Introduction
肺癌は世界1の周りの癌死の主要な原因です。肺がんの予防、早期発見、および治療 の研究は世界2,3の多くの研究センターで進行中です。肺癌のためのいくつかの動物モデルが開発されており、それらは、起源の肺発癌および細胞のメカニズムの研究において、癌幹細胞の存在を決定する際に、種々の新規な治療戦略4を検査するのに有用であることが証明されています。以前のモデルは、マウス5の感受性株に発癌物質誘発性腫瘍の開始に依存していました。具体的に操作遺伝子損傷の結果としてのノックアウトと肺がんが発生したトランスジェニックマウスモデルの開発は、実質的に腫瘍の誘導を制御し、ヒト肺癌4のいくつかの側面を模倣する能力を向上させました。しかしながら、肺癌の動物モデルの使用における主要な課題は、リアルタイムの方法が存在しないことです正確に識別して、マウスの肺の腫瘍の発症や進展を監視し、そのような治療に応答して、それらの継続的な成長または減少としてそれらのサイズ、で、それ以降の変更を文書化します。これは、腫瘍を同定するために、それらの実験の結果を評価するために、いくつかの時間、労力、およびリソースを消費する技術に頼ら研究を余儀なくされました。腫瘍の誘導に応答する固有の間マウスの変動の存在は、データのばらつきを低減するために、各実験群の動物の多数の使用を必要とします。リアルタイムで処理し、腫瘍の成長または応答を評価することができないことは、サンプルからの資源の浪費で、その結果、盲目的に彼らが正しいデータを収集することを保証するために長時間の実験プロトコルで複数の時点でマウスを安楽死させるために、研究者を余儀なくされました早すぎたり遅すぎたりしている時点で収集。
本研究では、この方法は、小動物マイクロ-Cを利用しますomputed断層撮影（マイクロCT）マウスを生きているに肺腫瘍を検出し、フォローアップするためのスキャナーが導入されています。私たちは、最近記載Sftpc-rtTAのとトレ- FGF9-IRES-EGFPのダブルトランスジェニック（DT）急速にドキシサイクリン6,7-による誘導後の肺腺癌を発症するマウスを使用しました。マイクロCTの使用は、（特に）に私たちを可能に誘導する前に、異常な肺の異常でマウスを除外し、誘導後肺の腫瘍結節の発達を確認し、実験的治療に反応して腫瘍結節の変化を観察します。エンドポイントマウスの安楽死および組織学的評価は、マイクロCTを用いて行っリアルタイム評価の精度を確認しました。私たちは、この技術は、貴重な資源を節約観測時間を短縮し、結果の正確さと理解を向上させながら肺癌動物モデルを用いて、より良い計画実験を行うための道を開くだろうと信じています。
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Protocol
動物実験は、慶應義塾大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
注：本研究では、Sftpc-のrtTA及び肺腺癌が急速にドキシサイクリン6,7を含む飼料の供給により誘導後開発したトレ- FGF9-IRES-EGFP DTマウスを使用していました。しかし、すべての評価手順は、他の肺癌マウスモデルに適用することができます。
1.実験概要：
- ベースラインでの肺の状態を特定します。
- 腫瘍誘発する前に、DTマウスは8である場合 - 12週齢、第一のマイクロCTスキャンを（下のセクション2と3を参照）を行います。これは、肺のベースラインスキャンとして機能リーキー導入遺伝子によって引き起こされる自然発生的に開発した結節がないことを確認し、腫瘍誘導前、既存の肺病変が存在しないことを文書化します。
- 腫瘍誘導を開始します。
- 正規のCHからDTマウスを切り替えますドキシサイクリン飼料にOW肺胞細胞に線維芽細胞成長因子（FGF）9発現を誘導し、腫瘍成長を開始します。ドキシサイクリン飼料（200 ppm）で自由摂取を与えます。
- マウス肺における腫瘍小結節の発達を確認します。
- 誘導前のスキャンと比較して腫瘍結節の開発を識別するためのマイクロCTスキャンを実行します。
- 治療に対する反応を評価します：
- 、治療に応答して腫瘍結節の変化を検出FGF受容体（FGFR）阻害剤AZD4547を管理するためのマイクロCTの能力を試験するために、その後、5および10週間後に追加のマイクロCTスキャンを実行します。
- エンドポイントの評価：
- （下記のセクション6を参照）、組織学的評価のために、すべての治療群と対照マウスとプロセス組織を安楽死させます。
2.マイクロCT画像取得のためにマウスを準備します。
- マイクロCTスキャナとコンピュータの電源を入れます。
- clicクリック「R_M CT2」という名前のソフトウェア上でkは、その後、「ウォームアップ」をクリックしてください。
- マウスは、マイクロCT室から置かれる時に、サンプル台を取り外します。ラップで床を包みます。
- 顕著なレベルまで麻酔気化器にイソフルランを追加することで、麻酔導入ボックスを設定します。 3L /分でイソフルラン流量を設定します。
- インダクションボックスへの酸素の流れを開始し、1L /分の流量を設定するために酸素タンクを開きます。
- 麻酔導入ボックスにマウスを置いて、それが深く、自発運動の欠如によって、および（組織損傷や皮膚のブレークが発生しない皮膚の小さな倍の穏やかなピンチ、）皮膚のピンチに応答して麻酔をかけていることを確認します。
- 麻酔中に角膜の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を塗布します。
- マイクロCT室を開き、サンプルのベッドの上で背側を上にしてマウスを置きます。マウスの頭部を持ち、オードにおける下肢から下方にボディを引っ張りますrはストレッチと対称的に体をまっすぐにします。
- インダクションボックスに麻酔の流れをオフにして、マイクロCT室に接続する管に向かってそれをオンにします。
- 連続麻酔薬を投与するために、マウスの鼻の中に麻酔チューブを置きます。
- 位置にマウスを固定するために、マウスやプラスチックラップでサンプルのベッドを包みます。
注：深い麻酔下で、スキャン中の任意のわずかな動きや、その本体のねじれがかすんイメージと解釈することが困難になりますので、サンプル床に包まれたマウスを維持することが重要です。 - マイクロCT室を閉じます。
- 90 kVの160μAと4.5分のスキャン時間にマイクロCTシステムを調整します。 50×50×50μmである24×19ミリメートルとボクセルサイズの画像範囲を設定します。ハートビートのための同期モードを使用してください。
- そのフォルダに新しい画像を保存するために、「データベース」に新しいフォルダを作成します。
- スキャンを開始します。
- スキャンが完了した後、空のケージにマウスを移動し、それが意識を取り戻すまでそれを観察します。それは完全に麻酔の影響から回復するまで、他のマウスとそれを入れないでください。
3.事前誘導マイクロCT画像の可視化と分析：
- ：マイクロCT画像を可視化するために、次のWebサイトから無料ImageJソフトウェアをダウンロードしhttp://imagej.nih.gov/ij/ 。注：すべてのマイクロCTデータファイル約500 TIFファイル（.tifファイル）のスタックです。他の画像閲覧ソフトウェアを使用することもできます。
- シリアルマイクロCT画像ファイルを開き、その逆の腹部またはに首から各マウスのすべての画像をスクロールします。
- ナイーブ野生型マウスのスキャンを使用して、マウスの解剖学の知識に基づいて、胸部内の 異なる領域の密度は、通常の解剖学的構造を特定する（ 図1A参照 ）。
- でカーソルを保持しますコンピュータのマウスと白っぽい腹部内臓や横隔膜から、胸を通って首まで開始、スクロールアップ。
- 骨の胸のケージのランドマーク（両側に背中と肋骨で正面に胸骨、椎骨）を特定します。
- 胸の前、心臓に近いと縦隔の主要な血管に心を識別します。
- その後、より小さな気管支に分岐していき、左右の主気管支に分岐する、（首と胸の上部のレベルでの小さな暗い円として）気管内腔を観察します。各気管支が密接に2または3の血管（ 図1A）に関連付けられていることに注意してください。
- 非誘導DTマウスのスキャンを調べる起動し、異常の有無を識別します。
- 任意のさらなる実験から異常な誘導前の肺の影（ 例えば、結節、気腫性嚢胞、 等 ）を有するマウスを除外します。 （ 図1C、E、G、H
4.腫瘍の誘導：
- 正常な肺のスキャンを示した実験マウスにおける腫瘍発生を誘導するために、ドキシサイクリン含有飼料（200 ppm）でに、通常の固形飼料から自分の食べ物を切り替えます。
5.フォローアップスキャン：
- 10週間後、それらの肺における腫瘍小結節の発達を確認するために、すべてのマウスの第2のマイクロCTスキャンを実行する（ 図2参照 ）。
- 二つのグループにマウスを分割します。一つのグループにし、10週間以上のために他の対照群とプラセボ（10週間/週6日間、胃管を経由して125μgの/ kg /日）FGFRブロッカーAZD4547を管理します。
- 5週間後 - 4第3スキャンを実行することにより、結節性陰影の変化をフォローアップ。
- 治療の10週の終わりには、第4の走査を行います。
- CO 2吸入または0.1ミリグラム/ペントバルビタールを200μlの腹腔内注射で全てのマウスを安楽死させます。
- にその後、任意の異常陰影の出現/消滅（ 図3をチェック二つ以上の異なる時点で同じマウスのシリアルスキャン画像内の同様の位置を特定し、誘導後および処理に応答した腫瘍結節の動的変化を識別）。
- 異なる時点で、同じマウスにおける同一平面上の識別を容易にするために、マウスの胸部内の解剖学的ランドマーク構造に興味のある面を関連付けるしてみてください。
- このような気管、その分岐部、左右の主気管支、大動脈、横隔膜、および大血管などのランドマークを使用してください。
注：胸椎、肋骨、胸骨を含む胸部の骨理由は、スキャン位置の誤った解釈の可能性を高めるサンプルベッドの上でマウス本体の位置合わせで共通のマイナー傾く、の位置決め目印としてあまり有用です。同様に、スキャンファイル内の画像のシリアル番号がidentifyinために信頼性がありませんグラム経時ため、別の時点からマウス本体の長さの変化の同じ位置。異なる時点で同一平面を特定するのに失敗した場合や不正確さが所見の偽陽性/陰性の解釈になることがあります。
- このような気管、その分岐部、左右の主気管支、大動脈、横隔膜、および大血管などのランドマークを使用してください。
6.マウスの安楽死と肺コレクション：
- CO 2吸入または0.1ミリグラム/ペントバルビタールを200μlの腹腔内注射でマウスを安楽死させます。
- 腹壁を通って長手方向に切断することによって腹部の内臓を公開します。腹部大動脈を切開することにより、肺の中の血液の量を減らすために、マウスをブリード。
- 細かいハサミで振動板をスリット。これにより、肺の崩壊、胸腔からの負圧の損失をもたらします。前胸壁のリブの部分を切断して除去することにより、肺と心臓を露出。 tracheを公開するために、皮膚および軟組織を切断することによって、首の前面部分を清掃してくださいA。
- 心臓や胸腺を切り取ります。食道からそれを分離するために気管の後ろに鉗子を挿入します。
- その後、G24カニューレと気管にカニューレを挿入、挿入部分の周りに糸を締めて所定の位置に固定します。
- 25センチメートルカラムを用いて気管カニューレを介して氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して肺を膨らませると固定します。カニューレを外し、喉頭への結合から、上部気管を切断し、その後、PFAの漏洩を防止するためのスレッドを締めます。
- 縫合糸から気管を引いて、その添付ファイルから、それを分析し、 -ブロックエン肺でそれを削除するには、下方向に続けています。 4％PFAの5ミリリットルを含む15mlチューブに挿入します。標準のパラフィンブロック8に組織を処理した後、完全な組織浸透、定着を確実にするために、PFA、O / Nで肺を残します。
- 標準的な技術を用いてヘマトキシリンおよびエオシンでミクロトームや汚れに6μmの厚さにスライスし、パラフィンブロックをカット。 7.組織学的評価：
- スライドスキャナ装置とコンピュータの電源を入れます。
- 「NDPスキャン」ソフトウェアをクリックします。
- スライドのシリーズをスキャンするためのスキャンモード」のスライドのバッチ」と「半自動モード」を選択します。
注：順次走査中にスライドを取り出し、ロボットアームは、スライドガラスの縁部上の凹凸に非常に敏感です。 - マシンにそれらをロードする前に、すべてのガラススライドのエッジを触診します。カバーガラスまたは乾燥した封入剤のいずれかの突起がある場合は、カッターやメスでそれを清掃してください。
- スライドカセットにスライドをロードします。試料のハッチを開き、所定の位置にカセットをスライドさせて「1」;。ドアを閉める。
- コンピュータ・ソフトウェアでは、「OK」ボタンをクリックして、カセットの対応する位置にあるすべてのスライドに短い説明的な名前を付けます。
- 「明」：プロファイルモードを選択します。
- 暫定スキャンを開始するには、「バッチを開始」をクリックします。
注：マシンはすべてのスライドをスキャン終了すると、ソフトウェアは自動的にすべてのスライド上の組織と領域を検出し、関心領域としてそれを提案します。 - 必要な場合は、マウスの左ボタンを押しながら、地域の境界線を引くことによって、関心領域を再定義します。
注：関心領域としてスライドの過大な領域を定義することははるかに長いスキャン時間になります。 - すべてのスライド上の利益を地域に満足したら、すべてのスライドのスキャンを開始するには、「スキャン」をクリックしてください。
注：スキャンしたファイルは、低解像度と高解像度でデジタル的に観察することができ、画像はJPEGとしてエクスポートすることができますファイル。
注：デジタル組織学的評価のために、「スライドスキャナ」の使用は、ここに記載されているが、評価のための定期的な顕微鏡および視覚組織学的評価を使用することも可能です。
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Representative Results
肺の異常を有するマウスの同定は、ベースラインで行いました。 DTマウスは8であった腫瘍誘導、前 - 生後12週間、すべてのマウスの肺は、マイクロCTを用いてスキャンしました。驚くべきことに、マウスの約50％は、その後の研究に含めるためには不適切と判断する私たちを強制的に異常を示しました。これらの異常は、結節状陰影、大規模な単一または複数の小さな気腫性嚢胞および/ または頭葉無気肺（ 図1A、C、DE、GH）となりました。そして、FGF9導入遺伝子および腫瘍誘導は（異常なし）正常な肺のスキャンを示したマウスは、肺胞細胞とその後の腫瘍の開発にFGF9の発現を誘導するためにドキシサイクリン飼料への定期的な固形飼料から切り替えたactivated.Onlyました。腫瘍誘導開始から10週間後にマウスの肺における腫瘍小結節の発達を確認するために、マイクロCTスキャンを実施したフォローアップ。これらは、Dを明らかにしましたすべてのマウスでの可変サイズの複数の結節のevelopment（ 図2、EにBとDと比較）。マイクロCTスキャンは、治療に対する応答を評価するために行きました。これらの、確かに前処理スキャン（ 図 3で見ることができた結節の大きさの消失または減少を示した10週間のFGFR阻害剤AZD4547を投与したマウスは、前誘導後および後処理、ACを比較することを明らかにしました、EG及びIK）。一方、FGFR阻害剤を与えられなかった群とプラセボを与えられた対照マウスではなく、結節のサイズと新しい結節（ 図3、MO）の出現の増加を全く変化を示しませんでした。処置群で観察された大きさの減少は、治療的介入の真の効果であることが確認されました。
図1B、F、I）を含む様々な組織学的変化がありました。 10後のマウス-ドキシサイクリンによる誘導の12週間：可変サイズと位置を持つ複数の腺癌結節は、すべての動物（ 図2C、F）で観察されました。 10続いてドキシサイクリン誘導の12週間- - 10後のマウスFGFRブロッカーの12週間：団塊は、これらの観察誘導後に比べて数がはるかに少なかったと小さい（ 図3D、H、L）。 10続いてドキシサイクリン誘導の12週間- - 10後のマウスプラセボの12週間：複数の大結節が表示されている（ 図3P）誘導後の時点で見られ、これらに類似します。
図1.マイクロCTを識別プリ誘導肺異常。全てのマウスをドキシサイクリン誘導を開始する前に、マイクロCTで検査しました。肺の異常が検出されたときに、マウスを組織学的確認のために安楽死させました。無気肺の面積を有する（C）肺;異常な結節影と気腫性嚢胞と（GH）の肺を持つ（DE）、肺（A）正常な肺のための代表的なマイクロCTスキャン画像。組織学的評価は、マイクロCT所見の精度確認：;（F）は、複数の気腫性の領域（B）正常な肺組織学を、そして、 私）は、複数の腫瘍結節。スケールバー：200μmです。53904fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.マイクロCTは、彼らが組織学的評価のために安楽死させた後、次にマイクロCTで再評価され、10週間のためにスキャンがドキシサイクリン飼料給餌したクリーンプレ誘導を示した誘導。マウス後の腫瘍結節の開発を識別します 。 2匹の異なるマウスからの代表的なマイクロCTスキャン画像は、10週間のドキシサイクリン食の開始後、複数の結節性陰影の外観を示す。（A、D）の開発を示すプリ誘導クリーン肺、（B、E）と同じ位置のスキャン画像を複数の結節（赤矢印）。小さ な黄色の矢印は、（C、F）。異なる時点で同一の位置を特定するために使用される解剖学的標識を指すマイクロCTスキャンであった（c）に見られる結節肺の組織学的切片でonfirmed。スケールバー：200μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
クリーン誘導前のスキャンを示したに治療。マウス応答におけるマイクロCTを識別変更腫瘍結節で図3は、10週間のドキシサイクリン飼料を給餌した後、誘導後のマイクロCTを行いました。次に、それらをさらに10週間、FGFR阻害剤AZD4547を投与し、マイクロCT（後処理）で再評価しました。対照マウスは、治療的介入の実際の効果を明確にするために、プラセボの代わりのFGFR阻害剤を投与しました。最後に、マウスは、組織学的評価のために安楽死させました。
四つの異なるマウスからの代表的なマイクロCTスキャン画像である。（A、E、I、M） （B、F、J、N）をスキャンし、それらは10週間のドキシサイクリン飼料で誘導した後。すべての完全な消失を示すFGFR阻害剤を用いた治療の追加の10週間後。（、赤い楕円形は完全に結節の影されていた領域を囲む赤い矢印）同じマウスから（C、G、K）スキャンを複数の結節を示しましたか、結節の大きさの顕著な減少（O）腫瘍結節」サイズと数の増加を示すインヒビターFGFRの代わりにプラセボを投与した対照群を表すために、対照マウスからのスキャン。小さ な黄色の矢印は、異なる時点で同じ位置を識別するために使用される解剖学的ランドマークを指す。（D、H、L）組織切片（2 CとFを把握するために比較して）結節のサイズと数の顕著な減少を確認した。（P） presaの複数形を示しています複数の腫瘍結節のNCEは、プラセボを投与したとき。スケールバー：200μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
腫瘍結節の開発や、より計画する肺癌関連の実験を行っている科学者を可能にする肺癌動物モデルにおける治療に対する反応のリアルタイムの肺の異常の識別と監視のためにここで説明するマイクロCTに基づく方法正確かつ効率的な実験は、時間とリソースを節約しながら。我々は以前、同じ目的の6のためにMRIを使用しています。 MRIでの肺結節の検出のためのスキャンおよびしきい値の透明度は、この研究6に記載のマイクロCTスキャンのものに劣っていました。
（異なる遺伝的背景と腫瘍誘発法と）同様の肺腺癌のマウスモデルを使用した以前の研究では、明らかに回避またはそれらがマイクロCTスキャン9,10を使用していた改善されている可能性があり、いくつかの欠点がありました。彼らはこのように交絡を危険にさらし、任意の誘導前の肺の異常や結節を特定する手段がありませんでした不適当な動物を含めることによって、それらの結果。彼らはまた、（二次性腫瘍を誘発するために）誘導後または野生型マウスに癌細胞を増殖した後、腫瘍の発達を確認する手段を持っていたので、彼らは4-8ヶ月を待たなければならなかった後、盲目的の組織学的同定のためのマウスを安楽死させます腫瘍。これらのモデルは、薬剤の治療可能性を評価するために使用されたときに、研究者は組織学と腫瘍結節の治療の効果を検出し、最大効果の時点を識別することができるように時間的順序で安楽死されるいくつかのグループを割り当てなければなりませんでした11。
本方法の1つの制限は、しかしながら、いくつかの異物が気管内7（データは示していない）を注入されたときに、肺における結節の検出を不明瞭に曇ったシャドウの外観を表したものです。いくつかのマウスは、注入された物質への長期の炎症反応とこのをReactiの影を開発するように見えました上および付随する間質性浮腫は、既存の結節をマスクします。このような場合には、MRIは、代替として試すことができます。
最近、他の撮像モダリティ小動物における種々の病状を評価するために導入されています。生物発光イメージング12及び陽電子放出断層撮影（PET）のような13を走査します。小動物MRIおよびマイクロCT画像と検出効率及び写像性の比較はまだ可能ではないので、我々の知る限り、これらの撮像システムは、マウスモデルにおける肺腫瘍を評価するためにまだ使用されていません。これらのマシンの可用性とコストはその広範な使用に制限する要因です。
我々は、誘導前スクリーニングにおけるマウスのおよそ50％において肺の異常を検出し、それに応じて、これらのマウスをさらなる実験から除外しました。異常のこの高い発生率は、腫瘍結節の開発の結果、いくつかの動物では「漏出」FGF9導入遺伝子の結果であるかもしれません彼らは14を誘導している前であってもです。実際、組織学的に検査除外動物の約半分は、複数の小結節の存在を示しました。これらはまた、マウスゲノム14で隣接する遺伝子に挿入された導入遺伝子の異常な効果によって発生する可能性があります。異常のこれらの種の開発ないことにより、二重トランスジェニックマウスSftpc-rtTAのとトレ- FGF9-IRES-EGFPに特異的なので、他の肺癌モデルが同様の状況に苦しんでいる可能性がありますを意味しています。偶数より異常のハイライトのこの高い発生率マイクロCTを用いたマウスの前包含スクリーニングの重要性。ナイーブ野生型マウスは、マイクロCT（図1A）上の任意の異常陰影を示したことはありません。
結論として、我々は、腺癌のマウスモデルの肺における腫瘍小結節の発達の正確な検出およびモニタリングのための小動物マイクロCT装置を利用する方法を記載しています。によって経時的な結節の変化を監視するためにそれを使用して、より正確なデータを収集することができ、コストおよび時間効率の経時変化を適応させることができます。
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Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会AEHのための科研費（グラント番号25461196）およびTB（グラント番号23390218と15H04833）からのイン援助グラント-と国立衛生研究所HL111190（DMO）を付与することによってサポートされていました。著者らは、動物の遺伝子型決定および組織切片の準備を手伝うことに彼女の努力のためのみゆき山本を承認したいと思います。我々は、技術サポートおよび試薬のための共同研究資源、医学部、慶應義塾大学に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
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