Abstract
Jüngste Fortschritte in der Anwendung von Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMMSC) zur Behandlung von Sehnen- und Bänderverletzungen im Pferde schlage in experimentellen und klinischen Studien verbessert Ergebnismessungen. Obwohl die BMMSC werden in die Sehne Läsion in großer Zahl implantiert (üblicherweise 10 - 20 Millionen Zellen), wird nur eine relativ kleine Anzahl überleben (<10%), obwohl diese für bis zu 5 Monate nach der Implantation fortbestehen. Dies scheint eine allgemeine Beobachtung bei anderen Arten, bei denen BMMSC haben in andere Gewebe implantiert worden, und es ist wichtig, zu verstehen, wenn dieser Verlust auftritt, wie viele überleben die anfängliche Implantationsprozess und ob die Zellen in anderen Organen gelöscht. Verfolgen des Schicksals der Zellen kann durch die radioaktive Markierung BMMSC vor der Implantation, die nicht-invasive in vivo-Abbildung von Zellenposition und Quantifizierung von Zellzahlen können erreicht werden.
Dieses Protokoll beschreibt eine Zelle LABÉLIng Verfahren, das Technetium-99m (Tc-99m), und Verfolgung von diesen Zellen nach der Implantation in die verletzten Beugesehnen bei Pferden verwendet. Tc-99m ist ein kurzlebiges (t 1/2 von 6,01 hr) Isotop, das Gammastrahlen emittiert, und kann von Zellen in Gegenwart der lipophilen Verbindung hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO) internalisiert werden. Diese Eigenschaften machen es ideal für den Einsatz in der Nuklearmedizin Kliniken für die Diagnose von vielen verschiedenen Krankheiten. Das Schicksal der markierten Zellen in der Kurzzeit (bis zu 36 h) von Gammaszintigraphie, sowohl die Zahl der Zellen in der Läsion und der Verteilung der Zellen in der Lunge, Schilddrüse und andere Organe erhalten quantifizieren folgen. Diese Technik wird von der Kennzeichnung von Blutleukozyten angepasst und könnte zu Bild implantiert BMMSC in anderen Organen genutzt werden.
Introduction
Regenerativ-Strategien für die Reparatur von erkranktem oder beschädigtem Gewebe an multipotenten Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Gewebe gewonnen und in den betroffenen Bereich implantiert basiert. Jüngste Fortschritte in der Anwendung der autologen BMMSC zur Behandlung von Sehnen- und Bänderverletzungen beim Pferd verbessert Endpunkte sowohl in experimentellen 1-5 und klinischen Studien. 6 gezeigt Das Pferd ist ein besonders attraktives Modell für die Beurteilung der Wirksamkeit der Stammzellbezogenen Behandlungen, weil sie leidet unter dem Alter und überfordern Verletzungen der Sehnen des distalen Vordergliedmaße, ist es ein athletischer Tier, und es ist eine große, Erleichterung Erholung des Knochenmarks und genaue Implantation. Sehnenverletzungen heilen natürlich mit Fibrose, aber die Sehne verheilt ist funktional inferior 7 und hat ein hohes Risiko für erneute Verletzungen 8. Die oberflächliche Beugesehne (SDFT) ist am häufigsten betroffen, wie es entwickelt hat, um als elastische Energie handelnLaden und Erfahrungen hohen Belastung betont, um energiesparende und hohe Geschwindigkeit der Fortbewegung zu erzielen. Wiederherstellung der Funktion nach einer Verletzung ist daher entscheidend. Diese Verletzungen sind ähnlich zu solchen, die die Achillessehne bei Menschen, die eine ähnliche Funktion 9 ausführt. Es gibt keine guten Behandlungsmöglichkeiten zu behandeln oder zu erreichen, der guten Reparatur für solche Verletzungen, also zellbasierte regenerative Strategien bieten eine attraktive Möglichkeit, die Ergebnisse zu verbessern und um eine erneute Verletzungen zu verringern.
In den meisten Studien 5 bis 20.000.000 autologe BMMSC werden direkt in die Läsion in der Regel innerhalb des Kerns der Sehne Körper, dient daher als Aufnahme für die Zellen auftreten injiziert. Das Schicksal der Zellen einmal injiziert ist nicht klar, und verschiedene Zellmarkierungsverfahren zu verfolgen, die Zellen wurden kürzlich beschrieben. Zellen mit einem Fluoreszenz-Tag markiert wurde gezeigt, nur in relativ kleinen Stückzahlen (<10%) 10,11 überleben. Fluoreszenzmarkierungen erforderlichGewebeentnahme und Schnitte für die histologische Analyse, was zeitaufwendig ist und nicht leicht zu erleichtern zeitliche Analyse in einem Großtiermodell oder in klinischen Fällen. In neueren Arbeiten haben wir die Radioisotop 99m Tc verwendet werden, um Zellen zu markieren, und folgen Sie ihr Schicksal durch Gammaszintigraphie 1. Diese Methode erlaubt eine schnelle Vergleiche zwischen unterschiedlichen Routen Zellabgabe, einschließlich intraläsionale, intravenös über die Jugularvene 1 oder regionale Perfusion intraarteriell 12 oder intravenöse 1,12 Injektionen erfolgen. Die Persistenz und die Verteilung der Zellen kann dann durch Gammaszintigraphie verschiedener Organe abgebildet werden. Dies hat gezeigt, dass nur 24% der Zellen injiziert intraläsional in der Läsion nach 24 h 1 geblieben, und dies wird durch eine andere Studie mit experimentell erstellt Läsionen und unter Verwendung des gleichen Radiomarkierung 5 unterstützt. Darüber hinaus zeigen die Zellen begrenzte Fähigkeit, zu Hause, in Sehnen-Verletzungen, wenn deliveredurch regionale Perfusion oder intravenös d sind aber in die Lunge durch die letztgenannten Routen 4 dispergiert.
BMMSC mit Eisen-Nanopartikeln markiert ist eine alternative Methode, um Zellen in forelimb Sehnen 13 implantiert zu verfolgen. Obwohl Eisennanopartikel markierten Zellen zu ermöglichen Zellverfolgung in vivo MRI werden zeitliche Studien in einem großen Tier durch die Anzahl der Male Anästhesie zu jedem Zeitpunkt für die Durchführung der MRT verabreicht werden begrenzt. Darüber hinaus sind Eisennanopartikel hypointensen auf MRI, die die Informationen über die Migration von markierten Zellen in die Sehne Körper einschränkt. Andere Radioisotope, die verwendet werden können, sind Indium-111, aber dies hat den Nachteil einer längeren Halbwertszeit als Tc-99m (2,8 Tagen vs 6,0 h) und höhere Gammastrahlenemission Energie. Zusätzlich wurde die Lebensfähigkeit der Zellen wurde berichtet, reduziert werden, wenn mit Indium-111 14 gekennzeichnet. Tc-99m, auf der anderen Seite, wird routinemäßig in sowohl equine und Humankern verwendetArzneimittel zur peripheren mononukleären Blutzellen zu markieren und folgen ihrer Verteilung in vivo durch Szintigraphie. Es lassen sich relativ leicht von den Zellen unter Verwendung HMPAO als Linkermolekül, um das Technetium zu binden, genommen zu werden, wie Tc-99m-HMPAO zu den Zellen. Tc-99m-markierten HMPAO BMMSC zeigen eine gute Lebensfähigkeit und können in vitro 4 vermehren. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung und Verfolgung von Pferde-autologe BMMSC in natürlich vorkommende Läsionen in der Vordergliedmaße SDFT implantiert.
Es ist wichtig zu beachten, daß das Protokoll nur soll als Forschungswerkzeug verwendet werden. Seine Verwendung als klinische therapeutische Modalität wird nicht die Wirkung der Radiomarkierung auf zelluläre Phänotyp, nicht vollständig aufgeklärt worden empfohlen.
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Protocol
Die hier beschriebenen Fälle wurden folgende ethische Genehmigung durch die Tierethik und Tierschutz Ausschuss des Colegio de Veterinarios de Malaga, Spanien, und dem Royal Veterinary College, North Mymms, UK auf den Pferden verwendet Verfahren erteilten geführt werden auf genehmigten Protokolle, die es auf der Grundlage in der Klinik für Pferde, die Stammzell-basierte Therapien, die Sedierung, Knochenmark-Aspiration, intra-Sehnen Injektion, regionalen Perfusion, intravenöse Injektion, post-prozeduralen Behandlung und Schmerzmanagement und Überwachung nach der Implantation enthält verwendet.
1. Schlüssel Vorkehrungen getroffen werden, in Advance
- Suchen institutionelle Ethik und Tierschutz-Zulassung und sich an lokalen gesetzlichen Vorschriften vor Beginn der Arbeiten.
- Suchen institutionellen Genehmigung mit ionisierender Strahlung arbeiten, wie von den lokalen und gesetzlichen Vorschriften, einschließlich der angemessenen Schutz des Personals und der Umwelt und der Veräußerung von CONTAM diktiertinated Abfälle.
- Verwenden Sie die folgenden Aufnahmekriterien: mit einem nicht-traumatische Überbeanspruchung Verletzungen (Tendinopathie oder desmopathy) an die oberflächliche Beuge digitale Sehne des Vorderbein und Läsionen, was zu einem Mangel innerhalb der Sehne und dem Mangel vor Pferden durch intakte Sehne und / oder Sehnengleitgewebe umgeben .
Hinweis: Die Untersuchung und Diagnose für solche Verletzungen und der klinischen Vorbereitung der Pferde für Zellimplantation wurde an anderer Stelle ausführlich 6,15.
Anmerkung: Die Isolierung und Expansion in Kultur von BMMSC aus dem Knochenmark von Pferden abgeleitete zuvor 6,16 detailliert wurde. Das aktuelle Protokoll zum Einspritzen BMMSC für SDFT Verletzungen beim Pferd nutzt 10 Millionen Zellen pro ml 4 von autologen Knochenmarkstand (BMS) 16. - Verwenden Zellen, die nicht mehr als 4 Durchgänge für die in vivo-Implantation unterzogen wurden, um mögliche zelluläre Phänotyp oder genetischen Veränderungen mit hoher Durchlaufhäufigkeit c zugeordnet vermeidenEllen.
- Geben Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in der BMS (innerhalb von 24 h in einem Kühlfach an 4 - 8 ° C) in die Tierklinik, wo die Zellimplantation durchgeführt werden soll.
Hinweis: Die klinische Anwendung von mesenchymalen Stammzellen im Knochenmark Stand ist ein patentiertes Verfahren durch ReCellerate Inc (USA) und seine Verwendung im Besitz kann genehmigungspflichtig.
Anmerkung: Tc-99m ist ein Gamma-Strahler (140 keV) mit einer relativ kurzen Halbwertszeit (hr 6,0058 daher fast 94% der es zerfällt in seine stabile Form von 99 Tc in 24 h). Die Gamma-Energie macht es geeignet für die Detektion von Gammakameras (Szintigraphie) und der kurzen Halbwertszeit führt zu sehr begrenztes radioBelichtungsZeit, um sowohl das Pferd und die Behandlung der Tiere Personal. Dieses Protokoll beschreibt die Vor-Ort-Markierung von Zellen unter Verwendung von Tc-99m-HMPAO [HMPAO mit Tc-99m (als Natriumpertechnetat) markiert]. - Bestellen Sie das Tc-99m frisch vom Lieferanten, dass sie geliefert wird und zur Markierung der Zellen wit verwendetHin 2 h Elution von der Tc-99m-Generator. Sicherzustellen, dass der Tc-99m wird wie in 1 GBq (Standardpuffer Zulieferers) Eine 1 ml Lösung geliefert.
- Verwenden Sie alle Puffer bei RT. Führen Sie die Markierungsverfahren, die Implantation der Zellen und Bildgebung (Gammaszintigraphie) in einem Isotop Containraum mit allen Geräten mit Alkohol gereinigt wischt vor dem Beginn der Arbeit.
2. Vorbereitung des Pferdes und Ultraschall des Vorderbein Tendon
- Nehmen Ultraschalluntersuchungen auf den ersten Eintritt für Verletzungen (bei Knochenmark angesaugt wird) und dann zu dem Zeitpunkt, wenn radioaktiv markierten Zellen injiziert.
- Führen Sonographie und Zellimplantation mit dem Pferd Lager Gewicht gleichmäßig im Stall und im stehenden Sedierung (statt Vollnarkose). Verabreichen Sedierung mit einem Gemisch aus HCl und Detomidin Butorphanoltartrat, jeweils 0,01 bis 0,02 mg / kg iv.
Hinweis: Recovery ist schnell und post-operative Behandlung erfordert keinebesondere Überlegungen. - Nach perineuralen Anästhesie angewendet wird (Schritt 2.6) in der betroffenen Extremität, halten das Pferd an der Station unter Sedierung, um die Bewegung des Pferdes während der Behandlung zu verringern. Sichtprüfung der entsprechenden Ebene der Sedierung aus der abgesenkten Kopfposition und der Haltung des Pferdes und das Pferd ist bequem während der Zellinjektion und den Bewegungen der Gamma-Kamera während der Aufnahme Szintigrafen Bilder beurteilt.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, Tierarzt Salbe auf die Augen (bis zur Trockenheit zu verhindern), weil unter Sedierung Blinken gelten nicht beeinträchtigt wird und das Pferd in der Lage, Feuchtigkeit der Augen zu erhalten. Die Überwachung nach der Implantation der Zellen nicht invasiv ist (Ultraschall und Gammaszintigraphie). - Clip genau das Haar über der Sehne (mit Pferdehaarschneidemaschinen), dann reinigen Sie den abgeschnitten Bereich mit einer Kombination aus einem Chlorhexidin-chirurgische Macchia und schließlich Alkohol.
- Bewerben akustische Kopplung Gel in der Gegend undscannen methodisch Scans des gesamten Handflächenmittelhandbereich sequenziell markierten Stufen 1 notieren - 7 17, mit einem linearen Wandler (12 MHz oder ähnlich) auf serielle on-Inzidenz Quer- und Längs Bilder zu erhalten. Speichern die Bilder digital, so dass der Querschnittsbereich und die maximale Schadenszone 4 kann mit Hilfe einer Bildanalyse-Software erhalten werden.
- Bereiten Sie den Bereich, die über den Handflächen Nerven unmittelbar distal der Handwurzel für aseptische Injektion von Lokalanästhetikum, um eine vollständige Desensibilisierung der Haut über der Sehne und der oberflächlichen Beugesehne zu gewährleisten. Spritzen Sie 2 ml mepivicaine sowohl subkutan und angrenzend an die palmare Nerven (in deren Unter Faszien Lage) zwischen den Beugesehnen und der Fesselträger unmittelbar distal der Handwurzel zu beiden Seiten des Gliedes.
- Sobald die vorläufigen Scan durchgeführt wurde, bereiten die Implantationsstelle durch Waschen den Bereich mit einem Chlorhexidin-chirurgische scrub Lösung für mindestens 5 Minuten und schließlich mit Alkohol getränkter Gaze. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in aseptischer Art und Weise.
3. Tc-99m-Markierung von Equine mesenchymalen Stammzellen
Hinweis: Die Zellmarkierung Schritte können während der Ultraschalluntersuchung der Vordergliedmaße, da dies zu minimieren Isotopenzerfall zwischen Zellmarkierung und Implantation von markierten Zellen in die Sehne durchgeführt werden.
- Entfernen Sie den BMS aus den Zellen, wie es mit der Aufnahme von isotopen stört. Um dies zu tun, rufen Sie die Fläschchen BMMSC (10 Millionen Zellen in 1 ml BMS) von der Kühlkasten und Pellet die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 350 xg für 5 min bei RT. Den Überstand mit einer 18G oder 19G Nadel (in ein 2-ml-Spritze befestigt) Entfernen Sie vorsichtig, so dass ein kleiner Tropfen (≤0.1 ml) in der Röhre, um die Zell Resuspendierung zu erleichtern. Speichern Sie den Überstand (das BMS) in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis für eine spätere Wiederverwendung zu halten.
- Resuspendieren der Zellen in dem verbleibenden Tröpfchen der Überstand durch flIcking das Rohr vorsichtig mit den Fingern (anstatt Vortex) und lassen Sie das Rohr in einem Rack bei RT. Achten Sie darauf, die Zellen vollständig suspendiert und dass es keine sichtbaren Zellklumpen.
- Bereiten Sie das Tc-99m wie folgt. 1 ml der Technetium Pertechnetat in eine Phiole HMPAO Verwendung einer 1 ml Spritze und einer Nadel. Mischen Sie vorsichtig, aber gründlich und lassen Sie für 5 Minuten hinter Bleiabschirmung. Anmerkung: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, während die Zellen in Schritt 2.1 zu drehen.
- In all der Tc-99m-HMPAO Mischung unter Verwendung einer 1 ml Spritze und Nadel für die Zellen und vorsichtig mischen. Inkubation für 30 min bei RT hinter Bleiabschirmung.
- Für die nächsten Schritte, verwenden Sie eine Zange (oder ein Stück Seidenpapier), um den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchen öffnen, um Isotop Kontamination der (behandschuhten) Daumen und anschließend anderen Geräten zu minimieren. Verwenden Sie ein 2-ml-Spritze und 21 G-Nadel, um hinzuzufügen oder zu entfernen Waschpuffer.
Anmerkung: Die Verwendung eines Feld Isotop Monitor wird gefördert, um eine Verunreinigung der Oberflächen und Geräte überwachen. 1 ml PBS auf die Tc-99m-HMPAO-Zellmischung, den Deckel schließen, vorsichtig mischen und Spin, um die Zellen zu pelletieren, wie in Schritt 3.1. - Die PBS Entfernen Sie vorsichtig in ein neues Röhrchen (speichern Sie diese hinter Bleiabschirmung und Label als W1). Zellpellet in 1 ml frischem PBS. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und Überstand wie oben (speichern Sie diese und Label als W2).
- Berechnung der Effizienz der Markierung durch Messen der Zählungen in W1 und W2 Rohren und in dem Zellpellet. Tun Sie dies, indem jede Röhrchen in einem Well-Isotop Dosiskalibrator Instrument und Aufzeichnen der Radioaktivität als Zählungen pro Minute (CPM). Berechnen Sie die Markierungseffizienz als (Radioaktivität als CPM von Zellen) / (Radioaktivität von Zellen + Überstand) x 100.
- Resuspendieren der Zellen gründlich in der Rest PBS und fügen Sie den BMS gerettet aus Schritt 3.1. Die Zellen sind bereit für intraläsionale Implantation.
4. Die Implantation von Tc-99m-HMPAO-markierten Zellen
- Intraläsionale Implantationin die Sehne unter Ultraschallkontrolle
- Langsam einführen 1,5 oder 2 Zoll (50 mm) 20 G-Nadel in die Maximalverletzungszone der Läsion in einer Längsausrichtung mit dem Ultraschallwandler in einem sterilen Tuch abgedeckt, im Einklang mit der Nadel, so dass die Länge der Nadel sonographisch erkannt werden und die Spitze, wenn die Nadel genau in der Mitte der Läsion entfernt.
- Unter Verwendung geeigneter Abschirmung, sammeln die Zellen in ein 2-ml-Spritze mit einer 20 G-Nadel (Luer-Lock, das Risiko von Verunreinigungen von außen und in einer Bleiabschirmung Spritzenabdeckung zu minimieren). Entsorgen Sie die Nadel darauf achten, daß keine Flüssigkeit zu verlieren. Jetzt legen Sie die Spritze mit der markierten Zellen auf die Nadel in der Sehne vor, entfernt.
- Platzieren der Ultraschallsonde unter der Nadel, so dass der Stichkanal im Gewebe ist deutlich sichtbar. Injizieren der Zellen bei einer langsamen, aber stetigen Tempo in die Läsion. Sicherzustellen, dass es keinen Widerstand gegen Injektion. Wenn dies auftrittsorgfältig neu zu positionieren die Nadel unter Ultraschallkontrolle. Überprüfen Sie, dass die Fluidausstoß in die Läsion auf dem Ultraschallbild als echofreie Flüssigkeit enthaltende hyperechogenen Luftblasen sichtbar ist.
- Zurückziehen der Nadel und unmittelbar platzieren Druck über dem Nadelloch zu einem Verlust der injizierten Zellen zu verhindern und die Ausbreitung von Isotop über die Außenfläche des Gliedes zu minimieren. Unmittelbar Kleid das Teil mit einer Schicht aus Selbstklebender Verband. Das Pferd ist nun bereit für Gammaszintigraphie. Führen Sie dies sofort.
Hinweis: Nach der Injektion der Zellen in der Sehne, erwerben eine Zählung der leeren Spritze und Nadel, um möglichst direkten Verlust von Zellen, die in der Spritze verbleiben können beurteilen.
- Regionale Perfusion von Tc-99m-HMPAO-markierten Zellen
- Folgen Sie Schritt 2.4.
- Tragen Sie eine 100 mm Gummiaderpresse Verband an dem proximalen Mittelhand mit zwei 100 mm Watterolle Mullbinde medial und lateral positioniert.
- Aseptisch vorbereiten the Haut über dem seitlichen Handflächenfingervenen auf der Ebene der lateralen proximalen Sesambein durch Schrubben der Fläche mit einem Chlorhexidin chirurgischen Scheuer Lösung für mindestens 5 Minuten und schließlich mit Gaze in Alkohol getränkt. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in aseptischer Art und Weise.
- Bereiten Sie eine 100 mm Verlängerung mit einer 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) Butterfly-Nadel bei der Blutabnahme eingestellt, indem mit heparinisierter steriler Kochsalzlösung und dann einzuführen, die Nadel in die seitlichen Handflächenfingervenen. Sobald die Vene eingegeben Blut wird teilweise zu füllen den Erweiterungssatz. An der Luer-Lock-Anschluss legen Sie eine Luer-Lock-Gummikappe zur Erleichterung der nachfolgenden Injektion von markierten Zellen.
- Verdünnen Sie die MSCs in 19 ml PBS durch das Sammeln der Zellen in einer 20-ml-Spritze mit dem PBS vorinstalliert. Übernehmen Sie die Zellen über den Gummi-Cup mit einem 18 g (1,2 x 40 mm) Injektionsnadel in einem langsamen, aber stetigen Rate (30 - 40 sec). Spülen Sie den Katheter mit 1 ml PBS in einer syring vorinstallierte.
- Entfernen Sie die Nadel und sofort anwenden Druck auf der Haut über dem Nadelloch mit einer Schicht von fünf 4 x 4 Baumwoll-Gaze. Dann legen Sie einen leichten Verband mit elastischer Klebstoff über das proximale Sesambereich und lassen Sie den Stauschlauch an Ort und Stelle für 30 Minuten nach der Injektion.
- Lassen Sie die Aderpresse nach 30 min. Das Pferd ist nun bereit für Gammaszintigraphie.
Hinweis: Nach der Injektion der Zellen, zu erwerben eine Zählung der leeren Spritze und Nadel, um möglichst direkten Verlust von Zellen, die in der Spritze verbleiben können beurteilen.
5. Gammaszintigraphie
- Szintigraphie Bilder
- Erwerben planare Szintigraphie Bilder mit einer Gamma-Kamera (bei 140 keV photoelektrischen Peak unter Verwendung eines 20% symmetrische Fenster festgelegt) mit einem niedrigen Energieverbrauch, parallel Loch-Kollimator ausgestattet.
- Erhalten Sie alle Bilder nach dem Zeitpunkt 0 auf Pferden stehend, wie in Schritt 2.2 sediert. Nach der Zeit 0 Szintigramm, ersetzen Sie die Licht Verband über die Implantation site mit einem Polsterbinde. Entfernen Sie diesen Verband vor jeder Szintigraphie Prüfung.
- Erwerben Sie statische Bilder für 60 Sekunden jede (256 mal 256 Matrix) mit der Verarbeitungssoftware mit dem "erwerben" - "Studienauswahl" - "Knochen statische" Optionen. Wesentlich ist, dass das Pferd nicht bei der Bildaufnahme Zeitraum zu bewegen, weil der Modus Option statisch nicht über ein Modul zur Korrektur der Bewegung.
- Für intraläsionale Injektion erhalten seitlichen Bilder von der Läsion Bereich von der Handwurzel, um das distale Ende, das Äquivalent Bereich der kontralateralen Gliedmaße, der linken Lunge Feld und der linken Schilddrüse. Bei der Übernahme der Vorderbeine Bilder, positionieren Sie einen Bleischirm zwischen die Beine, um Bildgebung des Gliedes kontralateralen vermeiden. Erfassen die Bilder bei 5 min nach der Injektion (Zeit 0) und dann nach 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Std.
- Für die regionale Durchblutung, erhalten lateral und dorsal gamma Bilder wie 5.1.1.3. Besorgen Sie Bilder 5 min after Blutsperre. Dies wird einige Zeit 0 sein unmittelbar nach dem Einspritzen der Zellen zählt vor Release Tourniquet zu bewerten Es kann nützlich sein Bild der Gliedmaße zu sein. Erhalten gamma Bilder 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Verabreichung der Zellen.
- Nachdem die Bilder erworben wurden, verarbeiten die Bilder manuell mit Hilfe der Option "Verarbeitung" der Software mit Optionen für "Sokoloff" Farbe und "Invert" Farbe ausgewählt. Als nächstes wählen Sie die "region of interest" (ROI) und "Ellipse", da dies ermöglicht Umgestaltung der Auswahlmaske und Bewegung über den Schädigungsbereich. Besorgen Sie sich die Zählungen über den ROI, indem Sie die Option "in den Statistiken". Sicherzustellen, dass gleich große Bereiche von Interesse (ROI) sind für jedes Tier in den verschiedenen Zeitpunkten erfasst.
- Weiter, korrigieren Sie die Zählungen für die vorhergesagte Abfall des Technetium zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die für den Abfall zu beseitigen:A = A o e - (0.693t / T 1/2) ist, wobei A o die Anfangsaktivität des Isotops ist, A die Zerfalls korrigierte Radioaktivität zur Zeit null ist, t die verstrichene Zeit und T 1/2 die Halb -life des Isotops. Dann drücken die korrigierten Impulse zu jedem Zeitpunkt in Prozent des ROI zum Zeitpunkt 0 zu erarbeiten, den Prozentsatz an Zellen verbleibende, mit der folgenden Formel:
- Erwerben planare Szintigraphie Bilder mit einer Gamma-Kamera (bei 140 keV photoelektrischen Peak unter Verwendung eines 20% symmetrische Fenster festgelegt) mit einem niedrigen Energieverbrauch, parallel Loch-Kollimator ausgestattet.
% verbleibende Zellen (t) = 100 - {[(vorhergesagten Verfall (t) - Zerfall (t)) / vorhergesagten Verfall (t)]} x 100
Decay (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
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Representative Results
Tc-99m-HMPAO Einbau in BMMSs nicht beeinträchtigt ihre Fähigkeit, auf Gewebekulturkunststoff haften und während sie (Abbildung 1) zeigen die Proliferation Fähigkeit, Monoschichten bilden, haben wir noch nicht vollständig bestimmt, ob Proliferationsraten oder anderen zellulären Phänotypen betroffen sind. Ihrer Morphologie ähnelt unmarkierten Zellen mit einer typischen Spindelform. Das zellulare Markierungseffizienz (dh., Die Aufnahme von Label) variiert typischerweise von etwa 1,5% bis 25%. Der Hauptgrund für die geringe Markierungseffizienz wurde auf die Verzögerung bei der Lieferung des 99m Tc zur Klinik von der Stelle, wo die Mo-99 / Tc-99m-Generator eluiert wurde verwandt. Verspätungen von mehr als 2 Stunden führen zu einem großen Rückgang der Kennzeichnung der Zellen. Jedoch ausreichende Isotops in die Zellen eingebracht, um Gammaszintigraphie bis zu 36 h (Figur 2) durchzuführen. Faktoren, die Markierungseffizienz verbessern können, sind in der Diskussion beschrieben.
1 (direkt in die Läsion) oder durch regionale Perfusion über einen digitalen Vene oder Arterie 12 1. Intraläsionale Implantation möglich ist, wenn die Schädigung in dem Kern der Sehne und durch intakte Sehnengewebe, das als Aufnahme für die Zellen wirkt, umgeben. Regionale Perfusion ist ein einfacherer Weg, um die Zellen zu verabreichen, wie sie in ein Blutgefäß injiziert werden, aber das Verfahren beruht auf der Erwartung, dass die MSC in der Lage sind "home-in" zur Sehne Läsion. Es gibt begrenzte Hinweise darauf, dass MSCs können gezielt nach Hause in die Stellen des Sehnen-Verletzungen aber diese Methode bietet einen nützlichen experimentellen Ansatz zur Entwicklung von Anwendungen, die die Referenzkapazität von MSCs erhöhen kann.
Mit der intraläsionale Lieferroute, werden die Zellen als ein Schwerpunktbereich des Signals, die relativ mit der Zeit also lokalisiert bleibt zu sehen. Es ist begrenzt spread oder Migration der Zellen in das umgebende Sehnengewebe. Im Gegensatz dazu wird es eine schrittweise Verringerung der Signal mit der Zeit an der Injektionsstelle, wenn Zellen durch regionale Perfusion über den digitalen Handflächenvenen (Abbildung 2) verabreicht. Es ist üblich, mit intraläsionale Injektion für die Lungenfelder zu sein negativ, aber in einigen Fällen bei den sehr frühen Zeitpunkten der Lunge kann Isotopensignal, das Brenn sein kann und dann immer mehr verallgemeinert (Abbildung 3) zeigen. Die Schilddrüse negativ bleibt mit dieser Art der Anwendung. Regionale Durchblutung kann in ähnlicher Brennsignal in der Lunge, die dann wird diffuser, aber im Vergleich zu dem mit dem intraläsionale Route beobachtet das Signal deutlich intensiver zu zeigen. Die Schilddrüse kann oft auch zeigen, Fokussignal.
Die anfängliche Gesamtradioisotop Zählung der Zellen (Zeit 0, vor der Injektion) und die Grafen von der ersten Gamma-Szintigramm in der Region von Interesse (Zeit 0, post-injection) werden zur Kenntnis genommen und verwendet, um die prozentuale Abnahme der Grafen zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Dies wird verwendet, um den vorhergesagten Zerfall des Tc-99m aus den Anfangszählungen (Figur 4) zu vergleichen. Die berechnete Kurve des vorhergesagten Kurve zu folgen. Nach Einnahme der vorhergesagten Zerfall berücksichtigt, ist die Beständigkeit von Zellen in der Injektionsstelle nach intraläsionale Verabreichung übrigen jedoch etwa 32% (bei 12 Stunden) und 24% (bei 24 Stunden) (Abbildung 4).
Abbildung 1. Zellmarkierung, Einspritzung und Gammaszintigraphie (A) Übertragung von BMMSC in ein Mikro vor der Markierung mit Tc-99m-HMPAO hinter mit Blei ausgekleideten Abschirmung (Schirm und Spritzenhalter) und Strahlungsmonitor und Mikrozentrifuge. (B) Ein Aliquot von Tc-99m-HMPAO markierten Zellen in einer Gewebekulturschale zeigen gute m ausgesätorphology, Lebensfähigkeit und Proliferation; (C) Injektion von Tc-99m-HMPAO markierten Zellen unter Ultraschallkontrolle in die verletzte Stelle des rechten Vorderbeins SDFT; (D) Gamma-Szintigraphie der Vordergliedmaße. Die Gamma-Kamera positioniert ist gerade mit einem wendigen hydraulischen Arm und mögliche markierten Zellen in der kontralateralen Gliedmaße sind durch eine Bleiabschirmung zwischen den Beinen gehalten eliminiert. Die Gamma-Kamera ist in ähnlicher Weise an der Brust, um das Lungenfeld überwachen oder am Hals, um die Schilddrüse Feld überwachen positioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Ultraschall und Gamma Szintigramme des SDFT. Typische ultrasonographs der Vordergliedmaße an der Mitte der Mittelhandbereich in (A (B) Querschnitt. Die Läsion im SDFT ist eindeutig als ein echo Teil (in Richtung der Spitze des Scan) gegenüber der unverletzten (normal) der Gewebeintegrität der Tiefe Beugesehne (DDFT) angrenzend an und unterhalb des SDFT gesehen. Die Fläche der Läsion und den relativen Positionen der Spannglieder werden in der nachstehenden schema dargestellt. Gamma Szintigrafien bei 3, 6 und 12 h nach der Injektion von radioaktiv markierten Zellen durchgeführt werden für die Zellen injiziert (C) in die Läsion oder (D) durch intravenöse regionale Perfusion über die digitale palmar Vene gezeigt. Im dargestellten Fall bestand Aufnahme radioaktiv markierter Zellen in der Läsionsstelle im SDFT (durchgezogene Pfeile). Persistenz der Aufnahme durch die Handflächenfingervenen wird durch den gestrichelten Pfeil gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Gamma Szintigramme der Lunge und der Schilddrüse. Typische Scans von frühen Zeitpunkten werden sowohl intraläsionale Injektion und regionale Perfusion von markierten Zellen gezeigt. Beachten Sie die fokale und diffuse Signal in der Lunge und Schilddrüse Felder aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Decay von Radioaktivität Aufgenommen von den Regions of Interest, nachdem intraläsionale Injektion. In diesem Pferd, Zählungen wurden von gamma Szintigramme des SDFT mehr als 36 Stunden nach der Injektion in die Läsion gemessen. Linker Bereich: die Radioaktivität zu jedem Zeitpunkt wurde gegen die Zeit 0 Wert berechnet. Dannatural Zerfall der Radioaktivität von 99m Tc ist zum Vergleich gezeigt. Rechts: der geschätzte Anteil der Zellen verbleiben. Dies wird von der Radioaktivität aus den Regionen von Interesse berechnet. In diesem Fall war der restliche Prozentsatz von Zellen nach 24 Stunden etwa 24%. Wir haben dieses Protokoll (Kennzeichnung von MSC und Implantation) von 21 Pferden durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Zusätzlich zum Knochenmark, Stammzellen sind aus Quellen wie Fettgewebe isoliert zur Markierung mit diesem Protokoll. Darüber hinaus können Zellen aus einem gefrorenen Zustand wiederbelebt und in Kultur vermehrt auf die gewünschten Zahlen für Markierungsstudien 12 werden.
Ein kritischer Faktor, der die Effizienz der Markierung des BMMSC bestimmt, ist die Zeit zwischen der Elution des Tc-99m aus dem Molybdängenerator an der Radiopharmazie, Herstellung von Tc-99m-HMPAO und Verwendung des Radiopharmazeutikums in der Klinik. Gibt es eine inverse Beziehung zwischen der Markierungseffizienz und der Zeit nach dem Tc-99m-Elution von dem Generator, so dass Verzögerungen, die außerhalb dieser Zeit kann wesentlich die Effizienz der Markierung von Zellen beeinträchtigen. Daher ist eine enge Koordinierung zwischen Lieferung der Zellen aus dem Labor und der Lieferung des Tc-99m in die Klinik am Tag, dass die Zellen radioaktiv markiert und implantiert werden benötigt. Die Transportzeit zum clinic ist daher ein wichtiger Faktor. Datenblatt der Anbieter festlegen, dass der Zerfall des Tc-99m verringert die Reinheit des radio nach 2 h nach der Elution, die mit der Bindung des HMPAO zur Tc-99m und anschließend die Menge an Tc-99m-HMPAO genommen stören können von den Zellen. Wir haben auch festgestellt, dass die Kennzeichnung von kultivierten Zellen in einer Laborumgebung ergab effizientere Kennzeichnung als in der Klinik. Dies wurde auch von anderen Studie bei Pferden 5, wobei die Zellen wurden in einer Laborumgebung markierten gemeldet. Zusätzlich in unserer Erfahrung Etikett wird effizienter durch Zellen, die unmittelbar nach der Präparation aus Blut oder Gewebeproben im Vergleich zu Zellen aus der Kultur hergestellt beschriftet sind gemacht. Jedoch selbst bei geringen Effizienz der Etikettierungs genügend Label an die Zellen gebunden, um die Szintigraphie als 36 Stunden lang auszuführen.
Markierungseffizienzen von 40% - 80% für Leukozyten erreicht werden, wenn die Tc-99m aus einem gebrauchtenFrischgenerator Eluat innerhalb von 30 min und die Reaktion in einem kleinen Volumen durchgeführt wird (1 - 0,5 ml) 18. Kennzeichnung Wirkungsgrade von 47% - 71% wurden für Pferde-MSCs 19 demonstriert, dass es möglich ist, die Markierungseffizienz von MSCs unter idealen Bedingungen zu erhöhen erreicht.
Wir routinemßig Implantat 20 Millionen Zellen für die Behandlung von Läsionen SDFT Kern obwohl bis zu 40 Millionen Zellen für die größten Veränderungen implantiert. Eine ähnliche Anzahl von Zellen könnte über regionale Perfusion implantiert werden, obwohl diese Methode nicht allgemein wegen der komplexeren Verfahren verwendet. Jedoch kann es nützlich für die Veränderungen, die in die Peripherie der Sehnenoberfläche mit der Erwartung, dass ausreichend Zellen Haus in die Läsion zu erweitern. Tracking der Zellen durch Gammaszintigraphie können nützliche Informationen über die Bewegung von Zellen durch verschiedene Wege verabreicht werden. In diesem Protokoll werden die Zellen durch die intraläsionale Route implantiert sind MÖSTLy gehalten an der Injektionsstelle durch die intraläsionale Route. Radioisotopen-Signal kann in der Lunge Felder in einigen Fällen beobachtet werden, aber es wird im Allgemeinen, dass es wenig Wanderung von Zellen vom Ort der Läsion. Abgabe BMMSC durch regionale Perfusion Weise könnten Retention von Zellen an der Verletzungsstelle, aber wenn sie durch intravenöse Injektion 4 geliefert haben wir beobachtet Homing der Zellen. Der Tc-99m-HMPAO Etikett beeinflußt nicht die Zellen Migrationsfähigkeit 20 und als die Tc-99m-HMPAO wird von den Zellen aufgenommen und in dem Cytoplasma zurückgehalten werden, ist es unwahrscheinlich, dass mit Klebeeigenschaften beeinträchtigen.
Die Berechnung des Signal von Regionen von Interesse kann eine Unterschätzung, da es möglich ist, dass, dass es signifikante Dissoziation des Etiketts von Zellen (von abgestorbenen Zellen oder andere Mechanismen der Freisetzung von lebenden Zellen freigesetzt) sein. Die Schilddrüse nimmt freien Isotopen (Tc-99m) von toten oder sterbenden Zellen freigesetzt und Tc-99m-HMPAO kann durch die Niere und Darm eliminiert werden. Diese Gewebe könnte durch Gammaszintigraphie überwacht werden, um möglichen Verlust von Label zu bewerten.
Die Zellmarkierungsverfahren kann zum Testen Zellrückhaltung und die Aufnahme an verschiedenen Standorten (Organe und Verletzungen) mit verschiedenen Lieferwege angepasst werden. Die Brenn Natur des Signals in der Lunge kann ein Hinweis auf Zellaggregate, die vermutlich brechen mit der Zeit oder geben Zelllyse sein. Die Schilddrüse, die frei Isotopen erfasst, zeigt vermutlich eine Erhöhung der Aufnahme folgende regionale Durchblutung, da die injizierten Zellen und die daraus resultierenden Ablagerungen von toten Zellen haben ein zugänglicher Weg in die Schilddrüse über den Kreislauf. Obwohl nur etwa 24% der Zellen nach 24 Stunden zu bleiben, die intraläsionale Strecke in die Sehne ist die effektivste Lieferroute als den meisten Fällen ergab kein freies Tc-99m in der Schilddrüse. Informationen vom Einsatz solcher Protokolle gewonnen kann zukünftige Gestaltung und Entwicklung von Stammzell-Applikationen für mo informierenWieder effektive klinische Therapien.
Die Markierung von Zellen-Protokoll wurde für die Verwendung in dem Pferd von Tc-99m-HMPAO Markierung von Leukozyten in der humanmedizinischen Anwendungen angepasst. Sein Einsatz in diesem Protokoll zeigt die Anwendbarkeit in einem großen Tier, in dem Sehnenerkrankung tritt spontan für Untersuchungen von Zelltherapien. Die Rekrutierung von klinischen Fällen helfen kann, um die höheren Kosten, die mit der Arbeit mit einem größeren Tier zugeordnet ausgeglichen. Das Markierungsverfahren für die Verwendung als bildgebendes Verfahren ist in Kleintiermodellen 21 beschrieben worden ist, und wir glauben, daß das Protokoll in ähnlicher Weise in größere Tiere wie Schafe für Untersuchungen anderer Sehnenerkrankungen verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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