Abstract
Nylige fremskridt i anvendelsen af knoglemarven mesenkymale stamceller (BMMSC) til behandling af sener og ledbåndsskader i hesten foreslår forbedret resultatmål i både eksperimentelle og kliniske studier. Selvom BMMSC implanteres i senen læsion i stort antal (sædvanligvis 10 - 20 millioner celler), kun et relativt lille antal overleve (<10%), selv om disse kan vare i op til 5 måneder efter implantation. Dette synes at være en almindelig observation i andre arter, hvor BMMSC er blevet implanteret i andre væv, og det er vigtigt at forstå, når dette tab sker, hvor mange overlever den indledende implantation proces og om cellerne blokerede i andre organer. Sporing skæbne af cellerne kan opnås ved radioaktiv mærkning af BMMSC før implantation, som tillader ikke-invasiv in vivo billeddannelse af celler placering og kvantificering af celleantal.
Denne protokol beskriver en celle labeling procedure, der bruger technetium-99m (Tc-99m), og sporing af disse celler efter implantation i såret bøjesenerne i heste. Tc-99m er en kortvarig (t 1/2 af 6,01 timer) isotop, der udsender gammastråler og kan internaliseres af celler i nærværelse af den lipofile forbindelse hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO). Disse egenskaber gør den ideel til brug i nuklearmedicinske klinikker til diagnosticering af mange forskellige sygdomme. Skæbnen for de mærkede celler kan følges på kort sigt (op til 36 timer) ved gamma-scintigrafi at kvantificere både antallet af celler tilbageholdt i læsionen og distribution af cellerne i lungerne, skjoldbruskkirtlen og andre organer. Denne teknik er tilpasset fra mærkning af blodleukocytter og kunne anvendes til at afbilde implanteret BMMSC i andre organer.
Introduction
Regenerative strategier til reparation af syge eller beskadigede væv er baseret på multipotente stamceller fra en række af væv og implanteret i det berørte område. Nylige fremskridt i anvendelsen af autologe BMMSC til behandling af senen og ledbåndsskader i hesten har vist forbedrede resultatmål i både eksperimentel 1-5 og kliniske studier 6. Hesten er en særlig attraktiv model til vurdering af effektiviteten af stamcellerelateret behandlinger, fordi det lider alder og overanstrenger relaterede skader til sener af den distale forben, det er en atletisk dyr, og det er en stor, lette knoglemarvstransplantation nyttiggørelse og nøjagtig implantation. Seneskader helbrede naturligt med fibrose men helet senen er funktionelt ringere 7 og har en høj risiko for re-skade 8. Den overfladiske digitale flexor senen (SDFT) er mest almindeligt berørt, da det har udviklet sig til at fungere som en elastisk energiStore og erfaringer høj belastning understreger at opnå energieffektiv og høj hastighed bevægelse. Gendannelse funktion efter skade er derfor kritisk. Disse skader er magen til dem, der påvirker akillessenen i mennesker, der udfører samme funktion 9. Der er ingen gode behandlingsmuligheder til at behandle eller opnå god reparation for sådanne skader, derfor cellebaserede regenerative strategier tilbyde en attraktiv mulighed for at forbedre resultaterne og reducere re-skade.
I de fleste undersøgelser 5 - 20 mio autolog BMMSC injiceres direkte ind i læsionen, som normalt forekommer i kernen af senen organ som derfor fungerer som en beholder for cellerne. Den skæbne af cellerne, når injicerede er ikke klare og forskellige celle mærkning metoder til at spore cellerne er blevet beskrevet for nylig. Celler mærket med et fluorescens-tag blev vist til kun overleve i relativt små mængder (<10%) 10,11. Fluorescensmærker nødvendiggørvæv udvinding og skæring til histologisk analyse, som er tidskrævende og ikke let lette tidsmæssig analyse i en stor dyremodel eller i kliniske tilfælde. I nyere arbejde har vi brugt radioisotopen 99mTc at mærke celler og følge deres skæbne ved gammascintigrafi 1. Denne metode giver hurtige sammenligninger mellem forskellige ruter af celle levering, herunder intralæsional, intravenøs via halsvenen 1 eller regional perfusion via intra-arterielle 12 eller intravenøse 1,12 injektioner. Persistensen og distribution af celler kan derefter afbildes ved gamma-scintigrafi af forskellige organer. Dette har vist, at kun 24% af de injicerede celler intralæsionalt forblev i læsionen med 24 timer 1, og dette understøttes af en anden undersøgelse ved anvendelse af eksperimentelt skabt læsioner og med samme radiomærke 5. Desuden viser cellerne begrænset evne til at hjem til sener læsioner, når delivered ved regional perfusion eller intravenøst, men er spredt i lungerne af sidstnævnte ruter 4.
BMMSC mærket med jern nanopartikler er en alternativ metode til at spore celler implanteret i forben sener 13. Selv om jern nanopartikel mærkede celler tillader cellesporing in vivo ved hjælp af MRI, er tidsstudier i et stort dyr begrænset af det antal gange anæstesi kan indgives på hvert tidspunkt for udførelse af MR-scanninger. Endvidere jern nanopartikler er hypointense på MRI som begrænser oplysninger om migration af mærkede celler i senen kroppen. Andre radioisotoper, der kan anvendes, indbefatter Indium-111, men dette har den ulempe af en længere halveringstid end Tc-99m (2,8 dage versus 6,0 timer) og højere emission energi gamma ray. Desuden er der rapporteret cellelevedygtighed at blive reduceret, når mærket med indium-111 14. Tc-99m, på den anden side er rutinemæssigt anvendes i både heste og menneskelig nuklearemedicin til at mærke perifere mononukleære blodceller og følge deres fordeling in vivo ved scintigrafi. Det kan relativt let optages af celler under anvendelse af HMPAO som et linkermolekyle til at binde technetium, som Tc-99m-HMPAO, til celler. Tc-99m-HMPAO mærkede BMMSC viser god levedygtighed og kan formere in vitro 4. Denne protokol beskriver mærkning og sporing af heste autolog BMMSC implanteret i naturligt forekommende læsioner i forben SDFT.
Det er vigtigt at bemærke, at protokollen kun er beregnet til at blive anvendt som et forskningsværktøj. Dets anvendelse som en klinisk terapeutisk modalitet anbefales ikke, da virkningen af det radioaktive på cellefænotype er ikke fuldt klarlagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De heri beskrevne tilfælde blev udført efter Etisk tilladelse fra Det Dyreetiske og Trivsel i Colegio de Veterinarios de Malaga, Spanien, og Royal Veterinary College, North Mymms, UK procedurer, der anvendes på heste, er baseret på godkendte protokoller, der er anvendes i klinikken på heste, der modtager stamceller baserede terapier som omfatter sedation, knoglemarv aspiration, intra-tendinous injektion, regional perfusion, intravenøs injektion, post-processuelle behandling og smertebehandling og overvågning efter implantation.
1. Centrale ordninger, der skal gøres på forhånd
- Søge institutionelle etik og dyrevelfærd godkendelse og overholde de lokale lovkrav før arbejdet påbegyndes.
- Søge institutionel godkendelse til at arbejde med ioniserende stråling som dikteret af lokale og juridiske regler, herunder et passende niveau for beskyttelse af personale og miljø og bortskaffelse af CONTAMnering affald.
- Brug følgende inklusions-: heste til stede med en ikke-traumatisk overanstrengelse skade (tendinopati eller desmopathy) til overfladiske flexor digitale senen af forben og læsioner resulterer i en defekt i senen, og fejlen er omgivet af intakt sene og / eller paratenon .
Bemærk: undersøgelse og diagnose for sådanne skader og den kliniske forberedelse af heste til celle implantation er blevet beskrevet andetsteds 6,15.
Bemærk: isolering og ekspansion i kultur af BMMSC stammer fra knoglemarven af heste er blevet beskrevet tidligere 6,16. Den nuværende protokol til indsprøjtning BMMSC for SDFT skader i hesten bruger 10 millioner celler pr ml 4 af autolog knoglemarvstransplantation supernatant (BMS) 16. - Brug celler, der har undergået ikke mere end 4 passager til in vivo implantation for at undgå potentiel cellulære fænotype eller genetiske ændringer forbundet med høj passage nummer calen.
- Levere det nødvendige antal celler i BMS (indenfor 24 timer i en chill boks ved 4 - 8 ° C) til dyrlægeklinik hvor celleimplantation skal udføres.
Bemærk: Den kliniske anvendelse af mesenkymale stamceller i knoglemarven supernatant er en patenteret fremgangsmåde ejet af ReCellerate Inc (USA) og dets anvendelse kan kræve autorisation.
Bemærk: Tc-99m er en gamma-emitter (140 keV) med en relativ kort halveringstid (6,0058 time, således næsten 94% af det henfalder til sin stabile form af 99Tc i 24 timer). Gamma energi gør den velegnet til detektion af gamma-kameraer (scintigrafi) og den korte halveringstid resulterer i meget begrænset strålingseksponering tid til både hest og håndteringsegenskaberne animalske personale. Denne protokol beskriver mærkningen på stedet af celler ved hjælp Tc-99m-HMPAO [HMPAO mærket med Tc-99m (som natriumpertechnetat)]. - Bestil Tc-99m frisk fra leverandøren, således at det leveres og anvendes til mærkning af celler within 2 timer af eluering fra Tc-99m-generator. Sørg for, at Tc-99m leveres som 1 GBq i en 1 ml opløsning (leverandørens standard buffer).
- Brug alle buffere ved RT. Udfør proceduren mærkning, implantation af cellerne og billedbehandling (gamma scintigrafi) i en isotop inddæmning værelse med alt udstyr rengøres med spritservietter før starten af arbejdet.
2. Forberedelse af hest og Ultralydsscanning af forben Tendon
- Optag ultralydsscanninger ved første optagelse til skade (når knoglemarv opsuges) og derefter på det tidspunkt, hvor radioaktivt mærkede celler injiceres.
- Udfør ultrasonography og celle implantation med hesten bærer vægten jævnt i en bås og under stående sedation (snarere end generel anæstesi). Administrere sedation ved anvendelse af en blanding af detomidin HCI og butorphanol tartrat, hver ved 0,01-0,02 mg / kg IV.
Bemærk: Recovery er hurtig og post-kirurgisk behandling kræver ingensærlige hensyn. - Efter perineural anæstesi anvendes (trin 2.6) i de ramte led, holde hest på stationen under sedation at reducere bevægelse af hesten under behandlingen. Visuelt kontrollere passende sedering bedømt ud fra den sænkede hoved holdning og opførsel af hesten, og at hesten er komfortabel under celle indsprøjtning og bevægelser gamma-kamera under erhvervelse af scintigrafiske billeder.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at anvende dyrlæge salve på øjne (for at forhindre tørhed), fordi under sedation blinkende påvirkes ikke, og hesten er i stand til at opretholde væskebalancen af øjnene. Overvågningen efter implantation af cellerne er non-invasive (ultralyd og gamma-scintigrafi). - Clip nøje håret overliggende senen (med hest hårklippere) Rengør derefter klippede område ved hjælp af en kombination af en klorhexidin kirurgisk krat og endelig alkohol.
- Anvend akustisk gel til området ogscan metodisk at registrere scanninger af komplette palmar metacarpal region, sekventielt mærkede niveau 1 - 7 17, med en lineær transducer (12 MHz eller lignende) for at få seriel på forekomst tværgående og langsgående billeder. Opbevar billederne digitalt, således at tværsnitsarealet og den maksimale skade zone 4 kan opnås ved hjælp af billedanalyse-software.
- Forbered området overliggende palmar nerver umiddelbart distalt for håndroden til aseptisk injektion af lokalbedøvelse for at sikre fuldstændig desensibilisering af huden overliggende senen og overfladiske digitale flexor senen. Injicer 2 ml mepivicaine både subkutant og støder op til palmar nerver (i deres sub-fascial placering) mellem bøjesenerne og opsættende ligament umiddelbart distalt for håndroden på begge sider af lemmet.
- Når den indledende scanning er udført forberede implantatstedet ved at skrubbe området med en chlorhexidin kirurgisk scrub opløsning i mindst 5 minutter og endelig alkohol med gaze. Udfør alle efterfølgende trin i en aseptisk måde.
3. Tc-99m-mærkning af Equine mesenchymale stamceller
Bemærk: De celle mærkning trin kan udføres under ultralydsscanning af forben, da dette vil minimere isotop forfald mellem celle mærkning og implantation af mærkede celler i senen.
- Fjern BMS fra cellerne, da det forstyrrer optagelsen af isotop. For at gøre dette, hente hætteglasset med BMMSC (10 millioner celler i 1 ml BMS) fra chill boksen og pelletere cellerne i en mikrocentrifuge ved 350 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten med en 18G eller 19G nål (knyttet til et 2 ml sprøjte), hvilket efterlader en lille dråbe (≤ 0,1 ml) i røret for at hjælpe celle resuspension. Gem supernatanten (BMS) i et sterilt mikrocentrifugerør og holde på is til senere genbrug.
- Resuspender cellerne i den resterende dråbe supernatant fra flIcking røret forsigtigt med fingrene (snarere end vortex) og efterlade røret i et rack ved ST. Sørg cellerne resuspenderes fuldstændigt, og at der ikke er nogen synlige celleklynger.
- Forbered Tc-99m som følger. Overfør 1 ml technetium pertechnetat i et hætteglas med HMPAO ved hjælp af en 1 ml sprøjte og kanyle. Bland forsigtigt, men grundigt og lad i 5 minutter bag bly afskærmning. Bemærk: Dette trin kan udføres, mens cellerne spinning i trin 2.1.
- Tilføj alle de Tc-99m-HMPAO ved anvendelse af en 1 ml sprøjte og kanyle til cellerne og blandes forsigtigt. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur bag blyafskærmning.
- For de næste skridt, bruge en pincet (eller et stykke silkepapir) for at åbne låget på mikrocentrifugerør at minimere isotop kontaminering af (behandskede) tommelfinger og efterfølgende andet udstyr. Anvend en 2 ml sprøjte og 21 G nål at tilføje eller fjerne vaskebuffer.
Bemærk: Brugen af et felt isotop monitor opfordres til at overvåge forurening af overflader og udstyr. Tilsæt 1 ml PBS til Tc-99m-HMPAO-celleblandingen, lukke låget, bland forsigtigt og centrifugering for at pelletere cellerne som i trin 3.1. - Fjern forsigtigt PBS til et nyt rør (gemme denne bag bly afskærmning og etiket som W1). Resuspender cellepelleten i 1 ml frisk PBS. Centrifugeres røret og fjern supernatanten som ovenfor (gemme denne og etiket som W2).
- Beregn effektiviteten af mærkning ved at måle tællingerne i W1 og W2 rør og cellepelleten. Gør dette ved at placere hver rør i et godt isotop dosiskalibrator instrument og optage radioaktiviteten som tællinger per minut (CPM). Beregn mærkning effektivitet (radioaktivitet som CPM af celler) / (Radioaktivitet af celler + supernatant) x 100.
- Udeluk cellerne grundigt i den resterende PBS, og derefter tilføje BMS reddet fra trin 3.1. Cellerne er klar til intralæsional implantation.
4. Implantation af Tc-99m-HMPAO-mærkede celler
- Intralesional implantationi senen ved hjælp af ultralyd
- Langsomt indføre en 1,5 eller 2 tommer (50 mm) 20 G nål ind i maksimal skade zone af læsionen i en langsgående orientering med ultralydstransduceren, dækket af et sterilt afdækningsstykke, i overensstemmelse med nålen, således at længden af nålen kan identificeres ved ultralydscanning og spidsen hvis nålen er nøjagtigt placeret i midten af læsionen.
- Anvendelse af passende afskærmning, indsamle cellerne i en 2 ml sprøjte (Luer-lås, for at minimere risikoen for ekstern kontaminering og i en bly-afskærmet sprøjte dækning) under anvendelse af en 20 G nål. Kassér nålen sørg for ikke at miste nogen væske. Nu lægger sprøjten med de mærkede celler på nålen forhånd placeret i senen.
- Placer ultralydsonden under nålen, så nålen tarmkanalen i vævet er klart synlig. Injicere cellerne i et langsomt, men støt tempo ind i læsionen. Sikre, at der ikke er nogen modstand mod injektion. Hvis dette er stødtforsigtigt flytte nålen ved hjælp af ultralyd. Kontroller at væsken skubbes ud ind i læsionen er synlig på ultralyd billedet som lyddødt væske indeholdende hyperechogenic luftbobler.
- Træk kanylen og straks lægge pres over kanylen hullet for at forhindre tab af injicerede celler og for at minimere spredningen af isotopen i den ydre overflade af lemmet. Umiddelbart klæde benet med et lag af autoadhesive bandage. Hesten er nu klar til gammascintigrafi. Udfør denne straks.
Bemærk: Efter injektion af cellerne i senen, erhverve en optælling af den tomme sprøjte og nål til at vurdere mulige direkte tab af celler, der kan forblive i sprøjten.
- Regional perfusion af Tc-99m-HMPAO-mærkede celler
- Følg trin 2.4.
- Påfør en 100 mm gummi tourniquet forbinding på den proksimale metacarpus med to 100 mm bomuld roll gazebind placeret medialt og lateralt.
- Aseptisk forberede the huden over den laterale palmar digital vene på niveau med den laterale proksimale sesamoid knogle ved at skrubbe området med en chlorhexidin kirurgisk krat opløsning i mindst 5 minutter og endelig med gaze vædet i alkohol. Udfør alle efterfølgende trin i en aseptisk måde.
- Forbered en 100 mm udvidelse sæt med en 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) butterfly kanyle til venepunktur ved at fylde med hepariniseret sterilt saltvand og derefter indføre nålen ind i laterale palmar digitale vene. Når venen er indtastet blod vil delvist fylde extension sæt. På Luer-lock-koblingen vedhæfte en Luer lock gummihætte for at lette efterfølgende injektion af mærkede celler.
- Fortynd MSC'er i 19 ml PBS ved at indsamle cellerne i et 20 ml sprøjte indlæst med PBS. Påfør cellerne via gummi koppen ved hjælp af en 18 G (1,2 x 40 mm) kanyle på en langsom, men stabil hastighed (30-40 sek). Skyl kateteret med 1 ml PBS indlæst i en Syringe.
- Fjern kanylen og straks lægge pres på huden over nålen hul med et lag af fem 4 x 4 bomuldsgaze. Derefter placere en let bandage med elastik lim over proksimale sesamoid området og overlade årepressen på plads i 30 min efter injektion.
- Slip tourniquet efter 30 min. Hesten er nu klar til gammascintigrafi.
Bemærk: Efter injektion af cellerne, erhverve en optælling af den tomme sprøjte og nål til at vurdere mulige direkte tab af celler, der kan forblive i sprøjten.
5. gammascintigrafi
- Scintigrafi billeder
- Acquire plane scintigrafi billeder med et gammakamera (fastsat til 140 KeV fotoelektrisk peak anvendelse af en symmetrisk vindue 20%) udstyret med en lavenergi, parallelt hul kollimator.
- Indhente alle billeder efter tid 0 på stående heste sederede som i trin 2.2. Efter tiden 0 scintigram, udskifte lyset forbinding over implantation site med en polstret forbinding. Fjern denne bandage før hver scintigrafi eksamen.
- Anskaf statiske billeder i 60 sekunder hver (256 af 256 matrix) ved hjælp af behandling software med "erhverve" - "valg undersøgelse" - "ben statiske" muligheder. Det er vigtigt, at hesten ikke bevæger sig under perioden billedoptagelsen, fordi den statiske indstillingsmulighed ikke har et modul til korrektion af bevægelse.
- For intralæsional injektion opnå laterale billeder fra læsionen området fra håndroden til den distale yderste ende, det tilsvarende areal af kontralaterale ben, venstre lunge felt og den venstre skjoldbruskkirtlen. Under erhvervelsen af forbens billeder, placere en ledende skærm mellem benene for at undgå billeddannelse af lemmet kontralaterale. Erhverve billeder på 5 min efter injektion (tid 0), og derefter ved 1, 3, 6, 12, 24, 36 og 48 timer.
- For regional perfusion, få laterale og dorsale gamma billeder som for 5.1.1.3. Anskaf billeder 5 min ofter årepresse frigivelse. Dette vil være tid 0. Det kan være nyttigt at afbilde lemmer umiddelbart efter injektion af cellerne til at vurdere tællinger før årepresse frigivelse. Opnå gamma billeder ved 1, 3, 6, 12, 24, 36 og 48 timer efter administration af cellerne.
- Efter billederne er blevet erhvervet, proces billederne manuelt ved hjælp af "behandling" valgmulighed af softwaren med optioner udvalgt til "Sokoloff" farve og "Invert" farve. Vælge Næste på "område af interesse" (ROI) og "ellipse", da dette giver mulighed for omlægning af udvælgelsen maske og bevægelse over læsionen området. Få de tæller over ROI ved at vælge "Læg i statistikken" valgmulighed. Sikre, at identisk mellemstore områder af interesse (ROI) er konstateret for hvert dyr på de forskellige tidspunkter.
- Dernæst korrigere tællingerne for den forudsagte henfald af technetium på hvert tidspunkt. Brug følgende ligning til at korrigere for forfald:A = A o e - (0.693t / T 1/2), hvor A o er det oprindelige aktivitet af isotopen, A er henfaldet korrigeret radioaktivitet ved tiden nul, t er den forløbne tid og T 1/2 er den halve -Life af isotopen. Så udtrykke de korrigerede tæller på hvert tidspunkt som en procentdel af ROI på tidspunktet 0 for at arbejde ud procentdelen af celler tilbage, ved hjælp af følgende formel:
- Acquire plane scintigrafi billeder med et gammakamera (fastsat til 140 KeV fotoelektrisk peak anvendelse af en symmetrisk vindue 20%) udstyret med en lavenergi, parallelt hul kollimator.
% celler er tilbage (t) = 100 - {[(forudsagt henfald (t) - henfald (t)) / forudsagte henfald (t)]} x 100
forfald (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tc-99m-HMPAO inkorporering i BMMSs ikke påvirker deres evne til at klæbe til vævskultur plast og mens de viser spredning evne til at danne monolag (figur 1) ikke har vi fuldt ud besluttet på, om spredning satser eller andre cellulære fænotyper er berørt. Deres morfologi ligner umærkede celler med en typisk spindel form. Den cellulære mærkning effektivitet (dvs.., Optagelse af etiketten) varierer typisk fra ca. 1,5% til 25%. Den væsentligste årsag til den lave mærkning effektivitet var relateret til den forsinkede levering af 99mTc til klinikken fra det sted, hvor Mo-99 / Tc-99m-generator er blevet elueret. Forsinkelser på over 2 timer resultere i et større fald i mærkning af cellerne. Imidlertid er tilstrækkeligt isotop inkorporeret i cellerne for at udføre gammascintigrafi i op til 36 timer (figur 2). Faktorer, der kan forbedre mærkning effektivitet er beskrevet i diskussionen.
1 (direkte ind i læsionen) eller ved regional perfusion via en digital vene 1 eller arterie 12. Intralesional implantation er mulig, når skaden er i kernen af senen og omgivet af intakte senevævet, der fungerer som en beholder for cellerne. Regional perfusion er en lettere vej til at administrere cellerne, som de er indsprøjtes i en blodåre, men metoden bygger på forventningen om, at MSC'erne er i stand til "home-in" til senen læsion. Der er begrænset dokumentation for, at MSC kan specielt hjem til steder af sener læsioner, men denne metode giver et nyttigt eksperimenterende tilgang til udvikling af applikationer, der kan øge målsøgende kapacitet MSC.
Med den intralesional levering rute, vil cellerne blive set som et fokusområde for signal, som forbliver relativt lokaliseret med tiden dvs., Er der begrænsede spread eller migrering af cellerne ind i det omgivende væv senen. Derimod vil der være en gradvis reduktion af signal med tiden på injektionsstedet, når celler administreres af regionale perfusion via den digitale palmar vene (figur 2). Det er almindeligt med intralæsional indsprøjtning for lunge felter for at være negativ, men i nogle tilfælde på de meget tidlige tidspunkter lungen kan vise isotop signal, som kan være samlingspunkt og derefter bliver mere generaliseret (Figur 3). Skjoldbruskkirtlen er fortsat negativ med denne administrationsvej. Regional perfusion tilsvarende kan vise focal signal i lungerne som så bliver mere diffus men signalet er betydeligt mere intens end den, der observeres med intralesional rute. Skjoldbruskkirtlen kan ofte viser også omdrejningspunkt signal.
Det oprindelige samlede radioisotop optælling af cellerne (tid 0, præ-injektion) og den tæller fra den oprindelige gamma scintigram på området af interesse (tid 0, post-injection), er angivet og anvendt til at beregne den procentvise nedsættelse i tællinger ved hvert tidspunkt. Dette bruges til at sammenligne den forudsagte henfald af Tc-99m fra de første tællinger (figur 4). Den beregnede kurve vil følge den forudsagte kurve. Men efter at have taget den forudsagte henfald i betragtning, persistens af celler, der forbliver i injektionsstedet efter intralæsional administration er ca. 32% (ved 12 timer) og 24% (ved 24 timer) (figur 4).
Figur 1. Cell Mærkning, Injection og gammascintigrafi (A) Overdragelse af BMMSC i en mikrocentrifuge før mærkning med Tc-99m-HMPAO bag bly-foret afskærmning (skærm og holder sprøjte) og strålebehandling overvåge og mikrocentrifuge.; (B) En portion af Tc-99m-mærkede celler HMPAO podet i en vævskulturskål viser god morphology, levedygtighed og spredning; (C) Injektion af Tc-99m-mærkede celler HMPAO ved hjælp af ultralyd i læsionsstedet af retten forben SDFT; (D) Gamma-scintigrafi af forben. Gammakameraet er anbragt præcist ved hjælp af en hydraulisk manøvredygtigt arm og enhver potentiel mærkede celler i kontralaterale ben er fjernet ved en blyafskærmning holdes mellem benene. Gamma kamera er ligeledes placeret på brystet til at overvåge lunge marken eller ved halsen for at overvåge skjoldbruskkirtlen feltet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Ultralyd og Gamma scintigrammer af SDFT. Typiske ultrasonographs af forben på midten metacarpale region i (A og (B) tværsnit. Læsionen i SDFT ses tydeligt som en hypoekkoisk område (mod toppen af scanningen) sammenlignet med den ikke skadede (normal) vævsintegritet af den dybe digital flexor senen (DDFT) støder op til og under SDFT. Området af læsionen og de relative positioner af sener er afbildet i skematisk nedenfor. Gamma scintigraphs udført ved 3, 6 og 12 timer efter injektion af radioaktivt mærkede celler er vist for de injicerede celler (C) i læsionen eller (D) ved intravenøs regional perfusion via den digitale palmar vene. I det viste tilfælde, der var optagelse af radioaktivt mærkede celler i læsionsstedet i SDFT (fuldt optrukne pile). Vedvarende optagelse af palmar digitale vene er angivet ved den stiplede pil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Gamma scintigrammer i lungerne og skjoldbruskkirtel. Typiske scanninger fra tidlige tidspunkter er vist for både intralæsional injektion og regionale perfusion af mærkede celler. Bemærk omdrejningspunktet og diffus signal i lunge- og skjoldbruskkirtlen felterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Decay radioaktivitet, der fra Regionsudvalget Interessante efter Intralæsional Injection. I denne hest blev tællinger målt fra gamma scintigrammer af SDFT løbet 36 timer efter injektion i læsionen. Venstre panel: radioaktiviteten på hvert tidspunkt blev beregnet mod tiden 0 værdi. Såatural henfald radioaktivitet af 99mTc er vist til sammenligning. Højre panel: den anslåede procentdel af celler tilbage. Dette beregnes ud fra radioaktiviteten niveauet fra regionerne af interesse. I dette tilfælde var den resterende procentdel af celler ved 24 timer omkring 24%. Vi har udført denne protokol (mærkning af MSC og implantation) på 21 heste. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ud over knoglemarv, stamceller isoleret fra kilder såsom fedtvæv er egnede til mærkning med denne protokol. Desuden kan celler fra en frossen tilstand blive genoplivet og udvidet i kultur til de ønskede tal til mærkning undersøgelser 12.
En kritisk faktor, som bestemmer effektiviteten af mærkning af BMMSC er tiden mellem eluering af Tc-99m fra molybdæn generator på radiofarmaci, fremstilling af Tc-99m-HMPAO og anvendelse af det radiofarmaceutiske i klinikken. Der er et omvendt forhold mellem mærkning effektivitet og tid efter Tc-99m eluering fra generatoren, således at forsinkelser uden denne periode væsentligt kan forringe effektiviteten af mærkningen celle. Derfor kræves tæt koordinering mellem levering af cellerne fra laboratoriet og levering af Tc-99m til klinikken på den dag, at cellerne vil være radioaktivt mærket og implanteret. Transporten tid til den kli-c er derfor en vigtig faktor. Leverandørens datablad angive, at henfald af Tc-99m reducerer renheden af den radiokemiske efter 2 timer efter eluering, der kan interferere med bindingen af HMPAO til Tc-99m og efterfølgende mængden af Tc-99m-HMPAO taget af cellerne. Vi har også bemærket, at mærkning af dyrkede celler i et laboratoriemiljø gav mere effektiv mærkning end i klinikken. Dette er også rapporteret af en anden undersøgelse hos heste 5, hvor cellerne blev mærket i et laboratoriemiljø. Hertil kommer, at vores erfaring, er mærket taget op mere effektivt af celler, der er mærket umiddelbart efter tilberedningen fra blod- eller vævsprøver sammenlignet med celler fremstillet ud fra kulturen. Men selv med lave effektivitet mærkning der er tilstrækkelig mærke bundet til cellerne for at udføre scintigrafi i 36 timer.
Kan opnås 80% for leukocytter, hvis Tc-99m anvendes fra en - mærkning virkningsgrad på 40%friske generator eluatet inden for 30 minutter, og reaktionen udføres i et lille volumen (1 - 0,5 ml) 18. Mærkning virkningsgrad på 47% - 71% er nået for equin MSC'er 19 demonstrerer, at det er muligt at øge mærkning effektivitet MSC'er under ideelle betingelser.
Vi rutinemæssigt implantatet 20 millioner celler til behandling af SDFT centrale læsioner selv op til 40 millioner celler er blevet implanteret for de største læsioner. Et lignende antal celler kan implanteres via regional perfusion Selv om denne metode ikke er almindeligt anvendt på grund af den mere komplekse procedure. Dog kan det være nyttigt for læsioner, som strækker sig til periferien af senen overflade med forventning om, at tilstrækkelige celler hjem ind i læsionen. Sporing af cellerne ved gammascintigrafi kan give nyttige oplysninger om flytning af celler, der administreres af forskellige ruter. I denne protokol, de celler, implanteret af intralesional rute er mostly tilbageholdt på injektionsstedet ved intralæsional vej. Kan observeres radioisotop signal i lungefelterne i nogle tilfælde, men det fremgår generelt, at der er meget lidt migration af celler væk fra læsionsstedet. Levering af BMMSC af det regionale perfusion antyder, at der kan være lagring af celler ved skadestedet, men når de leveres ved intravenøs injektion 4 har vi ikke observeret homing af cellerne. Tc-99m-HMPAO label påvirker ikke cellerne migration evnen 20, og som Tc-99m-HMPAO internaliseres af cellerne og opbevares i cytoplasmaet, er det usandsynligt at interferere med adhæsionsegenskaber.
Beregningen af signalet fra områder af interesse kan være en undervurdering, da det er muligt, at der kan være betydelig dissociation af etiketten fra celler (frigivet fra døde celler eller andre mekanismer for frigivelse fra levende celler). Skjoldbruskkirtlen fanger fri isotop (Tc-99m) frigivet fra døde eller døende celler, og Tc-99m-HMPAO kan elimineres af nyrerne og tarmen. Disse væv kunne overvåges ved gammascintigrafi at vurdere potentielle tab af etiketten.
Proceduren cellemærkning kan tilpasses til at teste celle fastholdelse og optagelse på forskellige sites (organer og skade) ved hjælp af forskellige levering ruter. Omdrejningspunktet natur af signalet i lungerne kan være et tegn på celleaggregater som formentlig slå op med tiden eller ind cellelyse. Skjoldbruskkirtlen, som indfanger gratis isotop, viser formentlig en stigning i optag efter regionale perfusion, fordi de injicerede celler og deraf følgende rester fra døde celler har en mere tilgængelig rute til skjoldbruskkirtlen via cirkulationen. Selv om kun omkring 24% af celler tilbage efter 24 timer, intralesional vej ind i senen er den mest effektive indgivelsesvej, da de fleste tilfælde viste ingen frie Tc-99m i skjoldbruskkirtlen. Oplysninger indhentet fra at udnytte sådanne protokoller kan informere fremtidige udformning og udvikling af stamceller applikationer til more effektive kliniske behandlinger.
Cellen mærkning protokol blev tilpasset til anvendelse i hest fra Tc-99m-mærkning af HMPAO leukocytterne i humane medicinske anvendelser. Dens anvendelse i denne protokol demonstrerer anvendelighed i et stort dyr, hos hvilket sener sygdom opstår spontant til undersøgelser af cellebaserede behandlingsformer. Rekrutteringen af kliniske tilfælde kan bidrage til at udligne de højere omkostninger forbundet med at arbejde med en større dyr. Fremgangsmåden til anvendelse som et billeddannende modalitet mærkning er blevet beskrevet i små dyremodeller 21 og vi mener, at protokollen tilsvarende kan anvendes i større dyr såsom får til undersøgelser af andre sene- sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
