Abstract
Die embryonale Niere von Xenopus laevis (Frosch), die pronephros, besteht aus einem einzigen Nephron, und kann als ein Modell für eine Nierenerkrankung verwendet werden. Xenopus - Embryonen sind groß, entwickeln außen und leicht durch Mikroinjektion oder chirurgische Verfahren manipuliert werden können. Darüber hinaus wurden für die frühen Xenopus - Embryonen Schicksal Karten hergestellt. Gezielte Mikroinjektion in den einzelnen Blastomeren, die Anlass schließlich zu einem Organ oder Gewebe von Interesse geben kann selektiv verwendet werden, um überexprimiert oder knock down Genexpression in diesem begrenzten Bereich, sinkende Nebenwirkungen in den Rest des sich entwickelnden Embryos. In diesem Protokoll beschreiben wir , wie etabliert Xenopus Schicksal Karten verwenden , um die Entwicklung von Xenopus Niere (die pronephros), durch Mikroinjektion in spezifischen Blastomere von 4- und 8-Zellembryos zu zielen. Die Injektion von Lineage Tracer ermöglicht die Verifizierung der spezifischen Ausrichtung der Injektion.Nach Embryonen entwickelt haben, 38 auf die Bühne - 40, ganz-mount Immunfärbung verwendet pronephric Entwicklung sichtbar zu machen, und der Beitrag von Zellen gezielt zu den pronephros beurteilt werden kann. Die gleiche Technik kann andere Gewebetypen angepasst werden, um den pronephros zusätzlich zu zielen.
Introduction
Die Xenopus embryonale Niere, die pronephros, ist ein gutes Modell der Nierenentwicklung und Krankheit zu studieren. Die Embryonen entwickeln extern, sind groß, in großen Stückzahlen hergestellt werden und werden durch Mikroinjektion oder chirurgische Eingriffe leicht manipulierbar. Darüber hinaus werden die Gene regeln Nierenentwicklung in Säugetieren und Amphibien konserviert. Mammalian Nieren Fortschritte durch drei Phasen: die pronephros, Mesonephros und metanephros 1, während der embryonalen Amphibien haben ein pronephros und erwachsene Amphibien haben ein metanephros. Die grundlegende Filtereinheit dieser Nierenformen ist das Nephron, und beide Säugetiere und Amphibien benötigen , um die gleiche Signalkaskaden und induktive Ereignisse 3 Nephrogenese 2, zu unterziehen. Die Xenopus pronephros einen einzigen nephron enthält proximaler zusammengesetzt, Zwischen-, distalen und Anschluss Tubuli, und eine Glomus (analog dem Säuger Glomerulus) 1, 4-6 (1 Xenopus pronephros macht es geeignet als einfaches Modell für die Untersuchung von Genen in Nierenentwicklung und Krankheitsprozessen beteiligt.
Zellschicksal Karten wurden für frühen Xenopus - Embryonen hergestellt und sind frei im Internet unter Xenbase 7-11 zur Verfügung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Mikroinjektion von Lineage Tracern , die Entwicklungs Xenopus pronephros zu zielen, wobei die gleiche Technik angepasst werden kann , andere Gewebe zu zielen, wie das Herz oder die Augen. Lineage Tracern sind Etiketten (einschließlich Vitalfarbstoffen, fluoreszierend markierte Dextrane, histochemisch nachweisbare Enzyme und mRNA kodiert, fluoreszierende Proteine), die in einem frühen Blastomere injiziert werden kann, so dass die Visualisierung der Nachkommen dieser Zelle während der Entwicklung. Dieses Protokoll nutzt MEM-RFP - mRNA, die Codierung Membran rot fluoreszierendes Protein 12 als Linie Tracer gezielt. Die gezielte Mikroinjektions techniken für einzelne Blastomeren in 4- und 8-Zellen-Embryonen hier beschriebene zur Injektion mit Morpholinos genutzt werden, um knock down Genexpression oder mit exogenen RNA ein Gen von Interesse überexprimiert. Durch die Injektion in die Bauch, pflanzliche Blastomere, in erster Linie die pronephros des Embryos wird gezielt werden, die kontralateralen pronephros als Entwicklungskontrolle verlassen. Co-Einspritzen eines Tracers verifiziert, dass der korrekte Blastomere injiziert wurde, und zeigt, welche in der Embryogeweben ergaben sich aus dem injizierten Blastomere, Verifizieren der pronephros Targeting. Immunostaining der pronephros ermöglicht die Visualisierung, wie gut die pronephric Tubuli gezielt wurden. Überexpression und Zuschlags Effekte können dann auf die Gegenseite des Embryos erzielt werden, die als Entwicklungskontrolle dient und verwendet werden kann , die pronephric Index 13 zu berechnen. Die Verfügbarkeit von Zellschicksal Karten ermöglicht diese gezielte Mikroinjektionstechnik verwendet werden, an Zielgewebe other als die pronephros und Co-Injektion eines fluoreszierenden Indikators erlaubt die gezielte Mikroinjektions zu jedem Gewebe vor der Analyse überprüft werden.
Während der Embryomikroinjektions sollte Entwicklungstemperatur fest geregelt werden, da die Rate der Xenopus Entwicklung auf sie stark abhängig ist 14. (- 16 ° C 14) 4- und 8-Zellinjektionen, da die Entwicklungszeit verlangsamt Embryonen bei kühleren Temperaturen inkubiert werden. Bei 22 ° C, die Entwicklungszeit von Stufe 1 (1 Zelle) auf Stufe 3 (4 Zellen) beträgt etwa 2 Stunden, während bei 16 ° C Entwicklungszeit zu Stufe 3 ca. 4 Stunden. Es dauert etwa 15 Minuten von einem 4-Zellen-Embryo zu einem 8-Zellen (Stufe 4) Embryo bei 22 ° C zu gehen, aber dauert etwa 30 Minuten bei 16 ° C. In ähnlicher Weise bei 22 ° C, dauert es nur 30 Minuten für eine 8-Zell-Embryo zu einem 16-Zellen-Embryo (Stufe 5) fortzuschreiten. Diese Zeit wird bei 16 ° C auf 45 Minuten erhöht. Dasrefore, ist es nützlich, um die Entwicklungsrate der Embryonen zu verlangsamen, an der 8-Zellen-Stadium für Injektionszwecke ausreichend Zeit zu ermöglichen, bevor die Embryonen auf die Bühne 16-Zelle fortzuschreiten. Außerdem können Wachstumstemperaturen moduliert werden embryonale Entwicklung zu beschleunigen oder zu verlangsamen, bis die Niere vollständig entwickelt hat.
Die Epidermis der Kaulquappe stufigen Xenopus - Embryonen ist relativ transparent, erlaubt eine einfache Abbildung der Entwicklung pronephros ohne Dissektion oder Lichtung des Gewebes 15. Aufgrund der relativen Transparenz von Xenopus - Embryonen ist die Abbildung lebender Zellen auch denkbar , 16,17. Whole-mount die pronephros zu visualisieren immunostaining ist möglich , mit etablierten Antikörper, die die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs Tubuli der Stufe 38 beschriften - 40 Embryonen , die für die Beurteilung der pronephric Entwicklung ermöglichen nach Manipulation der Genexpression gezielt in Xenopus - Embryonen 18-20.
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Protocol
(: HSC-AWC-13-135-Protokoll #) Das folgende Protokoll wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, das dient als Institutional Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Identifizierung und Auswahl von Blastomeren für Injektionszwecke Nieren-bezogenen
- Vor der Embryonen zu erzeugen, verwenden Sie die normale Tabelle der Xenopus - Entwicklung 21 , um die Ausrichtung der ersten Zellteilungen im Embryo zu verstehen. Alternativ Zugriffsdiagramme der frühen Entwicklungsstadien von Xenopus auf Xenbase 11.
- Zugriff auf die interaktive Xenopus Zellschicksal Karten auf Xenbase 11 zu wählen , welche Blastomere für Mikroinjektionsausgerichtet sein.
- Beachten Sie, dass die einzelne Zelle Embryo eine dunkel pigmentierte Tier Pol und einen vegetativen Pol, der weiß und yolky ist. Beachten Sie, dass eine Schutzmembran, wie die Dotter e bekanntnvelope, deckt den Embryo.
- Beachten Sie, dass die erste Spaltungs typischerweise zwischen den linken und rechten Seite des Embryos erfolgt. Diese Zellen tragen gleichermaßen zur pronephric Linie.
- Man beachte, dass die zweite Spaltungs die dorsale und ventrale Hälften des Embryos aufteilt, mit einem 4-Zellen-Embryo führt. Die dorsale Zellen sind kleiner und haben weniger Pigment als die ventralen Zellen (2A und 3A).
- Identifizieren der ventralen Blastomeren (V, die große, dunkle Zellen) auf der linken und rechten Seite, die mehr auf die Entwicklung von Nieren als der dorsal beitragen (D; kleine, leichte Zellen) Blastomeren (2A).
- Wenn in ein 4-Zellen - Embryo eingespritzt wird , injizieren die linke ventrale Blastomere der linken Niere (3A und Abschnitt 3) zu richten.
- Die dritte Spaltungs halbiert den animalen und vegetativen Seiten, was zu einer Acht-Zellen-Embryos. An diesem Punkt gibt es vier Tier Blastomeren [linke und rechte ventrale(V1) und dorsal (D1)] und vier vegetabile Blastomeren [linke und rechte ventrale (V2) und dorsal (D2)] (2B und 3B).
- Suchen Sie die ventralen, pflanzliche Blastomeren (V2). Diese Blastomeren tragen mehr zur Entwicklung von Nieren alle anderen Zellen in dieser Phase (2B). Um die linke Niere eines 8-Zellen - Embryo Ziel, spritzen in die linke V2 Blastomere (3B und Abschnitt 3).
- Beachten Sie, dass die vierte und fünfte cleavages die tierischen und pflanzlichen Blastomeren bisect. Zwei Nachkommen werden von jedem Blastomere erzeugt, was zu einer 16-Zellen-Embryo. Die Zellen werden nach ihrem Vorgänger benannt. Beispielsweise gibt der V2 Blastomere von der 8-Zellen - Stadium zur V2.1 und V2.2 Nachkommen im 16-Zell - Stadium (Abbildung 2C). Die Zelle V2.2 an der 16-Zell-Stadium stellt die Mehrheit der beitragenden Zellen zu der Entwicklungs Niere.
- Die dargestellten sechsten und siebten cleavages resultieren in einem 32-Zellen-embryO. Auch hier sind zwei Nachkommen aus jeder Blastomere erzeugt, die im Anschluss an ihre Vorgänger benannt sind. Zum Beispiel gibt der Blastomere V2.2 aus dem 16-Zellen-Stadium zur V2.2.1 und V2.2.2 im 32-Zell-Stadium. Es gibt eine Alternative Benennungssystem im 32-Zell-Stadium, in dem Zellen in vier Reihen als A, B bezeichnet sind, C und D (von Tier zu vegetabile) und in vier Spalten 1, 2, 3, und 4 ( von dorsal nach ventral). Somit ist die V2.2.2 Blastomere, die am meisten zu den Entwicklungs pronephros trägt, wird C3 unter dieser alternativen Benennungssystem (2D) genannt.
2. Herstellung von Embryonen
- Vorbereitung 50 ml Dejelly Lösung (2% Cystein, NaOH auf pH 8,0).
- Isolieren Sie beide Hoden von einem einzigen männlichen Frosch nach Standardprotokollen 14. Legen Sie die Hoden in einer 60 mm Petrischale gefüllt mit 10 ml Testes - Storage - Lösung (1x Marc-modifiziertem Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% Rinderserumalbumin, 50 ug / ml Gentamycin). Lagern Sie die Hoden bei 4 ° C.
Hinweis: Testes kann für etwa 7 gespeichert werden - 10 Tage bei 4 ° C, aber Befruchtungseffizienz abnimmt, je länger die Hoden gespeichert wurden. - Drücken Sie einen weiblichen Froscheier zu erhalten , nach Standardprotokollen 14. Sammeln Sie die Eier in einer 100 mm Petrischale. Gießen Sie überschüssiges Wasser ab.
- Schneiden Sie ¼ eines Hodens aus, während es in Testes-Storage-Lösung ist Zange und mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie das Stück Hoden in die Petrischale mit Eiern. Passen Sie die Größe des Abschnitts Hodens zu Konto für die Größe des Hodens verwendet, wie lange der Hoden gespeichert ist, und wie viele Eier sind befruchtet werden. Im Allgemeinen verwenden ¼ bis 1/3 eines frisch seziert Hoden ein Gelege zu befruchten.
- Schneiden Sie den Hoden Teil in kleine Stücke mit einer Pinzette und eine Rasierklinge. Fügen Sie genug 0.3x MMR+ 30 mg / ml Gentamycin in die Petrischale um die Eier zu bedecken. Schwenken Sie die MMR in der Schale zu mischen.
- Warten Sie ca. 30 Minuten für die Befruchtung bei Raumtemperatur zu nehmen. Beachten Sie, dass das Tier Hemisphäre (die pigmentierte Seite des Embryos) auf der Oberseite des Embryos auf wirksame Befruchtung sitzen. Entfernen Sie dann die MMR aus der Petrischale eine Transferpipette. Fügen Sie genug Dejelly Lösung in die Schale, die Embryonen zu decken.
- In den nächsten paar Minuten, vorsichtig schwenken die intermittierend Gericht. Heftigem Schütteln der Schale zu diesem Zeitpunkt kann Achse Defekte verursachen. Die Gallerthülle auf den Embryonen wird sich auflösen, und die Embryonen werden während wirbeln in der Mitte der Schale versammeln. Sobald die Embryonen eng einander in der Mitte der Schale zu berühren, entfernen Sie die Dejelly Lösung mit einer Transferpipette. Lassen Sie keine Embryonen in der Dejelly Lösung für länger als 5 Minuten, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt.
- Waschen Sie die dejellied Embryonen 3-5 mal in 0.3xMMR + 30 mg / ml Gentamycin durch vorsichtiges Gießen oder Abpipettieren des MMR und die Schale mit neuen MMR füllen. Nicht alle der MMR von der Schale zu entfernen, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt.
- Entfernen Sie alle unbefruchteten Eiern oder Stücke von Hoden aus der Petrischale eine Transferpipette.
- Inkubieren Embryonen zwischen 14 und 22 ° C.
Hinweis: Die Embryonen bei niedrigeren Temperaturen gewachsen entwickeln langsamer als Embryonen bei höheren Temperaturen gewachsen. Zeitpunkt der Entwicklungsstadien auf Xenbase 22 zu finden.- Um Platz aus ihrer Entwicklung, Platz Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in einer Petrischale gehalten bei 14 ° C, und die andere Hälfte der Embryonen in einer Petrischale gehalten bei 18 ° C. Dies ermöglicht zwei Sätze von Injektionen in 4-Zellen-oder 8-Zellen-Embryos aus einer einzigen Befruchtung.
3. Herstellung von Injektionslösungen und Mikroinjektion von Embry
- Bereiten Sie die Injektionslösung, die 0,01ng / nl membrangebundenen rot fluoreszierendes Protein (MEM-RFP) mRNA 9 , während sich die Embryonen im 4-Zellen - oder 8-Zell - Stadium entwickeln. Lagern Sie die Injektionslösung auf Eis, bis die Injektion bereit.
- Legen Sie eine 7 "Ersatz Glaskapillarrohrs in eine Nadel Abzieher, mit der Spitze des Ersatzröhre mit der Spitze der Nadel Abzieher Fall ausgerichtet ist. Stellen Sie die Hitze # 2-Wert bis 800 und der Pull-Wert auf 650. Drücken Sie die" ziehen ", um die Nadel zu ziehen. Dies erzeugt zwei Nadeln aus einer einzigen 7" Glaskapillarrohrs.
- Snip die Spitze einer Nadel gezogen mit einem Paar von Dumont Zange ab.
Hinweis: Nach der Nadel ziehen, wird die Spitze dicht verschlossen und muss aufgeschnitten werden. Je näher an der Spitze der Nadel, die es geschnitten wird, je kleiner der Durchmesser der Nadelspitze ist. Obwohl der Durchmesser der Spitze nicht das Injektionsvolumen mit dem Mikroinjektionssystem hier verwendet beeinflussen, eine Spitze mit einem größeren Durchmesser ist wahrscheinlicher, den Embryo zu beschädigen. - Schieben Sie die micropipette Spannzange auf die Rückseite der Nadel. Als nächstes schieben Sie die große Loch O-Ring hinter der Spannzange der Nadel auf der Rückseite.
- Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl mit einer 27-Gauge-Injektionsnadel verwenden, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen in der Nadel zu bekommen.
- Schieben Sie die Nadel auf den Kolben der Mikroinjektors, die Nadel in das große Loch der weißen Plastikabstandhalter auf dem Kolben installiert Sitz. Der Kolben sollte einen kleinen O-Ring am nächsten zu dem Körper des Mikroinjektors, gefolgt von den weißen Abstandhalter, großes Loch O-Ring und Spannzange. Befestigen Sie die Nadel durch die Spannzange festziehen. Ziehen Sie vorsichtig an der Nadel, um sicherzustellen, dass es richtig gesichert ist.
- Drücken und halten Sie die "leere" -Taste auf der Mikroinjektors Steuerbox, bis zwei Pieptöne sind.
- Pipette 3 ul Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Legen Sie die Spitze der Nadel in die Perle der Injektionslösung auf dem Parafilm. Drücken und halten Sie die "füllen" -Taste auf der microinjector Kontrollkästchen, um die Injektionslösung in die Nadel zu ziehen.
- Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit 500 Mikron Polyester ausgekleidet Netz mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin. Sorgfältig pipettieren 20-30 April-Zell-oder 8-Zellen-Embryonen in die Schale.
- Verwendung einer Haarschleife 14, manipulieren die Embryonen so dass die Blastomere einzuspritzen ist die Nadel gegenüber . Zur Ausrichtung auf die linke Niere, richten Sie die Embryonen, so dass die linke ventrale Blastomeren von 4-Zellen-Embryonen oder links V2 Blastomeren von 8-Zellen-Embryonen, die Nadel stellen.
- Einzuspritzen 10 nl der Injektionslösung in den ausgewählten Blastomere von jedem Embryo in der Schale.
Hinweis: Das Gitter am Boden der Petrischale stabilisiert die Embryonen und verhindert, dass sie rollen, so dass sie für die Stabilisierung ohne die Verwendung eines Haarschleife injiziert werden. - Transfer Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte eingespritzt, die mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin gefüllt wurden. Inkubieren des injizierten Embryos bei 16 ° C für mindestens eine Stunde, um die injizierte Blastomere zu erlauben, zu heilen.
- Übertragen Sie die geheilt Embryonen in die Vertiefungen einer neuen Kulturplatte, die mit 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin von Stufe 9 (vor der Gastrulation) gefüllt wurden.
- Inkubieren Sie die Embryonen bei 14 bis 40 21 - 22 ° C , bis die Embryonen Stufe 38 erreichen.
4. Fixierung und Immunfärbung von Embryonen
- Vorbereitung 50 ml MOPS / EGTA / Magnesium sulfat / Formaldehyde Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (v / v) Formaldehyd].
- Mit Hilfe einer Transferpipette, setzen 10 - 20 Stufe 38 bis 40 Embryonen in einem Glasfläschchen. Fügen Sie 10 & mgr; l 5% Benzocain in 100% igem Ethanol in das Fläschchen und invert Phiole zu mischen. Warten Sie 10 min, die Embryonen zu betäuben.
- Entfernen Sie die MMR aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Wenn mehrere Ampullen gleichzeitig Verarbeitung können die Phiolen aufrecht in einer Platte mit 24 Vertiefungen Zellkultur gehalten werden.
- Mit einem Glasrohrtte, füllen Sie das Fläschchen mit MEMFA. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die MEMFA aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Füllen Sie das Fläschchen mit 100% Methanol. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal, und speichern Sie die Embryonen in 100% Methanol über Nacht bei -20 ° C.
- Vorbereitung 1x Phosphate Buffered Saline-Rinderserumalbumin-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100.
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum mit einem 1: 5 - Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörper 4A6 (zu etikettieren die Membranen der Zwischen, distalen und Verbindungs Tubuli 20), eine 01.30 Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörpers 3G8 (zu Etikett Lumen der proximalen Tubuli 20) und einer 1: 250 Verdünnung von Kaninchen - polyklonalen Antikörper RFP (um die MEM-RFP - Tracer - Label). Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie die secondary-Antikörper-Lösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum, 1: 500 Alexa 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (Stammkonzentration 2 mg / ml; beschriften 4A6 und 3G8) und 1: 500 Alexa 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Lager Konzentration 2 mg / ml; die MEM-RFP-Tracer zur Markierung). Lagerung bei 4 ° C, für den Schlauch in Folie vor Licht zu schützen.
- Alternativ sammeln die primären und sekundären Antikörper nach der Färbung, und in zukünftigen Experimenten bei 4 ° C zur Wiederverwendung speichern. Wenn der Antikörper zur Wiederverwendung gespeichert werden soll, fügen Sie 0,01% Natriumazid.
- Immunostain die Embryonen etablierten Protokollen unter Verwendung von 18.
5. Visualisierung von Embryonen und Analyse von Zielgerichtete Pronephric Tissue
- Bildschirm, um die immunhistochemisch Embryonen zu überprüfen, ob die korrekte Blastomere durch Betrachten der Fluoreszenz des Tracers unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei 1X injiziert wurde (zu sehen ganze Embryo) und D5 (zu sehen Niere) Vergrößerung. Platz Embryonen in einer Multi-Well-Glasplatte mit dem wirlls gefüllt mit 1x PBT einer Transferpipette mit der Spitze mit abgeschnitten. Manipulieren die Embryonen mit einer Haarschleife. Nur Embryonen , die die co-injizierten Tracer , die in den pronephros auf der linken Seite des Embryos (3C, F und 4C, F) für die Gen - Überexpression oder Zuschlagsanalyse haben.
- Alternativ deaktivieren Sie die Embryonen in Murrays Clear (2 Teile Benzylbenzoat: 1 Teil Benzylalkohol) durch die Embryonen in einem Glasfläschchen und das Fläschchen mit Murrays Klar füllen. Visualisieren Sie die Embryonen ein Glas-Well-Platte verwendet wird.
Hinweis: Murray Clear ist ein organisches Lösungsmittel, und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Handschuhe tragen, und verwenden Sie nur Glasfläschchen und Pipetten mit Murrays Clear. - Store Embryonen bei 4 ° C in 1x PBT für 2 - 3 Wochen. Für die Langzeitlagerung von Embryonen, dehydratisieren die Embryonen durch zweimal in 100% Methanol bei Raumtemperatur für 10 min gewaschen. Speichern der Embryonen bei -20 ° C in 100% Methanol.
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Representative Results
Mikroinjektionen von 4- und 8-Zell Xenopus - Embryonen mit MEM-RFP mRNA zeigen verschiedene Ebenen zu den pronephros Targeting. 4 zeigt Stufe 40 Embryonen mit korrektem MEM-RFP mRNA Expressionsmuster. Embryos wurden in der linken ventral Blastomere (4A), und sortiert die richtige Expressionsmuster von MEM-RFP mRNA injiziert. Zusätzlich MEM-RFP im proximalen zum Ausdruck zu bringen, Zwischen- und distalen Tubuli der Niere, richtig injizierten Embryonen verbinden, werden erwartet Fluoreszenz zeigen, in der Epidermis des Kopfes, Rumpf und Schwanz. Sie sollten auch Fluoreszenz zeigen in der otocyst, Zement Drüse, Proctodaeum und Somiten (4C). Die Verteilung der MEM-RFP - Fluoreszenz in den Nieren von 8 richtig injizierten Embryonen wurden mit einem Fluoreszenzstereomikroskopes (4B) bestimmt. Embryos mit hoher MEM-RFP-Expression in der Epidermis, dassdie Erkennung von Nierenregionen blockiert wurden als "verschlossen" erzielt. MEM-RFP-Expression wurde in dem proximalen erkannt, Zwischen- distalen und Verbindungsröhrchen aller Embryonen, die waren nicht so verschlossen erzielt. Stereoskop (4D-F) und konfokale Mikroskope (4G-I) wurden verwendet , um die Co-Lokalisierung von MEM-RFP und Nierengewebe mit 3G8 und 4A6 immunhistochemisch zu verifizieren. Konfokale Bildgebung überprüft die Co-Lokalisierung von MEM-RFP mit dem proximalen, mittleren und distalen Verbindungs Tubuli der Niere, was darauf hinweist, dass die Mikroinjektion von MEM-RFP in den linken Bauch Blastomere korrekt die Niere ausgerichtet ist.
Embryos injiziert mit MEM-RFP mRNA an der 8-Zellen - Stadium (5A) zeigen einen engeren Bereich von Geweben anzeigt Fluoreszenz, die anzeigt , dass 8-Zellinjektionen das Potential für Nebenwirkungen auf die Niere zu reduzieren. Wie Embryonen im 4-Zellen injiziert Stufe embrYos an der 8-Zellen - Stadium zeigen Fluoreszenz im proximalen injiziert, Zwischen- und distalen Verbindungs Tubuli der Niere sowie die Somiten und Proctodaeum (5C-F). Anders als Embryonen im Stadium 4-Zellen injiziert, die Zementdrüse und otocyst nicht mit MEM-RFP bezeichnet. Von 10 richtig gezielt Embryonen zeigten ein Embryo MEM-RFP in fast allen der proximalen Tubuli und 3 zeigte MEM-RFP in fast allen der Zwischen- und distalen Tubuli der Niere (5B). Die Verbindungs Tubuli von 7 Embryonen wurden teilweise mit MEM-RFP bezeichnet. Darüber hinaus wurden die Nieren von Embryonen bei der 8-Zellen-Stadium injiziert leichter sichtbar zu machen, und nur einer als okkludiert erzielt. Co-Lokalisierung von MEM-RFP und Antikörper Markierung der Niere (3G8 und 4A6) wurde unter Verwendung eines Stereomikroskops (5D-F) bestimmt und überprüft ein konfokales Mikroskop (5G-I) verwendet wird . Der proximale, mittlere und distale Verbindungs tuBules der Niere wurden mit MEM-RFP in Embryonen im 8-Zell-Stadium, was zeigt, injiziert gekennzeichnet, dass die Injektion des V2 Blastomere gezielt die Niere Etiketten während Fluoreszenz anzeigt in weniger Gewebe als Embryonen in der linken ventral Blastomere in der 4-Zellen injiziert, Stufe.
Dieser Test macht von einer fluoreszenz mRNA als Tracer markiert, um anzuzeigen, welche Gewebe durch gezielte Mikroinjektions wurden. Es ist wichtig , Embryonen für die konsequente Tracer Lokalisierung vor der Analyse zu screenen, und alle Embryonen , die nicht die erwartete Tracerverteilungsmuster angezeigt werden muss verworfen werden. Abbildung 6 ein Beispiel einer Stufe 40 Embryo zeigt , die fälschlicherweise mit MEM-RFP - mRNA wurde gezielt an die 4-Zellen-Stadium. MEM-RFP - mRNA - Expression ist auf der rechten Seite des Embryos sich anstelle der linken Seite (6A). Darüber hinaus ist der größte Teil der mRNA-Expression in der Haut des unteren Rumpf und Schwanz, mitwenig Ausdruck in den Somiten. Keine mRNA - Expression in der proximalen, mittleren und distalen Verbindungs Tubuli (6B), was bestätigt , unsachgemäße Ausrichtung der Niere gesehen. Daher sollte diese Embryos nicht für die Analyse verwendet werden.
Abb . 1: Xenopus Embryonic Kidney Diagram der Niere einer Stufe 35 Xenopus Embryo, welche die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs Tubuli. Basierend auf Raciti et al. (2008) 6. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Xenopus Embryonale Fate Maps. Fate Karten zu identifizieren und die Blastomeren Namensgebung, die auf die Entwicklung von pronephros beitragen. A) Das Schicksal Karte eines 4-Zellen-Embryo. B) Das Schicksal Karte von einem 8-Zellen Embryo. C) Fate Karte eines 16-Zellen-Embryos. D) Fate Karte eines 32-Zellen-Embryos. Blastomeren der 32-Zell-Embryo sind auch unter Verwendung eines alternativen Blastomere Benennungssystem gekennzeichnet. Fate Karten basierend auf Moody (1987) 8, 9 und Moody und Kline (1990) 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Injektionsschema für Targeting der Xenopus Pronephros Rote Pfeile zeigen die Zelle zu injizieren. A) Tier und ventralen Ansichten eines 4-Zellen-Embryo zeigt Injektion des linken ventralen blastomere über die linke Seite pronephros Ziel. Rote Pfeile zeigen die linke ventrale Blastomere. B) Tier und ventralen Ansichten eines 8-Zellen-Embryos zeigt Injektion des linken V2 Blastomere der linken pronephros abzuzielen. Rote Pfeile zeigen die links V2 Blastomere. AB) Bilder auf einem Stereoskop mit 4-facher Vergrößerung aufgenommen Embryonen. Injections basierend auf dem Xenopus Schicksal entwickelte Karten von Moody (1987) 8, 9 und Moody und Kline (1990) 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Mit MEM-RFP - mRNA als Tracer Beispiele für Embryonen im Stadium 4-Zellen - Targeted immunogefärbten Stufe 40 Xenopus - Embryonen gezielte Injektion in die linke pronephros im Stadium 4-Zellen zeigt. MEM-RFP-EtikettenZellmembranen rot. A) schematische Darstellung Injektion von MEM-RFP-mRNA in den linken Bauch Blastomere eines 4-Zellen-Embryos. B) Gewebe Lokalisierung von MEM-RFP-Fluoreszenz in den Nieren richtig injizierten Embryonen. C) Stufe 40 Embryo mit MEM-RFP im linken ventralen Blastomere im Stadium 4-Zellen injiziert. MEM-RFP-Lokalisierung wird in rot dargestellt, während die Niere grün markiert. 1-fache Vergrößerung. D) Kidney gefärbt mit 3G8 das Lumen der proximalen Tubuli zu etikettieren und 4A6, die Membranen der Zellen in den Zwischen, distal und Verbinden Tubuli zu etikettieren. 5fache Vergrößerung. E) Die Erweiterung der Region über die Niere zeigt MEM-RFP-Lokalisierung. 5fache Vergrößerung. F) zusammengefügte Bild mit der Niere Co-Lokalisation des MEM-RFP-Tracer zeigt. 5fache Vergrößerung. CF) Bilder mit einer Olympus DP71 Kamera auf einem Stereoskop genommen Embryonen. G) konfokale Bild der Niere eines zweiten Embryo gefärbt mit 3G8 und 4A6. H) Lokalisierung von MEM-RFP in der Niere und des umgebenden Gewebes. I) zusammengefügte Bild shoFlügel Colokalisierung von MEM-RFP, 3G8, 4A6 und in der Niere. GI) Konfokalbilder maximale Projektion bei 20 - facher Vergrößerung verwendet wird . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Mit MEM-RFP - mRNA als Tracer Beispiele für Embry an der Stage 8-Zellen - Targeted immunogefärbten Stufe 40 Xenopus - Embryonen gezielte Injektion in die linke pronephros auf der Stufe 8-Zellen zeigt. MEM-RFP-Etiketten Zellmembranen rot. A) schematische Darstellung Injektion von MEM-RFP-mRNA in den linken V2 Blastomere eines 8-Zellen-Embryos. B) Gewebe Lokalisierung von MEM-RFP-Fluoreszenz in den Nieren richtig injizierten Embryonen. C) Stufe 40 Embryo mit MEM-RFP im linken V2 Blastomere auf der Stufe 8-Zellen injiziert. MEM-RFP-Lokalisierung wird gezeigtin rot, während die Niere grün markiert. 1-fache Vergrößerung. D) Kidney gefärbt mit 3G8 das Lumen der proximalen Tubuli zu etikettieren und 4A6, die Membranen der Zellen in den Zwischen, distal und Verbinden Tubuli zu etikettieren. 5fache Vergrößerung. E) Die Erweiterung der Region über die Niere zeigt MEM-RFP-Lokalisierung. 5fache Vergrößerung. F) zusammengefügte Bild mit der Niere Co-Lokalisation des MEM-RFP-Tracer zeigt. 5fache Vergrößerung. CF) Bilder mit einer Olympus DP71 Kamera auf einem Stereoskop genommen Embryonen. G) konfokale Bild der Niere eines zweiten Embryo gefärbt mit 3G8 und 4A6. H) Lokalisierung von MEM-RFP in der Niere und des umgebenden Gewebes. I) zusammengefügte Bild zeigt die Co-Lokalisierung von MEM-RFP, 3G8 und 4A6 in der Niere. GI) konfokale Bilder mit maximaler Projektion bei 20facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Beispiel der Embryo in der 4-Zellen - Stadium falsch gezielte immunogefärbten Stufe 40 Xenopus Embryo zeigt eine falsche Ausrichtung der linken pronephros in der 4-Zellen - Stadium mit MEM-RFP - mRNA als Tracer.. MEM-RFP-Etiketten Zellmembranen rot. A) Stufe 40 Embryo zeigt falsche Verteilung der MEM-RFP indikativ für die Injektion in die falsche Blastomere. Zusätzlich zu falschen tracer Verteilung Injektion in die falsche Blastomere anzeigt, wurde dieser Embryo auf der rechten Seite eingespritzt. 1-fache Vergrößerung. B) zusammengefügte Bild der Niere einen Mangel an Co-Lokalisation von MEM-RFP mit Antikörpern zeigt Markierung der Niere (3G8, 4A6). 5fache Vergrößerung. AB) Bilder von Embryos auf einem Stereoskop genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Targeting die pronephros der Entwicklung von Xenopus - Embryonen stützt sich auf die Identifizierung und die richtige Blastomere zu injizieren. Die Injektion des V2 Blastomere von 8-Zellen - Embryonen zielt auf die linke pronephros 18. Dies lässt die Gegenseite rechts pronephros als interne Kontrolle. Wenn Morpholino Knockdown oder RNA-Überexpression wird verwendet, Nierenentwicklung zu verändern, können die Gegenseite rechts pronephros verwendet werden, um die Auswirkungen von Knock-Down oder Überexpression auf der linken pronephros zu vergleichen. In diesem Fall geeignete Kontrollen wie zum Beispiel eine nicht übereinstimmen Kontrolle Morpholino oder dominant negative RNA-Konstrukt sollte zusätzlich zur Gegen interne Kontrolle verwendet werden, um die Ergebnisse von Veränderungen der Genexpression zu analysieren. Aufgrund der relativen Transparenz des Xenopus Embryo kann Nierenfehler leicht unter Verwendung mehrerer Techniken quantifiziert werden. Beispielsweise Knock-Down oder Überexpression kann einfach durch Berechnung der pronephric Index von Embryonen quantifizierbarimmunhistochemisch mit Antikörper 3G8 13, die die Entwicklung der proximalen Tubuli auf den injiziert und Steuerseiten des Embryos vergleicht. Neben pronephric Erforschung der Entwicklung kann diese Technik leicht andere Gewebe angepasst werden , um gezielt durch die richtige Auswahl der Blastomere Karten 7-10 mit etablierten Schicksal zu injizieren. Zusätzlich zu anderen Gewebetypen Targeting könnte dieses Protokoll auch in verschiedenen Stadien zu untersuchen Nierenentwicklung verwendet werden. Dieses Protokoll sah in der ersten Stufe 40 Embryonen, gefärbt mit Antikörpern 3G8 und 4A6, die differenzierte Nierengewebe zu erkennen. Jüngere Embryos konnten mit verschiedenen Nieren Antikörper oder zogen in situ Hybridisierungs 5, 6, 20 , z. B. immungefärbt werden, der Antikörper Lim1 den Entwicklungs pronephros 21 detektieren kann, 22. Ebenso lim1, PAX8 und hnf1- β - Transkripte sein kann erfasst mit in der ersten Stufe in - situ - Hybridisierung Ausgangs 12.5 22-24 in situ Hybridisierungs Marker können verschiedene Bereiche der Niere in späteren Entwicklungsstadien zu detektieren. Beispielsweise entwickelt Sonden Expression NPHS1 zu erfassen, clckb, SLC5A1 und atp1a1 im Glomus, distal und Verbindungs Tubuli, proximalen Tubuli und die gesamte Niere bzw. wurden 25 beschrieben, 5, 26, 27. Die Beurteilung der Nieren über mehrere Stufen verschiedenen Antikörpern oder in situ - Analyse für ein besseres Verständnis der erlauben würde , wie eine Behandlung verändert Nierenentwicklung.
Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die richtige Auswahl und Identifizierung der Blastomere injiziert werden. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die pronephros Ziel durch die linke V2 Blastomere von 8-Zellen-Embryos oder die linke ventral Blastomere von 4-Zellen-Embryonen injiziert wird. Wenn das falsche Blastomere injiziert wird, werden die pronephros nicht korrekt ausgerichtet sein. Daher ist esist von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung und Zellspaltebenen der frühen Xenopus - Embryonen vor der Mikroinjektion 28, 29. Embryo Spaltung der etablierten Entwicklungsstadium Charts nicht immer folgen vertraut zu machen, so dass es nur zu injizieren Embryonen , bei denen die frühen Zellteilungs hilfreich aussehen "normal" und die richtige Blastomere leicht identifiziert werden können. Dadurch wird die Anzahl der Embryonen zu verringern, die nicht richtig ausgerichtet wurden. Darüber hinaus ist es auch wichtig, die Blastomeren des Embryos vollständig zum Zeitpunkt der Injektion zu dividieren. Wenn beispielsweise die Spaltung zwischen Blastomeren V1 und V2 eines 8-Zellen-Embryos vor der Mikroinjektion nicht vollständig ist, kann der Tracer in V1 verteilt sowie V2. Dies würde die Zieleffizienz des Mikroinjektions verringern, und der resultierende Embryo kann Tracerverteilung zeigen, die in der 4-Zellen-Stadium injiziert, um die von einem Embryo ähnlicher sieht statt der 8-Zellen-Stadium.
Einandere kritische Teil dieses Protokolls ist es, die Überprüfung pronephros richtig durch Mikroinjektion gezielt wurde. Dies muss vor der Analyse pronephric Entwicklung durchgeführt werden, weil Embryonen, die nicht die pronephros gehabt haben richtig die resultierende Datensatzes kann schief ausgerichtet. Um eine korrekte Ausrichtung zu überprüfen, analysieren die Tracer-Verteilung in jedem injizierten Embryo. Die injizierte (linken) Seite des Embryos sollte die überwiegende Mehrheit des fluoreszierenden Tracers anzuzeigen. Wenn die Steuerung (rechten) Seite des Embryos eine erhebliche Menge an Fluoreszenz zeigt, sollte dieser embryo verworfen werden. Wenn dies der Fall ist, wurde entweder die falsche Blastomere injiziert, oder das injizierte Blastomere vor der Injektion gespalten nicht abgeschlossen hatte. Zweitens Fluoreszenz auf der injizierten (linken) Seite des Embryos muss korrekt pronephros Ziel. Wenn der Embryo in der 8-Zell-Stadium, die dorsalen und ventralen Somiten Seitenplatte, Enddarm, Proctodaeum, Haut des Rumpfes und der Neuralleiste im Kofferraum injiziert wurde erwartet, dass Grippe zu zeigenFluoreszenz zusätzlich zu den pronephros 6, 29. Zusätzlich zu den aufgeführten Gewebe für die 8-Zellen - Injektion, Embryonen im 4-Zellen injiziert Stufe haben sollte breitere Verteilung des fluoreszierenden Tracers in der Haut und Somiten sowie Ausrichtung der Zementdrüse, otocyst, Linse und olfaktorische Plakode. Wenn der Embryo nicht die richtige Gewebe - Targeting nicht anzeigt, sollte es vor der Analyse verworfen werden (Abbildung 5).
Die gezielte Injektionen in diesem Protokoll beschrieben ein Mittel zur Genexpression in einem gewünschten Gewebe zu manipulieren. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass, obwohl diese Injektionen ausgerichtet sind, sie beeinflussen nicht nur die Entwicklung von Nieren. Die 4- und 8-Zellinjektionen in dieser Technik beschrieben sind, mehr als bei der Einzelzell-Stadium getan Injektionen geeignet, in denen die Genexpression wird im gesamten Embryo verändert werden, und Injektionen im Zweizellenstadium durchgeführt, wo die Hälfte der Embryo-Displays verändert Gen exprimierenIon. Sie haben jedoch nicht nur ein Zielgewebe. Obwohl Injektionen in den ventralen Blastomeren von 4-Zellen-Embryonen und die V2 Blastomeren von 8-Zellen-Embryonen Genexpression in den pronephros verändern, verändern sie auch Gen-Expression in anderen Geweben. Andere betroffene Gewebe umfassen die Haut, Somiten, Darm und Neuralleiste. Daher ist es wichtig zu verstehen, dass, obwohl 4- und 8-Zellinjektionen gezieltere sind als Ein- oder Zweizellinjektionen, werden sie immer noch die Genexpression in mehreren Geweben verändern. Zusätzlich zu Embryonen in 4- und 8-Zellstadien Injizieren, Injektionen können auch in den 2-, 16- und 32-Zellen-Stufen durchgeführt werden. Embry an der 2-Zelle injiziert Stufe wird eine breitere Palette von Geweben haben betroffen als Embryonen in späteren Phasen injiziert. Obwohl technisch anspruchsvoll, injizierten Embryonen bei den 16- und 32-Zellstadien einen engeren Bereich von Geweben als Embryonen im 4- und 8-Zellen-Stufen injiziert betroffen haben.
Die MEM-RFP-Linie Spurr wird in diesem Protokoll verwendet korrekte Ausrichtung nach der Mikroinjektion zu überprüfen. MEM-RFP-mRNA-Etiketten Zellmembranen nach den Zellen Protein aus der injizierten RNA übersetzt haben. Die Konzentration der MEM-RFP-Linie Tracer in diesem Protokoll (0,1 ng MEM-RFP-mRNA in einer 10 nl Injektion) verwendet wird, sollte nach Bedarf modifiziert werden, um Embryo Tod zu berücksichtigen und die Intensität der Fluoreszenz-Tracer gewünscht. Zusätzlich injiziert, um die Menge an lineage Tracers Modifizierung eine andere lineage tracer, wie Rhodamin-Dextran, Quantenpunkte oder die histochemisch nachweisbare β-Galactosidase, können anstelle von MEM-RFP verwendet werden. Lineage Tracern werden verdünntere als die Zellen teilen, wodurch die Pegel der Fluoreszenz zu verringern, wenn der Embryo entwickelt. Eine weitere Anwendung dieser Technik ist eine exogene RNA oder Morpholin mit der Linie Tracer zusammen injizieren, um die Expression eines Gens von Interesse überexprimiert oder abzureißen. Die Linie Tracer wird verwendet, korrekte Ausrichtung der pronephros zu überprüfen, aber nichtum anzuzeigen, wo in dem Embryo lokalisiert coinjiziert exogene RNA oder Morpholino. Exogenen RNA und Morpholinos kann durch das injizierte Blastomere mit der gleichen Rate wie die co-injizierten Tracer nicht ausbreiten, was möglicherweise in Tochterzellen führt , daß der Tracer, aber nicht die exogene RNA oder Morpholino vorhanden 30. In der Tat haben wir festgestellt, daß zwei verschiedene RNA-Konstrukten zu einer einzigen Zelle injiziert nicht immer co-localize (nicht veröffentlichte Daten). Daher Vorhandensein des Tracers in einer Zelle bedeutet nicht zwangsläufig, dass die co-injizierten exogene RNA oder Morpholino in dieser Zelle immer vorhanden ist.
Dieses Protokoll Details , ein Verfahren für die Mikroinjektion in die Blastomeren Targeting, die zu den pronephros geben von Xenopus - Embryonen entwickeln. Genexpression in Xenopus - Embryonen durch Injektion von Morpholino oder exogenen RNA, die beide die verhindern kann frühen Entwicklungsanomalien verursachen , wenn injiziert , in ein- oft manipuliert oderZwei-Zell-Embryonen. Embryos auf Einzelzellstadium zeigen Zuschlags oder Überexpression in allen Zellen des sich entwickelnden Embryos injiziert. Wenn das Gen für die richtige frühen Entwicklungsprozesse notwendig ist, die Entwicklung der Embryo kann nicht eine pronephros. Injections in späteren Phasen durchgeführt, wie die 8-Zellinjektionen hier detailliert, kann in Embryonen führen , die 18 gastrulation und eventuelle pronephric Entwicklung durchlaufen. Daher hier diskutierten die gezielte Injektionen können die Gastrulation Defekte durch Veränderung der Expression einiger Gene verursacht überwinden, so dass der Embryo durch pronephric Entwicklung fortzuschreiten. In Zukunft kann dieses Protokoll auch auf die gewünschte Blastomeren Ziel CRISPR-Konstrukten verwendet werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health NIDDK Zuschuss (K01DK092320) und Anschubfinanzierung von der Abteilung für Pädiatrie an der University of Texas Medical School McGovern unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
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