Summary
Un protocolo para la reducción de las heterogeneidades espaciales de las señales de iones en la espectrometría de masas MALDI mediante la regulación de la temperatura del sustrato durante el proceso de secado de la muestra se demuestra.
Protocol
NOTA: Este protocolo se ha desarrollado para la reducción de la heterogeneidad espacial de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con el método de la gota se seca. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo la preparación y acondicionamiento previo, la deposición de la muestra y secado, y el análisis de los datos de espectrometría de masas. Los procedimientos se describen y se describen en más detalle a continuación:
1. Preparación y acondicionamiento previo
- Limpieza de la placa de muestras
- Use guantes de nitrilo y de la mano-lavar la placa de la muestra suavemente con detergente y agua destilada-desionizada (DDW).
- Enjuague la placa de la muestra con metanol (MeOH) y DDW.
- Inserte la placa de muestra en un vaso de 600 ml y se llenan de DDW.
- Sonicar la placa de muestra en DDW durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz).
- Retire DDW del vaso y llenar el vaso de precipitado con MeOH.
- Sonicar la placa de muestra en MeOH durante 15 minutos en el baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz).
- Soplar las gotas de disolvente en el plato con gas nitrógeno y mantener la placa de muestra seca antes de la deposición de la muestra.
- Regulación de la temperatura cámara de secado
NOTA:. La cámara de secado se encuentra a 35 x 20 x 45 cm 3 (W x D x H) acrílico cámara de la figura 1 se muestra la imagen de este sistema de secado. La cámara se purga con gas nitrógeno temperatura ambiente a través de un medidor de flujo de gas a un caudal constante para mantener una condición de baja humedad relativa controlada por un higrómetro calibrado instalado dentro de la cámara de secado. Un bloque a base de cobre en la cámara de secado equipado con un dispositivo de circulación de agua a temperatura constante programada se utiliza para alojar placas de muestra de acero inoxidable. El bloque de base de cobre es capaz de regular la temperatura de la placa de muestra de 5 a 25 ° C. Las temperaturas del aire, bloque a base de cobre, y la placa de muestra son controlados por termopares de tipo K.- Abra la puerta y rápidamente poner la placa de la muestra sobre el cobrebloque de base y cierre la puerta.
- Para ajustar manualmente el medidor de flujo de gas para ajustar el caudal de nitrógeno a 10 pies cúbicos estándar por hora (SCFH).
- Controlar la humedad relativa en la cámara de secado por el higrómetro y afinar el medidor de flujo de gas para asegurar la humedad relativa es siempre por debajo de 25%.
- Controlar la temperatura de la placa de la muestra mediante termopares de tipo K y ajustar la temperatura de recirculación de agua manualmente hasta que la placa de la muestra alcanza los 5 ° C durante el experimento o la temperatura ambiente (25 ° C) para el control.
NOTA: A fin de estabilizar la placa de muestra a una temperatura diseñado, la temperatura de recirculación de agua se fija típicamente 0-5 ° C más baja que la muestra diseñada. Por ejemplo, para mantener la 5 ° C en la placa de muestra, el ajuste de temperatura de la bomba de circulación de agua está en el intervalo de 0 a 2 ° C; para mantener la placa de muestra a 25 ° C, el ajuste de temperatura de la circulación de agua que se encuentra en el rango de 23 a 25 ° C. - Asegúrese de que las temperaturas requeridas y la humedad relativa se alcanzan (Tabla 1) antes de la deposición de la muestra.
NOTA: Todos los parámetros, así como sus valores de ajuste para los procesos de secado con diferentes temperaturas de la placa de muestra se muestran en la Tabla 1.
NOTA: A una temperatura baja placa de la muestra, la condensación de agua en el plato de la muestra puede ocurrir si la puerta de la cámara está abierta durante mucho tiempo. Si se produce condensación de agua, cierre la puerta y NO deposite cualquier muestra en ella hasta que la condensación de agua se seca.
- Preparación de la matriz y el analito Soluciones
- Preparación de las soluciones de la matriz
- Preparar una solución 0,1 M THAP con un 50% de acetonitrilo (ACN): DDW solución acuosa al 50%.
- Preparación de analitos
- Preparar 10 -4 M solución maltotriosa con DDW.
- Preparar 10 -5 fragmento bradiquinina M (1-7) en solución de 50% de acetonitrilo(ACN): 50% de solución acuosa DDW.
- Preparación de las soluciones de la matriz
2. Deposición de la muestra y de secado
- Premezcla de 0,25 l de solución THAP 0,1 M y 0,25 l de 10 -4 M maltotriosa o fragmento de la bradicinina 10 -5 M (1-7) soluciones en un tubo de microcentrífuga.
- Vortex la solución mixta durante 3 s.
- Centrifugar la solución mixta de 2 seg (2.000 xg) para recoger la solución en la parte inferior del tubo de centrífuga.
- Abra la puerta de la cámara de secado, cuidadosamente depositar 0,1 l de la solución en la placa de muestra con la pipeta y cerrar la puerta inmediatamente.
- Espere a que la gota de muestra se seque.
. NOTA: Los tiempos de secado normalmente observadas con diferentes temperaturas de placa de muestra se enumeran en la Tabla 1 para la temperatura del plato de muestra de 5 ° C, el tiempo medio de secado es de 800 a 1.000 seg; para la temperatura de la placa muestra de 25 ° C, el tiempo medio de secado es de 100 a 150 sCE. - Después del secado, abrir la puerta de la cámara de secado.
- Ajuste la temperatura de recirculación de agua a temperatura ambiente (25 ° C).
NOTA: Omita este paso si la placa de muestra se mantiene constante a temperatura ambiente (25 ° C) durante el proceso de secado. - Después de que las muestras que la temperatura de la placa a temperatura ambiente (25 ° C), retire la placa de la muestra de la cámara de secado.
- Examinar la morfología de la muestra bajo un microscopio estereoscópico 5X y tomar la imagen de campo brillante de una instantánea.
NOTA: Si no son los esperados las morfologías de cristal, es necesario preparar una nueva muestra con el mismo procedimiento. Morfologías cristalinas típicas se muestran en los paneles superior de la Figura 2.
Nota: en los casos con temperaturas de placa de muestra bajas, tales como 5 ° C, es importante calentar la placa de la muestra a la temperatura ambiente antes de sacarlo de la cámara de secado. Al depositar las muestras, NO mantener el SOLUTIO premezcladon en la punta de la pipeta durante 10 s. NO use la solución premezclada de nuevo después de depositar las muestras. Los paneles superiores de la Figura 2 muestran imágenes de campo brillante de muestras preparadas con diferentes temperaturas de la placa de la muestra.
Análisis de Datos 3. Espectrometría de Masas
- La espectrometría de masas Adquisición de Datos
NOTA: Después de la preparación, la muestra puede analizarse mediante espectrometría de masas de imagen. En el estudio actual, los MS experimentos de imagen se llevan a cabo usando una transferencia sincronizada TOF-doble polaridad de laboratorio construido (DP-TOF) espectrómetro de masas de imágenes. 15 espectrómetros de masas MALDI-TOF comercial con capacidad de imagen también son adecuados para tales experimentos. El espectrómetro de masas se utiliza en la extracción lineal y modos de iones positivos con retrasos de extracción optimizado. La energía cinética de los iones es 20 kV. El tamaño del haz de láser es de 35 micras de diámetro en la superficie de la muestra, y el espectro de cada punto es el avela rabia de 5 disparos de láser.- Inserte la placa de muestra en el espectrómetro de masas MALDI.
- Realizar análisis de imagen espectrometría de masas para la muestra preparada en los pasos 2.1-2.9.
- Seleccionar un pico de masa característicos de la lista de masas se muestra en la ventana de resultados y haga clic en "2D" para trazar una imagen de iones de dos dimensiones.
NOTA: Para maltotriosa mezclado con THAP, los picos característicos son sodiated maltotriosa, THAP protonada, y sodiated THAP. Para fragmento de bradicinina (1-7) mezclado con THAP, los picos característicos incluyen el fragmento de la bradicinina (1-7), protonado THAP protonadas y sodiated THAP. - Haga clic en los botones de ajuste en la ventana emergente para determinar los límites superior e inferior de la intensidad de la señal y haga clic en "guardar una imagen". Este ajuste define el contraste de las imágenes de iones.
NOTA: En cada conjunto individual de datos, las regiones agrietados y los puntos nulos muestran bajo brillo se eliminan. - Observar y comparar el ionimagen de la imagen de campo brillante que fue tomada en el paso 2.9 con.
NOTA: Imágenes espectrometría de masas y construcción de imágenes de iones particulares se puede lograr con instrumentos comerciales. Debido a la variedad de adquisición de datos y software de análisis, los usuarios deben seguir las instrucciones de software proporcionados por el proveedor de instrumento para obtener imágenes de alta calidad.
- Análisis de los datos
NOTA: La heterogeneidad de las muestras se analizó cuantitativamente. En esta demostración, cada muestra se divide en varias zonas concéntricas de software de desarrollo propio para analizar la distribución espacial de los iones. El análisis también se puede realizar utilizando software de análisis de datos independiente.- Haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietados la imagen de iones se muestra en la ventana de resultados en extirpar las áreas sin importancia.
NOTA: Este procedimiento define el área esencial de la imagen de iones. - Haga clic en el botón "borde buscar" para encontrar la mayor capa de la imagen de iones.
- Haga clic en "deducir" para guardar la información de la abundancia de iones de la capa más externa de una base de datos y eliminar esta capa de la imagen de iones de forma simultánea. Una casilla de verificación que representa esta capa más externa aparecerá en la lista de "datos de salida" de la ventana de resultados.
- Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 hasta que se defina el centro de la imagen de iones.
- Haga clic y seleccionar todas las casillas de verificación en la lista de "datos de salida" y haga clic en "Exportar" para exportar los datos.
- Abra los datos exportados utilizando el software de hoja de cálculo para calcular el promedio de abundancia de iones de cada capa para obtener la información de la distribución espacial de los iones.
- Haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietados la imagen de iones se muestra en la ventana de resultados en extirpar las áreas sin importancia.
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Representative Results
Las imágenes de campo brillante, así como las imágenes de EM de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con temperatura de la placa de muestra de 5 y 25 ° C se muestran en la Figura 1. En el caso de maltotriosa sodiated, la señal de ion principalmente puebla en la periferia de la zona de la muestra cuando se prepara con una temperatura de la placa de muestra de 25 ° C. Al disminuir la temperatura de la placa de la muestra a 5 ° C, la señal rellena de forma homogénea sobre toda el área de la muestra. El único inconveniente notable en la preparación de muestras por debajo del 5 ° C es que hay más grietas que las muestras preparadas bajo 25 ° C. La imagen de iones de fragmento de bradicinina protonada (1-7) muestra una tendencia similar a las de maltotriosa sodiated. Los resultados de la formación de imágenes MS sugieren que la preparación de las muestras bajo una temperatura de la placa inferior de la muestra puede redistribuir de manera significativa las moléculas y reducir la heterogeneidad.
la Figura 3 muestra los resultados de los análisis estadísticos para el fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada bajo temperaturas de la placa de muestra de 5 y 25 ° C. Para cada muestra, la intensidad media se normaliza. En el caso de maltotriosa sodiated con una temperatura de placa de muestra de 25 ° C, las intensidades de señal en los centros son mucho más bajos que aquellos con la temperatura de la placa de muestra de 5 ° C. El resultado de fragmento de bradicinina protonada (1-7) también muestra menos variación cuando la disminución de la temperatura de la placa de la muestra 25 a 5 ° C.
Figura 1: Imagen del sistema de secado de la muestra.La cámara de secado está hecho de acrílico. La cámara se purga con gas nitrógeno temperatura ambiente para mantener una condición de humedad relativa baja. Un bloque de base de cobre, equipado con un circulador de agua de temperatura constante programada se utiliza para regular la temperatura de las placas de muestra de acero inoxidable. Los termómetros monitor de aire, bloque base de cobre, la placa de muestra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La reducción de la muestra. Resultados de temperatura de la placa en una mejor homogeneidad de la señal Las imágenes de campo claro (imágenes superiores), así como las imágenes MALDI (imágenes inferiores) de maltotriosa (a) y el fragmento de la bradicinina (1-7) (b) preparado con THAP bajo diferentes temperaturas de la placa de muestra. el MALDI las imágenes fueron obtenidas mediante la extracción de la maltotriosa sodiated (m / z: 527) y el fragmento de bradiquinina protonada (1-7) (m / z: 757) a partir del espectro total, respectivamente. El tamaño de píxel de las imágenes de iones es de 35 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: variación de la señal reduce como temperatura de la placa de la muestra disminuye durante el proceso de secado de las imágenes MALDI se obtienen con maltotriosa (a) y fragmento de bradicinina (1-7) (b) preparado con THAP bajo diferentes temperaturas de la placa de muestra.. los datos rojos y azules indican la muestra preparada a las temperaturas de placa de muestra de 25 y 5 ° C, respectivamente.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Placa de la muestra de temperatura (° C) | Muestra | Temperatura del aire (° C) | Humedad relativa (HR%) | Tiempo de secado (s) |
| 5 | maltotriosa con THAP | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| fragmento de bradicinina (1-7) con THAP | ||||
| 25 | maltotriosa con THAP | 25 ± 3 | 100-150 | |
| fragmento de bradicinina (1-7) con THAP |
Tabla 1: Parámetros Experimentales y condiciones de secado bajo diferentes temperaturas de la placa de la muestra.
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Discussion
En base a las predicciones teóricas anteriores, los flujos hidrodinámicos inducidos por la temperatura dentro de las gotitas hacia el exterior pueden superar los flujos capilares inducidas por evaporación del disolvente. La eficiencia de tales recirculación interna de las moléculas es mayor cuando la temperatura de los gradientes dentro de un aumento de las gotitas. De acuerdo con los resultados predichos, cuando manteniendo la temperatura de la placa muestra bajo 5 ° C mientras se mantiene el entorno a la temperatura ambiente, la velocidad media de los flujos de recirculación dentro de la gotita es de aproximadamente 4 veces más rápido que el de los flujos capilares hacia el exterior. Si la temperatura de la placa de la muestra es el mismo que el entorno, la velocidad promedio de los flujos de recirculación es de 1.800 veces más lento que el flujo capilar hacia el exterior. Los resultados de este cálculo indican que la disminución de temperatura de la placa de la muestra durante la preparación de la muestra es ventajosa. Las observaciones experimentales están de acuerdo con esta predicción.
El temperamento placa de muestrasratura debe ser controlada con precisión durante toda la preparación de muestras de proceso. La Tabla 1 muestra el tiempo de secado típico de gota con 0,1 l de muestra bajo diferentes temperaturas de la placa de muestra. Antes de depositar la solución de muestra en la placa, es importante asegurarse de que la superficie de la placa de la muestra está seca. Si se produce condensación de agua en la preparación de muestras de acuerdo con las bajas temperaturas, no se recomienda la deposición de la solución de la muestra ya que el agua condensada se agranda áreas de muestra y diluye las soluciones. Por lo tanto, es importante para mantener la humedad relativa de la cámara de secado por debajo de 25%. Además, en la preparación de muestras a bajas temperaturas, la placa de muestra debe estar caliente hasta la temperatura ambiente antes de sacarla de la cámara de secado. Aunque la condensación de agua menor después de la finalización de la cristalización de la muestra no altera la población de la muestra, la condensación significativa debe ser evitado.
El uso de soluciones premezcladas recién se recoreparado. Una vez que las soluciones premezcladas se exponen al aire, pre-cristalización de las soluciones de muestra se producen y el tamaño del cristal final y la morfología pueden cambiar. Por lo tanto, el procedimiento de pipeteado se debe realizar con una eficiencia razonable, normalmente dentro de los 10 segundos, para evitar que la gota de muestra desde la pre-cristalización dentro de la punta de la pipeta. Se recomienda observar la morfología de la muestra bajo un microscopio para asegurarse de morfologías cristalinas adecuadas se producen antes del análisis de espectrometría de masas. Si las morfologías de cristal no son tan buenos como se esperaba, repitiendo el proceso de deposición según sea necesario.
De acuerdo con nuestros estudios teóricos y experimentales, la preparación de muestras con una placa de muestras baja temperatura instalados en condiciones ambientales mejora en gran medida la reproducibilidad y calidad de datos en MALDI-MS. Experimentos posteriores también muestran una mejora significativa de la intensidad de señal con este método de preparación de muestras. Los datos experimentales obtenidos por tsu método a mejorar considerablemente la fiabilidad de los espectros de masas MALDI para los análisis cuantitativos. En comparación con otros métodos que implican la composición de la solución o cambios en las propiedades de la superficie, 8,16-18 condición cambiante de secado es más simple y más generalmente aplicable para las muestras convencionales. Por lo tanto, la mayoría de los usuarios de espectrometría de masas pueden beneficiarse de ella en aplicaciones regulares.
La mejora de la homogeneidad de la señal MALDI con la disminución de temperatura de la placa de la muestra también es eficaz para algunas otras matrices populares. Por ejemplo, la mejora de α-ciclodextrina (α-CD) homogeneidad de la señal con THAP y α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) como la matriz en condiciones de secado de la muestra a baja temperatura se ha informado recientemente. 14 La desventaja con el cambio de placa de muestras la temperatura es que el método es actualmente inadecuados para análisis de alto rendimiento debido al tiempo de secado de la muestra a largo en condiciones de baja temperatura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
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