [HMPAO märkt med Tc-99m (som natriumperteknetat)]. - Beställa Tc-99m färskt från leverantören, så att den levereras och används för märkning av celler within 2 h av eluering från Tc-99m-generator. Kontrollera att Tc-99m levereras som en GBq i en 1 ml lösning (leverantörens standardbuffert).
- Använd alla buffertar vid RT. Utför proceduren märkning, implantation av cellerna och bildbehandling (gammascintigrafi) i en isotop inneslutning rum med all utrustning rengöras med alkohol våtservetter före starten av arbetet.
2. Beredning av hästen och Ultraljud i Forelimb Tendon
- Spela ultraljudsundersökning vid första entré för skada (när benmärgen sugs) och sedan vid tidpunkten då radiomärkta celler injiceras.
- Utför ultraljud och cellimplantation med hästen bär vikt jämnt i ett stall och under stående sedering (snarare än narkos). Administrera sedering med en blandning av detomidin HCI och butorfanoltartrat, vardera med 0,01-0,02 mg / kg IV.
Obs: Recovery är snabb och postoperativ behandling kräver ingensärskilda överväganden. - Efter perineural anestesi appliceras (steg 2,6) i den drabbade extremiteten, hålla hästen vid stationen under sedering för att minska Förflyttningen av hästen under behandlingen. Kontrollera visuellt lämplig nivå av sedering bedöms från sänkt huvudets position och uppförande av hästen och att hästen är bekväm under cellinjektion och rörelser gammakameran under förvärvet av scintigrafiska bilder.
Obs: Det är inte nödvändigt att tillämpa veterinär salva på ögon (för att förhindra torrhet) eftersom under sedering blinkande påverkas inte och hästen kan upprätthålla hydrering i ögonen. Övervakningen efter implantationen av cellerna är icke-invasiv (ultraljud och gammascintigrafi). - Clip noga håret ligger över senan (med häst hårklippningsmaskiner) Rengör sedan klippt området med hjälp av en kombination av en klorhexidin kirurgisk scrub och slutligen alkohol.
- Applicera akustisk koppling gel till området ochskanna metodiskt för att spela skanningar av hela palmar metakarpalregionen, sekventiellt märkta nivå 1 - 7 17, med en linjär givare (12 MHz eller liknande) för att erhålla serienummer på förekomst tvärgående och längsgående bilder. Lagra bilder digitalt så att tvärsektionsarean och den maximala skadezonen 4 kan erhållas med hjälp av bildanalysmjukvara.
- Förbered området som ligger ovanpå de palmar nerver omedelbart distala vid framknä för aseptisk injektion av lokalbedövning för att säkerställa fullständig desensibilisering av huden som ligger över senan och senan flexor digitorum superficialis. Injicera 2 ml mepivicaine både subkutant och intill de palmar nerver (i deras under fascian plats) mellan flexorsenor och uppskjutande ligament omedelbart distalt vid framknä på båda sidor av lemmen.
- När den preliminära skanningen har utförts förbereda implantationsstället genom skrubbning området med klorhexidin kirurgiska scrub lösning under minst 5 min och slutligen alkohol med indränkt gasbinda. Utför alla efterföljande steg i en aseptisk sätt.
3. Tc-99m-märkning av Equine mesenkymala stamceller
Obs: Stegen cell märkning kan utföras under ultraljudsundersökning av forelimb eftersom detta kommer att minimera isotop förfall mellan cellmärkning och implantation av märkta celler i senan.
- Ta BMS från cellerna som det stör upptaget av isotopen. För att göra detta, hämta flaskan med BMMSC (10 miljoner celler i 1 ml av BMS) från kylkroppen rutan och pelletera cellerna i en mikrocentrifug vid 350 xg under 5 min vid RT. Försiktigt bort supernatanten med en 18G eller 19G nål (fäst vid en 2 ml spruta), vilket ger en liten droppe (≤0.1 ml) i röret för att underlätta cell resuspension. Spara supernatanten (BMS) i ett sterilt mikrocentrifugrör och hålla på is för senare återanvändning.
- Resuspendera cellerna i den återstående droppen av supernatanten genom flIcking röret försiktigt med fingrarna (snarare än virvel) och lämna röret i ett ställ vid RT. Säkerställa att cellerna är helt återsuspenderas och att det inte finns några synliga cellklumpar.
- Förbered Tc-99m enligt följande. Överför 1 ml av teknetium perteknetat i en injektionsflaska med HMPAO användning av en 1 ml spruta och kanyl. Blanda försiktigt men grundligt och låt stå i 5 minuter bakom bly avskärmning. Obs: Detta steg kan göras medan cellerna snurrar i steg 2.1.
- Lägg till alla av Tc-99m-HMPAO blandningen med användning av en 1 ml spruta och kanyl till cellerna och blanda försiktigt. Inkubera under 30 min vid RT bakom avskärmning av bly.
- För nästa steg, använd en pincett (eller en bit av mjukpapper) för att öppna locket på mikrocentrifugrör att minimera isotop förorening av (handske) tumme och därefter annan utrustning. Använd en 2 ml spruta och 21 G nål för att lägga till eller ta bort tvättbuffert.
Obs: Användningen av en fältisotop monitor uppmuntras att övervaka kontaminering av ytor och utrustning. Tillsätt 1 ml PBS till Tc-99m-HMPAO-cellblandningen, stäng locket, blanda försiktigt och snurra för att pelletera cellerna som i steg 3.1. - Försiktigt bort PBS till ett nytt rör (spara detta bakom blyskydd och etikett som W1). Resuspendera cellpelleten i 1 ml färsk PBS. Centrifugera röret och avlägsna supernatanten som ovan (spara denna och etikett som W2).
- Beräkna effektivitet märkningen genom att mäta räkningarna i W1 och W2 rör och i cellpelleten. Gör detta genom att placera varje rör i en brunn isotop doskalibrator instrumentet och registrering av radioaktiviteten som räkningar per minut (CPM). Beräkna märkningseffektiviteten som (Radioaktivitet som CPM av celler) / (Radioaktivitet i celler + supernatant) x 100.
- Resuspendera cellerna ordentligt i rest PBS och lägg sedan till BMS räddas från steg 3.1. Cellerna är redo för intralesional implantation.
4. Implantation av Tc-99m-HMPAO-märkta celler
- Intralesional implanteringi senan i ultraljud
- Långsamt införa en 1,5 eller 2 tum (50 mm) 20 G nål i den maximala skadezonen av lesionen i en längsgående orientering med ultraljudsomvandlaren, som omfattas av en steril duk, i linje med nålen så att längden av nålen kan identifieras ultrasonographically och spetsen om nålen är exakt beläget i centrum av lesionen.
- Med hjälp av lämplig avskärmning, samla upp cellerna i en 2 ml spruta (Luer-lås, för att minimera risken för extern kontaminering och en bly-avskärmad spruta cover) med en 20 G nål. Kassera nålen försiktigt så att inte förlora någon vätska. Nu fästa sprutan med de märkta celler på nålen i förväg placerad i senan.
- Placera ultraljudssonden under nålen så att nålen tarmkanalen i vävnaden syns tydligt. Injicera cellerna vid en långsam men stadig takt in i lesionen. Se till att det inte finns något motstånd mot injektion. Om detta påträffasförsiktigt flytta nålen under ultraljud. Kontrollera att vätskeutstötnings in i lesionen är synlig på ultraljudsbilden som ekofri vätska innehållande hyperechogenic luftbubblor.
- Dra ut nålen och placera omedelbart tryck över nålen hålet för att förhindra förlust av injicerade celler och för att minimera spridningen av isotopen över den yttre ytan av lemmen. Omedelbart klä lem med ett skikt av autoadhesiva bandage. Hästen är nu klar för gammascintigrafi. Utför detta omedelbart.
Obs: Efter injektion av cellerna i senan, få en räkning av den tomma sprutan och nål för att bedöma eventuell direkt förlust av celler som kan finnas kvar i sprutan.
- Regional perfusion av Tc-99m-HMPAO-märkta celler
- Följ steg 2.4.
- Applicera en 100 mm gummi tourniquet bandage på den proximala händerna med två 100 mm bomull rulle gasbinda placeras medialt och lateralt.
- Aseptiskt förbereda the huden över den laterala palmar digitala ven vid nivån hos den laterala proximala sesamben genom skrubb området med en klorhexidin kirurgisk skrubblösning under minst 5 minuter och slutligen med gasväv indränkt i alkohol. Utför alla efterföljande steg i en aseptisk sätt.
- Förbered en 100 mm förlängningssetet med en 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) fjärilsnål för venpunktion genom att fylla med hepariniserad steril koksaltlösning och sedan införa nålen i den laterala palmar digital ven. När venen införs blod kommer delvis fylla förlängningssetet. Vid Luer lås kopplingen fästa en Luer-lås gummilock för att underlätta efterföljande injektion av märkta celler.
- Späd MSCs i 19 ml PBS genom att samla cellerna i en 20 ml spruta förladdad med PBS. Applicera cellerna via gummikopp med användning av en 18 G (1,2 x 40 mm) injektionsnål i långsam men stadig takt (30 - 40 sek). Spola katetern med 1 ml PBS förladdade i ett Syringe.
- Ta bort nålen och omedelbart sätta press på huden över nålen hålet med ett skikt av fem 4 x 4 bomull gasväv. Placera sedan en lätt bandage med elastiskt bindemedel över den proximala sesamoid området och lämna stasen på plats i 30 minuter efter injektion.
- Släpp tryckförband efter 30 minuter. Hästen är nu klar för gammascintigrafi.
Obs: När du har injicerat cellerna få en räkning av den tomma sprutan och nål för att bedöma eventuell direkt förlust av celler som kan finnas kvar i sprutan.
5. gammascintigrafi
- Scintigrafiska bilder
- Förvärva planar scintigrafi bilder med en gammakamera (inställd på 140 keV fotoelektriska topp med hjälp av en 20% symmetrisk fönster) utrustad med en låg energi, parallellt hål kollimator.
- Skaffa alla bilder efter tid 0 på stående hästar sederade som i steg 2.2. Efter tiden 0 scintigram, byta ljus bandage över implantation site med en vadderad bandage. Ta bort denna bandage före varje scintigrafi examen.
- Förvärva statiska bilder under 60 sekunder vardera (256 av 256 matris) med behandlings programvaran med "förvärva" - "studie val" - "bone statiska" alternativ. Det är viktigt att hästen inte rör sig under bildtagning perioden eftersom statiskt läge alternativet inte har en modul för korrigering av rörelse.
- För intralesional injektion, få sido bilder från skadeområdet från framknä till den bortre änden, motsvarande område i kontra lem, vänster lunga fältet och den vänstra sköldkörteln. Under förvärv av framben bilder, placera en ledande skärm mellan benen för att undvika avbildning av lemmen kontra. Förvärva bilder vid 5 min efter injektion (tid 0), och sedan vid 1, 3, 6, 12, 24, 36 och 48 timmar.
- För regional perfusion, få laterala och dorsala bilder gamma som för 5.1.1.3. Få bilder 5 min after tourniquet release. Detta kommer att vara tiden 0. Det kan vara bra att avbilda benet omedelbart efter injektion av cellerna för att bedöma räknas före Tourniquet release. Erhåll gamma bilder med en, tre, sex, tolv, 24, 36 och 48 h efter administrering av cellerna.
- Efter har förvärvats bilderna process bilderna manuellt med hjälp av "behandling" alternativet av programvaran med alternativ som valts för "Sokoloff" färg och "Invertera" färg. Därefter väljer du "regionen av intresse" (ROI) och "ellipsen" eftersom det tillåter omformning av urvalsmasken och rörelse över skadade området. Skaffa räknas över ROI genom att välja "lägg till statistiken" alternativet. Se till att identiskt dimensionerade områden av intresse (ROI) registreras för varje djur vid olika tidpunkter.
- Nästa, korrigera räknas för den förutsagda sönderfallet av teknetium vid varje tidpunkt. Använd följande ekvation för att korrigera för förfall:A = Ao e - (0.693t / T 1/2), där A o är den initiala aktiviteten av isotopen, A är sönderfall korrigerat radioaktivitet vid tiden noll, t är den förflutna tiden och T 1/2 är det halv -Life av isotopen. Uttrycka sedan de korrigerade räknas vid varje tidpunkt som en procentandel av ROI vid tidpunkten 0 att räkna ut procentandelen celler som återstår, med hjälp av följande formel:
- Förvärva planar scintigrafi bilder med en gammakamera (inställd på 140 keV fotoelektriska topp med hjälp av en 20% symmetrisk fönster) utrustad med en låg energi, parallellt hål kollimator.
% celler som återstår (t) = 100 - {[(förutsagd sönderfall (t) - sönderfall (t)) / predikterade sönderfall (t)]} x 100
sönderfall (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tc-99m-HMPAO inkorporering i BMMSs inte påverkar deras förmåga att hålla sig till vävnadsodlingsplast och medan de visar spridning förmåga att bilda monolager (Figur 1) Vi har inte helt fastställt om spridningstakten eller någon annan cellulära fenotyper påverkas. Deras morfologi liknar omärkta celler med en typisk spindelform. Den cellulära märkningseffektiviteten (dvs.., Upptag av märkning) varierar typiskt från cirka 1,5% till 25%. Den främsta orsaken till den låga effektiviteten märknings var relaterad till den försenade leveransen av 99mTc till kliniken från den plats där Mo-99 / Tc-99m generator har eluerats. Förseningar på mer än 2 timmar att resultera i en betydande nedgång i märkning av cellerna. Emellertid är tillräcklig isotop inkorporerad i cellerna för att utföra gammascintigrafi under upp till 36 h (figur 2). Faktorer som kan förbättra effektiviteten märkning beskrivs i diskussionen.
1 (direkt till skadan) eller genom regional perfusion via en digital ven en eller artär 12. Intralesional implantering är möjlig när skadan är i kärnan av senan och omgiven av intakt senvävnad som fungerar som en behållare för cellerna. Regional perfusion är en lättare väg att administrera cellerna när de injiceras i ett blodkärl men metoden bygger på förväntningar om att MSC kan "home-in" till senan skadan. Det finns begränsad evidens för att MSC kan särskilt hem till områden av senor skador men denna metod ger en användbar experimentell metod för att utveckla tillämpningar som kan öka målsökande förmåga MSC.
Med intralesional utdelningsrutten, kommer cellerna ses som ett fokusområde för signal som förblir relativt lokaliserade med tiden dvs., Det finns begränsade spread eller migrering av cellerna in i den omgivande senvävnaden. Däremot kommer det att finnas en gradvis minskning av signalen med tiden vid injektionsstället när cellerna administreras av regional perfusion via digitala palmar ven (Figur 2). Det är vanligt med intralesional injektion för lung fälten för att vara negativ, men i vissa fall på de mycket tidiga tidpunkter lungan kan visa isotopsignal som kan vara fokus och sedan blir mer generaliserat (Figur 3). Sköldkörteln är fortfarande negativa med detta administreringssätt. Regional perfusion liknande kan visa bränn signal i lungorna som sedan blir mer diffus men signalen är betydligt mer intensiv än den som observerades med intralesional väg. Sköldkörteln kan ofta också visa fokal signalen.
Den initiala totala radioisotopräkning av cellerna (tid 0, för-injektion) och räkningarna från den ursprungliga gamma scintigram vid området av intresse (tid 0, post-injection) noteras och används för att beräkna den procentuella minskningen i räknevärden vid varje tidpunkt. Detta används för att jämföra den förutspådda sönderfall av Tc-99m från de initiala pulser (figur 4). Den beräknade kurvan kommer att följa den förutsagda kurvan. Men efter att ha tagit den förutsagda förfall hänsyn är ihållande celler kvar i injektionsstället efter intralesional administrering ca 32% (vid 12 h) och 24% (vid 24 h) (Figur 4).
Figur 1. Cell Märkning, direktinsprutning och gammascintigrafi (A) Överföring av BMMSC i en mikro före märkning med Tc-99m-HMPAO bakom bly-fodrade avskärmning (skärm och spruthållare) och strålnings övervaka och mikro. (B) En alikvot av Tc-99m-HMPAO märkta celler ympades i en vävnadsodlingsskål visar god morphology, viabilitet och proliferation; (C) Injektion av Tc-99m-HMPAO märkta cellerna under ultraljud i skadestället av den högra frambenet SDFT; (D) gammascintigrafi av forelimb. Gammakameran är positionerad exakt med hjälp av en lättmanövrerad hydraulisk arm och eventuella märkta celler i kontralaterala elimineras genom en blyskärm hålls mellan benen. Gammakameran är på liknande sätt placerad vid bröstet för att övervaka lungfältet eller på halsen för att övervaka sköldkörtelfältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Ultraljud och Gamma scintigram av SDFT. Typiska ultrasonographs av forelimb vid mitt metakarpalregionen i (A (B) tvärsnitt. Lesionen i SDFT syns tydligt som ett hypoechoic område (mot toppen av avsökningen) jämfört med den oskadade (normalt) vävnadsintegritet av djup senan flexor digitorum (DDFT) intill och under SDFT. Det område av lesionen och de relativa lägena för senor avbildas i schemat nedan. Gamma scintigraphs utfördes vid 3, 6 och 12 h efter injektion av radioaktivt märkta celler visas för cellerna injicerade (C) in i lesionen eller (D) genom intravenös regional perfusion via den digitala palmar ven. I det visade fallet, fanns det upptag av radioaktivt märkta celler i skadestället i SDFT (fyllda pilar). Bestående upptag av palmar digital venen betecknas med den streckade pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Gamma scintigram av Lung och sköldkörtel. Typiska skanningar från tidiga tidpunkter visas för både intralesional injektion och regional perfusion av märkta celler. Notera fokal och diffus signal i lungan och sköldkörtel fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Decay av radioaktivitet Inspelad från Region sevärdheter efter Intralesional Injection. I denna häst, har räkningar mätt från gamma scintigram av SDFT över 36 timmar efter injektion i skadan. Vänstra panelen: radioaktiviteten vid varje tidpunkt beräknades mot tiden 0 värdet. Sedanatural sönderfall i radioaktivitet av 99mTc visas för jämförelse. Höger panel: den uppskattade procentandelen celler som återstår. Detta beräknas från radioaktivitetsnivå från regionerna av intresse. I detta fall de återstående procenten av celler vid 24 h var ca 24%. Vi har utfört detta protokoll (märkning av MSC och implantation) på 21 hästar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förutom benmärg stamceller som isolerats från källor såsom fettväv är lämpliga för märkning med detta protokoll. Dessutom kan celler från ett fryst tillstånd återupplivas och expanderas i odling till de önskade nummer för märkning studier 12.
En kritisk faktor som bestämmer effektiviteten av märkning av BMMSC är tiden mellan elueringen av Tc-99m från molybdengenerator vid radiopharmacy, framställning av Tc-99m-HMPAO och användning av radiofarmakonet i kliniken. Det finns ett omvänt förhållande mellan märkning och tid efter Tc-99m eluering från generatorn så att förseningar bortom denna period avsevärt kan försämra effektiviteten i cellmärkning. Därför är nära samordning som krävs mellan leveransen av cellerna från laboratoriet och leverans av Tc-99m till kliniken på dagen att cellerna kommer att vara radioaktivt och implanteras. Den transporttiden till Clinic är därför en viktig faktor. Leverantörens datablad anger att sönderfallet av Tc-99m reducerar renheten hos den radiokemiska efter 2 h efter eluering, som kan interferera med bindningen av HMPAO till Tc-99m och därefter mängden av Tc-99m-HMPAO taken upp av cellerna. Vi har också noterat att märkning av odlade celler i laboratoriemiljö gav effektivare märkning än på kliniken. Detta har också rapporterats av en annan studie på hästar 5 där cellerna märktes i en laboratoriemiljö. Dessutom, enligt vår erfarenhet, är etikett upptages mer effektivt av celler som är märkta omedelbart efter beredning från blod eller vävnadsprover jämfört med celler framställda från kulturen. Men även med låga effektiviteten i märkningen är tillräcklig märkning bunden till cellerna för att utföra scintigrafi över 36 h.
Märkning effektiviteter av 40% - 80% kan uppnås för leukocyter om Tc-99m används från enfärsk generator eluatet inom 30 minuter och reaktionen utfördes i en liten volym (1 - 0,5 ml) 18. Märkning effektiviteter av 47% - 71% har uppnåtts för equine MSC 19 som visar att det är möjligt att öka effektiviteten i MSC: er märkning under idealiska förhållanden.
Vi implantera rutinmässigt 20 miljoner celler för behandling av SDFT kärn lesioner även om upp till 40 miljoner celler har implanterats för de största skadorna. Ett liknande antal celler kunde implanteras via regionala perfusionen även om denna metod inte används vanligen på grund av den mer komplicerat förfarande. Emellertid kan det vara användbart för lesioner, vilka sträcker sig till periferin av senan ytan med förväntningen att tillräckligt många celler hem in i lesionen. Spårning av cellerna genom gammascintigrafi kan ge värdefull information om förflyttning av celler som administreras via olika vägar. I detta protokoll cellerna implanteras av intralesional väg är mostly kvar på injektionsstället genom intralesional väg. Radioisotop signal kan observeras i lungfälten i vissa fall men det verkar i allmänhet att det finns liten migration av celler från skadestället. Leverans av BMMSC genom regional perfusion antyder att det kan finnas retention av celler vid skadestället, men när de levereras genom intravenös injektion 4 har vi inte observerat målsökande av cellerna. Tc-99m-HMPAO etikett påverkar inte celler migrationsförmåga 20 och, såsom Tc-99m-HMPAO internaliseras av cellerna och kvarhållas i cytoplasman, är det osannolikt att störa vidhäftningsegenskaper.
Beräkningen av signalen från regioner av intresse kan vara en underskattning, eftersom det är möjligt att att det kan finnas betydande dissociation av etiketten från celler (frisätts från döda celler eller andra mekanismer för övergång från levande celler). Sköldkörteln fångar fria isotop (Tc-99m) frigörs från döda eller döende celler, och Tc-99m-HMPAO kan elimineras genom njurarna och tarmen. Dessa vävnader skulle kunna övervakas av gammascintigrafi för att bedöma potentiell förlust av markör.
Förfarandet cellmärkning kan anpassas för att testa behålla cell och upptag på olika platser (organ och skador) med hjälp av olika leveransvägar. Tyngd karaktär av signalen i lungorna kan vara ett tecken på cellaggregat som förmodligen bryter upp med tid eller in cellys. Sköldkörteln, som fångar fria isotop, visar förmodligen en ökning av upptag efter regional perfusion eftersom de injicerade cellerna och resulterande skräp från döda celler har en mer tillgänglig väg till sköldkörteln via cirkulationen. Även om endast ca 24% av celler kvar efter 24 timmar, den intralesional väg in i senan är den mest effektiva leverans rutt som de flesta fallen visade ingen fri Tc-99m i sköldkörteln. Information som erhålls från att använda sådana protokoll kan informera framtida utformning och utveckling av stamcells ansökningar om more effektiva kliniska behandlingar.
Den cellmärkning protokoll anpassades för användning i hästen från Tc-99m-HMPAO märkning av leukocyter i humana medicinska tillämpningar. Dess användning i detta protokoll visar användbarhet i ett stort djur där senan sjukdomen förekommer spontant för undersökningar av cellbaserade terapier. Rekryteringen av kliniska fall kan bidra till att motverka de högre kostnader som är förknippade med att arbeta med en större djur. Märkningsförfarandet för användning som en avbildningsmodalitet har beskrivits i små djurmodeller 21 och vi tror att protokollet på samma sätt kan utnyttjas i större djur såsom fåren för undersökningar av andra senor sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
