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Genetics

हेलिक्स विकृत, साइट-विशिष्ट डीएनए Interstrand crosslinks के प्रसंस्करण में वास्तु प्रोटीन HMGB1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपकरण

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

उच्च गतिशीलता समूह बॉक्स 1 (HMGB1) प्रोटीन एक गैर हिस्टोन वास्तु प्रोटीन है कि इस तरह के ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए प्रतिकृति, और डीएनए की मरम्मत के रूप में जीनोम में कई महत्वपूर्ण कार्य, विनियमन में शामिल किया जाता है। HMGB1 विहित बी-डीएनए के लिए अधिक से अधिक आत्मीयता के साथ संरचनात्मक रूप से विकृत डीएनए को बांधता है। उदाहरण के लिए, हमने पाया HMGB1 बांधता है कि डीएनए interstrand को crosslinks (ICLs), जो covalently डीएनए की दो किस्में लिंक, हेलिक्स की विकृति का कारण है, और अगर छोड़ दिया बिना मरम्मत के सेल मौत का कारण बन सकता है। उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता के कारण, कई आईसीएल उत्प्रेरण एजेंटों वर्तमान में क्लिनिक में एजेंटों के रूप में उपयोग किया जाता है। जबकि आईसीएल के गठन एजेंटों निश्चित आधार दृश्यों (जैसे, 5'-टीए-3 'psoralen के लिए पसंदीदा crosslinking साइट है) के लिए वरीयताओं दिखाने के लिए, वे काफी हद तक एक अंधाधुंध फैशन में डीएनए की क्षति प्रेरित। हालांकि, covalently एक Triplex के गठन oligonucleotide (TFO) है, जो एक अनुक्रम विशिष्ट डीएनए को बांधता को आईसीएल उत्प्रेरण एजेंट युग्मन द्वाराढंग से, लक्षित डीएनए की क्षति प्राप्त किया जा सकता है। यहाँ, हम एक TFO covalently, 8-trimethylpsoralen (एचएमटी) psoralen 5 '4'-hydroxymethyl-4,5 करने के लिए अंत' पर संयुग्मित का प्रयोग कर एक उत्परिवर्तन संवाददाता प्लाज्मिड पर एक साइट विशेष आईसीएल उत्पन्न करने के लिए एक उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए मानव कोशिकाओं में HMGB1 द्वारा वास्तु संशोधन, प्रसंस्करण, और जटिल डीएनए घावों की मरम्मत अध्ययन करने के लिए। हम प्रयोगात्मक तकनीक संवाददाता plasmids पर TFO निर्देशित ICLs तैयार करने के लिए, और chromatin immunoprecipitation assays का उपयोग एक सेलुलर संदर्भ में TFO निर्देशित ICLs साथ HMGB1 के सहयोग से पूछताछ करने का वर्णन है। इसके अलावा, हम superhelical HMGB1 द्वारा psoralen-crosslinked प्लाज्मिड पर पेश किया जाता है की राशि को मापने के द्वारा क्षतिग्रस्त डीएनए की विशिष्ट वास्तु संशोधन का आकलन करने के लिए डीएनए सुपर कॉइलिंग assays का वर्णन है। इन तकनीकों में अन्य प्रसंस्करण और TFO निर्देशित ICLs या ब्याज की किसी भी कोशिका लाइन में अन्य लक्षित डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

एक अनुक्रम विशिष्ट फैशन में Hoogsteen-हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से Triplex के गठन ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (TFOs) बाँध द्वैध डीएनए ट्रिपल पेचदार संरचनाओं 1-5 के रूप में। Triplex प्रौद्योगिकी जैसे ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए की क्षति की मरम्मत, और जीन को निशाना (संदर्भ 6-8 में समीक्षा) के रूप में biomolecular तंत्र की एक किस्म से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। TFOs संवाददाता plasmids 9,10 पर साइट विशेष क्षति प्रेरित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों को पहले एक psoralen अणु को एक TFO, AG30, सीमित इस्तेमाल किया है प्लाज्मिड pSupFG1 5,10-12 पर supF जीन में साइट विशेष डीएनए interstrand crosslinks (ICLs) प्रेरित करने के लिए। ICLs अत्यधिक साइटोटोक्सिक के रूप में इन घावों covalently दो डीएनए किस्में crosslink हैं, और अगर बिना मरम्मत के लिए छोड़ दिया, जीन प्रतिलेखन ब्लॉक और डीएनए प्रतिकृति मशीनरी 13,14 बाधित कर सकते हैं। उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता की वजह से, आईसीएल उत्प्रेरण एजेंटों उपचार में कीमोथेरेपी दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया हैकैंसर और अन्य बीमारियों में 15। बहरहाल, मानव कोशिकाओं में प्रसंस्करण और ICLs की मरम्मत अच्छी तरह से समझ नहीं है। इस प्रकार, मानव कोशिकाओं में ICLs के प्रसंस्करण में शामिल तंत्र का एक बेहतर समझ आईसीएल आधारित कीमोथेराप्युटिक परहेजों की प्रभावकारिता में सुधार करने में मदद कर सकता है। TFO प्रेरित ICLs और उनकी मरम्मत के मध्यवर्ती डीएनए हेलिक्स के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक विकृति पैदा करने की क्षमता है। इस तरह की विकृतियों वास्तु प्रोटीन है, जो विहित प्रपत्र बी द्वैध डीएनए 16-20 की तुलना में अधिक आत्मीयता के साथ विकृत डीएनए के लिए बाध्य के लिए संभावित लक्ष्य कर रहे हैं। यहाँ, हम chromatin immunoprecipitation (चिप) psoralen-crosslinked plasmids पर assays के माध्यम से मानव कोशिकाओं में ICLs के साथ एक उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन वास्तु की एसोसिएशन, HMGB1 का अध्ययन किया और मानव में psoralen-crosslinked प्लास्मिड डीएनए के टोपोलॉजी नियमन में HMGB1 के लिए एक भूमिका की पहचान कैंसर सेल lysates।

HMGB1 एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और सर्वत्र व्यक्त की है गैर-अपनेस्वर वास्तु प्रोटीन है कि विहित प्रपत्र बी-डीएनए 17-20 की तुलना में अधिक आत्मीयता के साथ क्षतिग्रस्त डीएनए और वैकल्पिक रूप से संरचित डीएनए substrates को बांधता है। HMGB1 ऐसे ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए प्रतिकृति, और डीएनए की मरम्मत 16,21-23 के रूप में कई डीएनए चयापचय की प्रक्रिया में शामिल है। हम पहले से दिखा दिया है कि HMGB1 उच्च आत्मीयता 20 के साथ इन विट्रो में TFO निर्देशित ICLs को बांधता है। इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि HMGB1 की कमी एक न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत (एनईआर) के सह-कारक के रूप में 23,24 TFO निर्देशित ICLs की mutagenic प्रसंस्करण और पहचान HMGB1 वृद्धि हुई है। हाल ही में, हमने पाया है कि HMGB1 मानव कोशिकाओं में TFO निर्देशित ICLs साथ जुड़ा हुआ है और इस तरह के घावों को इसकी भर्ती एनईआर प्रोटीन, XPA 16 पर निर्भर है। डीएनए के नकारात्मक सुपर कॉइलिंग एनईआर 25 से डीएनए घावों के कुशल हटाने को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, और हमने पाया है कि HMGB1 TFO निर्देशित आईसीएल युक्त Plas पर रियायत के तौर पर नकारात्मक सुपर कॉइलिंग लातीमध्य substrates (गैर क्षतिग्रस्त plasmids substrates के सापेक्ष) 16, एक एनईआर सह-कारक के रूप में HMGB1 की संभावित भूमिका (ओं) का एक बेहतर समझ प्रदान करते हैं। ICLs के प्रसंस्करण के लिए पूरी तरह से मानव कोशिकाओं में समझ नहीं है; इस प्रकार, तकनीक और विकसित assays यहाँ बताया आणविक उपकरणों के आधार पर अतिरिक्त आईसीएल की मरम्मत में शामिल प्रोटीन है, जो बारी में के रूप में औषधीय लक्ष्य है कि कैंसर कीमोथेरेपी परहेजों की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सेवा कर सकते हैं की पहचान करने के लिए ले जा सकता है।

इधर, एक प्रभावी दृष्टिकोण agarose जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing चर्चा की गई है द्वारा प्लास्मिड डीएनए में TFO निर्देशित आईसीएल के गठन की क्षमता का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, TFO निर्देशित ICLs युक्त plasmids का उपयोग कर, तकनीक आईसीएल क्षतिग्रस्त plasmids के साथ HMGB1 के सहयोग से एक सेलुलर संदर्भ में संशोधित चिप assays का उपयोग निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, एक सतही विधि वें द्वारा शुरू की topological संशोधनों का अध्ययन करने के लिएई वास्तु प्रोटीन HMGB1, विशेष रूप से मानव कोशिका lysates में आईसीएल क्षतिग्रस्त प्लाज्मिड substrates पर दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से सुपर कॉइलिंग assays के प्रदर्शन के द्वारा निर्धारित किया गया है। तकनीक वर्णित मानव कोशिकाओं में प्लास्मिड पर लक्षित डीएनए की क्षति के प्रसंस्करण में डीएनए की मरम्मत और वास्तु प्रोटीन की भागीदारी की समझ को आगे करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

हम प्लास्मिड डीएनए, और बाद में प्लाज्मिड चिप और assays सुपर कॉइलिंग क्रमश प्रोटीन है कि घावों के साथ संबद्ध है, और प्रोटीन है कि डीएनए टोपोलॉजी में परिवर्तन की पहचान है, पर TFO निर्देशित साइट विशेष psoralen ICLs के गठन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। ये assays अन्य डीएनए हानिकारक एजेंटों, TFOs, प्लाज्मिड substrates, और ब्याज की स्तनधारी सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। वास्तव में, हम पता चला है कि वहाँ है कम से कम एक संभावित अद्वितीय और उच्च आत्मीयता TFO बाध्यकारी साइट मानव जीनोम 26 में हर एनोटेट जीन के भीतर। किस तरहकभी, स्पष्टता के लिए, हम इन तकनीकों का एक विशिष्ट psoralen संयुग्मित TFO (pAG30) के इस्तेमाल के लिए मानव U2OS कोशिकाओं में एक विशिष्ट उत्परिवर्तन संवाददाता प्लाज्मिड (pSupFG1) पर वर्णित के रूप में हम मुखर्जी और Vasquez, 2016 16 में उपयोग किया है।

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Protocol

1. प्लाज्मिड Substrates पर TFO निर्देशित ICLs की तैयारी

  1. प्लाज्मिड pSupFG1 की equimolar मात्रा सेते 10,11 डीएनए Triplex बाध्यकारी बफर [50% ग्लिसरॉल, 10 मिमी Tris (पीएच 7.6), 10 मिमी MgCl के 8 μl में psoralen संयुग्मित TFO AG30 के साथ (5 माइक्रोग्राम प्रति प्लास्मिड डीएनए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है) 2] और DH 2 हे एक एम्बर ट्यूब में 40 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स। 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  2. पूर्ण बिजली उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए यूवीए दीपक गर्म। आयल फिल्म पर प्रतिक्रिया Triplex प्लेस, और यूवीए (365 एनएम) दीपक के नीचे बर्फ पर आयल फिल्म जगह है। दीपक और प्रतिक्रिया के बीच एक Mylar फिल्टर रखें।
  3. यूवीए 1.8 जम्मू / 2 सेमी की कुल खुराक के लिए चमकाना। आगे उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहित करें।
    सावधानी: समुचित सुरक्षात्मक eyewear और यूवीए विकिरण के साथ कपड़े पहनें।
  4. फिर से ऊपर तैयार प्लाज्मिड के 200 एनजी Linearizeएक 20 μl कुल मात्रा निर्माता का उपयोग करने में striction एंजाइम पारिस्थितिकी R1 10x बफर आपूर्ति की। गर्मी 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंजाइम denature। 10,000 XG पर 10 मिनट के लिए नमूने स्पिन और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. 50x क्षारीय बफर [1.5 एम NaOH, 50 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)] तैयार करें। Agarose की 0.5 मिलीग्राम 50 मिलीलीटर DH 2 ओ में जोड़े agarose भंग करने और एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह के लिए उबाल लें।
  6. बाद भंग agarose का तापमान 50 डिग्री सेल्सियस के नीचे है, 50x क्षारीय बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए यह मिश्रण है और फिर जेल ट्रे में जेल डालो। जेल कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले पर जमना के लिए समय की अनुमति दें।
  7. linearized डीएनए नमूने के 20 μl 0.5 एम EDTA के 4 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. 6x क्षारीय जेल लोड हो रहा बफर जोड़ें (300 मिमी NaOH, 6 मिमी EDTA, 18% (डब्ल्यू / वी) उच्च आणविक भार polysaccharide, 0.06% Bromocresol ग्रीन DH 2 हे में) नमूने के लिए और एक 1 केबी डीएनए सीढ़ी है।
    नोट: यह 6x क्षारीय जेल लोड हो रहा बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, कृपया चर्चा देखें।
  9. ठंडे कमरे में जेल पर लोड नमूने और सेमी प्रति 3.2 वोल्ट पर 1x क्षारीय बफर (12-16 घंटा) में रात भर चला। एक बार नमूने जेल में प्रवेश किया है, यह अस्थायी से रोकने के लिए जेल के शीर्ष पर एक गिलास प्लेट जगह है।
  10. निराकरण बफर [1 एम Tris-सीएल (7.6 पीएच), 1.5 एम NaCl, 3 एम सोडियम एसीटेट (5.2 पीएच)] कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए जेल में भिगोने से नमूने बेअसर।
  11. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 50 मिलीलीटर पानी में 1% ethidium ब्रोमाइड (EtBr) के 4 μl के साथ डीएनए के लिए जेल दाग। 15 मिनट के लिए पानी के साथ destain। एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके डीएनए कल्पना।
    सावधानी: EtBr एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है और त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है। EtBr के साथ सीधे संपर्क से बचें।

2. अभिकर्मक और मानव कोशिकाओं में TFO निर्देशित आईसीएल युक्त plasmids के Immunoprecipitation

  1. प्लेट 400,000 स्तनधारी कोशिकाओं (जैसे, U2OS ओsteosarcoma कोशिकाओं) 60 मिमी पकवान प्रति Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एंटीबायोटिक दवाओं के बिना अभिकर्मक पहले 24 घंटा के साथ पूरक। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. एक पानी के स्नान में अभिकर्मक, गर्म विकास मीडिया और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 37 डिग्री सेल्सियस से पहले। कमरे के तापमान को अभिकर्मक अभिकर्मक गर्म।
  3. पर 10 मिनट के लिए 1x विकास मीडिया के 500 μl (मिक्स 1) और 2 TFO-निर्देश अलग से 14 मिलीलीटर में आईसीएल युक्त 1x विकास मीडिया (मिश्रण 2) के 500 μl में plasmids दौर नीचे ट्यूब की माइक्रोग्राम साथ अभिकर्मक अभिकर्मक के 30 μl सेते कमरे का तापमान।
  4. मिक्स 1, मिश्रण करने के लिए 2 ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से जोड़ें। कमरे के तापमान पर 25-30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. कोशिकाओं को गर्म पीबीएस के साथ दो बार धोएं। एक बूंद के लिहाज से फैशन कोशिकाओं की थाली भर में समान रूप से वितरण में अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। थाली करने के लिए विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 2 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए। हम मिक्सकरूँगा। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति प्लेटों 4 घंटे के लिए रखें।
  6. 10% FBS के साथ पूरक 3 मिलीग्राम विकास मीडिया के साथ मीडिया की जगह है, और 16 घंटे के लिए आगे सेते हैं। एंटीबायोटिक दवाओं का प्रयोग न करें।
  7. लगभग 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रति प्लेट 37% ताजा formaldehyde के 80 μl साथ कोशिकाओं का इलाज और प्रकाश की अनुपस्थिति में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    सावधानी: संक्रामक विषैला होता है और अपनी सुरक्षा के निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। संक्रामक जोखिम त्वचा, आंख और श्वसन तंत्र के लिए नुकसान का कारण बन सकता है।
  8. ठंडा ग्लाइसिन (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में आपूर्ति) प्रति प्लेट के 300 μl जोड़ने और 5 मिनट के लिए incubating द्वारा formaldehyde crosslinking बुझाने। मीडिया निकालें और ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धोने, और फिर एक microcentrifuge ट्यूब में ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस 1 मिलीलीटर में scraping द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। सभी समय पर बर्फ पर नमूने रखें।
  9. 5 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuging द्वारा सेल छर्रों तैयार13,400 एक टेबलटॉप प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग XG टी। Pipet बाहर तैरनेवाला और बर्फ पर सेल गोली जगह है।
  10. समान रूप से 1 मिलीलीटर ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) बफर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में आपूर्ति) में गोली resuspend और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। inverting ट्यूब द्वारा कभी कभी मिक्स। पहले के रूप में (ऊपर 2.9 कदम देखें) गोली कोशिकाओं।
  11. समान रूप से 1 मिलीलीटर में गोली ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) बफर बी (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में आपूर्ति) resuspend और inverting द्वारा कभी कभी मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं के रूप में पहले (ऊपर 2.9 कदम देखें)।
  12. ठंडा बफर बी 200 μl में कोशिकाओं को फिर से Resuspend micrococcal nuclease (MNase) के 2 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। ट्यूब flicking द्वारा कभी कभी प्रतिक्रिया मिश्रण। बर्फ पर ट्यूब रखने और 40 मिमी EDTA जोड़कर MNase प्रतिक्रिया बंद करो। पहले के रूप में (ऊपर 2.9 कदम देखें) गोली कोशिकाओं।
  13. 100 μl 1x क्रोमेटिन immunopr में Resuspend कोशिकाओंecipitation बफर (चिप) बफर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में आपूर्ति) protease अवरोध कॉकटेल के साथ पूरक।
  14. एक पतली दीवारों microfuge ट्यूब में resuspended कोशिकाओं रखें। 20 बर्फ पर 20 सेकंड ऊष्मायन द्वारा पीछा सेकंड के लिए पानी स्नान sonicator पर उन्हें अस्थायी द्वारा नमूने Sonicate। दोहराएँ sonication 9 बार कदम 800-1,200 बीपी टुकड़े उत्पन्न करने के लिए ~।
    1. sonicated नमूने के 20 μl के लिए vortexing द्वारा अच्छी तरह से 3 μl 5 एम NaCl और 1 μl RNase ए मिश्रण जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बाद में, 2 μl proteinase कश्मीर जोड़ें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर नमूने शुद्ध। 1% agarose जेल पर चलाने के नमूने और EtBr के साथ कल्पना।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप डीएनए की अधिकतम तीव्रता में या 1,000 बीपी के तहत होना चाहिए।
  15. तीन अलग-अलग ट्यूबों में, एक पूर्व ठंडा siliconized ट्यूब में lysate के 30 μl जोड़ें और फिर कहा प्रोटीज अवरोधकों के साथ ठंडा 1x चिप बफर के 70 μl जोड़ें। 1 μ जोड़ेविरोधी इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) (एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में), विरोधी हिस्टोन H3, या विरोधी HMGB1 एंटीबॉडी संबंधित ट्यूबों के लिए जी। निरंतर रोटेशन के साथ एक ठंडे कमरे में रात भर सेते हैं।
  16. समान रूप से ठंडे कमरे में Resuspend प्रोटीन जी मोती। ट्यूब प्रति प्रोटीन जी मोतियों की 4 μl जोड़ें और रोटेशन के साथ ठंडे कमरे में एक और 2-4 घंटे के लिए सेते हैं।
  17. एक चुंबकीय रैक का उपयोग करना, मोती गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 200 μl 1x चिप बफर protease अवरोध कॉकटेल के साथ मिश्रित गोली में जोड़ें और रोटेशन के साथ ठंडे कमरे में 5 मिनट के लिए धो लें। दो बार धोने दोहराएँ।
  18. उच्च नमक 1x चिप बफर (युक्त 70 मिमी NaCl) के साथ एक अतिरिक्त धोने प्रदर्शन करना।
  19. 160 μl क्षालन बफर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में आपूर्ति) के साथ छर्रों Resuspend और 30 मिनट के लिए रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  20. मोती गोली और एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। 5 एम NaCl के 6 μl और proteinase कश्मीर के 2 μl जोड़ें, और 65 में रातोंरात सेतेसी।
  21. डीएनए एक पीसीआर उत्पाद शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध और डीएनए 50 μl DH 2 ओ का उपयोग कर elute
  22. पीसीआर प्रदर्शन 16 प्रतिक्रियाओं ब्याज के क्षेत्र (एस) के प्राइमर सेट का उपयोग कर, और एक 1% agarose EtBr के साथ दाग जेल पर उत्पादों को हल।

3. सुपर कॉइलिंग परख और 2-आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. डीएनए की मरम्मत संश्लेषण बफर तैयार (45 मिमी Hepes-कोह, पीएच 7.8, 70 मिमी KCl, 7.4 मिमी 2 MgCl, 0.9 मिमी डीटीटी; 0.4 मिमी EDTA, 2 मिमी एटीपी, 20 माइक्रोन के dNTPs, 3.4% ग्लिसरॉल और 18 माइक्रोग्राम गोजातीय सीरम albumin) । -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। बर्फ और पूर्व पर पिघलना 40 मिमी phosphocreatine और 2.5 माइक्रोग्राम क्रिएटिन phosphokinase जोड़ने का उपयोग करने के लिए।
  2. कमरे के तापमान पर 10x सुपर कॉइलिंग बफर [500 मिमी Tris (पीएच 8.0), 500 मिमी NaCl, 25 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EDTA], और दुकान तैयार करें।
  3. पूरी तरह से 1x के साथ 1 μl चेचक topoisomerase मैं (5-15 यू / μl) का उपयोग supercoiled प्लाज्मिड pSupFG1 डीएनए के 300 एनजी Linearizeएक 10 μl प्रतिक्रिया में सुपर कॉइलिंग बफर। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
  4. बर्फ पर पिघलना हेला सेल मुक्त निकालने 24। पूरी तरह से आराम करने के लिए plasmids, 25 μl हेला सेल मुक्त निकालने और डीएनए की मरम्मत संश्लेषण बफर जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रण करने के लिए चेचक topoisomerase मैं के अतिरिक्त 1 μl जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) (1% अंतिम एकाग्रता) और proteinase कश्मीर (0.25 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़कर प्रतिक्रियाओं बर्खास्त। 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 1x Tris Borate EDTA (TBE) बफर के साथ एक 1% agarose जेल डाली। डीएनए लोडिंग डाई जोड़ें और जेल में कम से कम 4 गलियों के अलावा पर सीधे प्रतिक्रियाओं लोड। topoisomers को हल करने के लिए कमरे के तापमान पर 2 वी / 1x TBE में सेमी (आयाम 1) में 8-10 घंटे के लिए जेल चला।
    नोट: Tris आधार के 54 ग्राम जोड़कर DH 2 हे का 1 एल में एक 5x TBE शेयर समाधान तैयार है। बोरिक एसिड का 27.5 जी और 0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) के 20 मिलीलीटर।
  7. 1x के 2 एल तैयार3 माइक्रोग्राम / एमएल क्लोरोक्विन फॉस्फेट के साथ TBE। 20 मिनट के लिए इस समाधान की 200 मिलीलीटर में जेल लेना। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ जेल ट्रे कवर।
  8. दूसरा आयाम में जेल Electrophorese करने के लिए, एक घड़ी की फैशन में जेल 90 डिग्री बारी है और सकारात्मक और नकारात्मक supercoils को हल करने के लिए 2 वी / 1x TBE युक्त क्लोरोक्वीन में सेमी में 4-6 घंटे के लिए इसे चलाते हैं।
  9. एक घुमाव पर 1 घंटे के लिए EtBr के साथ जेल दाग। 15 मिनट के लिए DH 2 हे के साथ जेल destain और बाद में एक इमेजर का उपयोग कर topoisomers के थर्मल वितरण कल्पना।

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Representative Results

TFO निर्देशित आईसीएल का गठन प्लाज्मिड आधारित assays है, जो मानव कोशिकाओं में आईसीएल प्रसंस्करण में वास्तु प्रोटीन की भूमिकाओं से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के लिए महत्वपूर्ण है। अप्राकृतिकरण agarose जेल वैद्युतकणसंचलन TFO निर्देशित आईसीएल के गठन की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सतही तरीका है। Plasmids शरण TFO निर्देशित ICLs agarose जेल मैट्रिक्स (चित्रा 1 ए, 3 लेन) जब संयुक्त राष्ट्र के crosslinked नियंत्रण plasmids (चित्रा 1 ए, 2 लेन) की तुलना के माध्यम से एक धीमी गतिशीलता के साथ पलायन। गलियों 2 और 3 (चित्रा 1 ए) में बैंड की मात्रा का ठहराव densitometric प्लाज्मिड की आबादी का लगभग 70%, धीमा गतिशीलता (एक काला तीर द्वारा की पहचान) के साथ जेल के माध्यम से migrates उन plasmids पर TFO निर्देशित आईसीएल गठन का संकेत पता चलता है।

क्रोमेटिन immunoprecipitation मानव U2OS कोशिकाओं टीआर से निष्कर्षों पर प्रदर्शन assaysया तो नियंत्रण प्लाज्मिड (पी) या TFO निर्देशित ICLs युक्त plasmids के साथ ansfected (पी-आईसीएल) नियंत्रण (पी) क्षेत्र, (चित्रा 2 जब एक विरोधी HMGB1 एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated की तुलना में पी-आईसीएल क्षेत्र में HMGB1 के शो संवर्धन शीर्ष पैनल, गलियों 2 और 3)। इन परिणामों से संकेत मिलता है मानव कोशिकाओं में ICLs के साथ कि HMGB1 एसोसिएट्स। जब HMGB1 siRNA उपचार के माध्यम से कोशिकाओं से समाप्त हो गया था, पी-आईसीएल-विशिष्ट संवर्धन कम हो गया था (चित्रा 2, शीर्ष पैनल, गलियों 4 और 5), के रूप में की उम्मीद है। जब एक ही नमूने एक एंटीबॉडी विशिष्टता नियंत्रण के रूप में एक विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitated रहे थे, कोई पीसीआर प्रवर्धन का पता चला था, उम्मीद के रूप में (चित्रा 2, शीर्ष पैनल, गलियों 6-10)। चित्रा 2 में लेन 10-14 (शीर्ष पैनल) इनपुट सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया नमूने थे। शीर्ष पैनल जब के लिए बाहर का प्राइमरों TFO निर्देशित पीसीआर प्रवर्धन TFO निर्देशित आईसीएल साइट और नीचे पैनल के पास प्राइमरों द्वारा पीसीआर प्रवर्धन शोआईसीएल साइट का इस्तेमाल किया गया था।

HMGB1 एक वास्तुशिल्प प्रोटीन है, जो उच्च आत्मीयता के साथ विकृत डीएनए को बांधता तुलना में यह undamaged डीएनए बांधता है। डीएनए सुपर कॉइलिंग दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से हल assays TFO निर्देशित आईसीएल युक्त plasmids (पी-आईसीएल) हेला सेल के अर्क में HMGB1 (चित्रा 3) द्वारा plasmids (पी) को नियंत्रित करने के लिए तुलना की स्थापत्य संशोधन प्रदर्शित करता है। वास्तु संशोधन substrates पी-आईसीएल युक्त पर अधिमानतः HMGB1 से प्रेरित नकारात्मक सुपर कॉइलिंग में वृद्धि के रूप में पाया जाता है। Supercoiled प्लास्मिड आराम या रैखिक प्लास्मिड के सापेक्ष agarose जैल के माध्यम से तेजी से पलायन। Topoisomers का वितरण HMBG1 की उपस्थिति में पी (चित्रा 3) की तुलना में पी-ICLs के अधिक सुपर कॉइलिंग इंगित करता है। क्लोरोक्वीन की उपस्थिति में दूसरा आयाम के रूप में बाएं हाथ के चाप नकारात्मक supercoiled डीएनए चलाता है। सुपर कॉइलिंग पी-आईसीएल पर HMGB1 से प्रेरितज्यादातर topoisomers कि एक बाएं हाथ के चाप (~ 14 topoisomers नियंत्रण प्लाज्मिड से ~ 7 topoisomers की तुलना में TFO निर्देशित आईसीएल plasmids युक्त पर पहचान की गई है) के रूप में, नकारात्मक supercoils के गठन का संकेत से मिलकर लगता है। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों का सुझाव है कि TFO निर्देशित ICLs साथ plasmids क्रोमेटिन immunoprecipitation assays के माध्यम से मानव कोशिकाओं में डीएनए घावों के साथ वास्तु प्रोटीन HMGB1 के उच्च आत्मीयता एसोसिएशन अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, HMGB1 द्वारा पी-आईसीएल substrates के विशिष्ट वास्तु संशोधनों भी सुपर कॉइलिंग assays और दो आयामी agarose जैल का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: क्षारीय agarose जेल वैद्युतकणसंचलन परख प्लाज्मिड pSupFG1 पर TFO निर्देशित आईसीएल गठन दक्षता यों की (ए) लेन 1, 1 केबी डीएनए सीढ़ी;। 2 लेन, पीएलasmid pSupFG1 (पी) के एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया; और 3 लेन, TFO निर्देशित आईसीएल युक्त pSupFG1 (पी-आईसीएल)। plasmids ICLs शरण जेल में और अधिक धीरे विस्थापित के रूप में 3 लेन (जेल के दाहिने हाथ की ओर काला तीर द्वारा संकेत) में प्रदर्शन किया। (बी) densitometric 2 लेन और 3 लेन में बैंड की मात्रा का ठहराव संकेत मिलता है कि plasmids के लगभग 70% Crosslinked हैं। यह आंकड़ा संदर्भ 16 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: TFO निर्देशित crosslinked प्लाज्मिड के आईसीएल युक्त क्षेत्र पर HMGB1 की चिप परख प्रदर्शन संवर्धन (ए)। immunoprecipitated टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन r थेसे; (P1 और P2, शीर्ष पैनल बी) और एक विशिष्टता नियंत्रण है कि आगे (लगभग 2,000 बीपी) के रूप में इस्तेमाल कर रहे थे प्राइमरों की एक दूसरे सेट में एक 1% agarose जेल TFO निर्देशित आईसीएल स्थल के निकट समीपस्थ प्राइमरों का एक सेट का उपयोग करने पर esolved साइट निर्देशित आईसीएल (बी, पी 3 और पी 4, नीचे पैनल)। गलियों 2 और 3 TFO निर्देशित आईसीएल के पास HMGB1 के संवर्धन से संकेत मिलता है (3 लेन) undamaged डीएनए (2 लेन) के सापेक्ष। लेन 4 और 5 एक आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग एंटीबॉडी विशिष्टता नियंत्रण कर रहे हैं। लेन 6 और 7 इनपुट नमूने हैं। लेन 8 पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण है और कोई डीएनए टेम्पलेट शामिल हैं। पी, प्लाज्मिड pSupFG1। पी-आईसीएल, TFO निर्देशित आईसीएल युक्त प्लाज्मिड pSupFG1। यह आंकड़ा संदर्भ 16 से संशोधित किया गया है। (बी) प्लाज्मिड P1 और p2 के रूप में अच्छी तरह के रूप में पी 3 और पी 4 के लिए प्राइमर साइटों दिखा pSupFG1 का एक योजनाबद्ध आरेख। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।

चित्र तीन
चित्रा 3: 2 डी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन TFO निर्देशित आईसीएल युक्त plasmids में नकारात्मक supercoils के दिखा गठन, HMGB1 द्वारा सुविधा 1x TBE agarose जेल लड़का (पी) प्लाज्मिड द्वारा उत्पन्न topoisomers के थर्मल वितरण का पता चलता है या psoralen-Crosslinked। प्लाज्मिड (पी-आईसीएल)। supercoiled प्रजातियों की गतिशीलता तेजी से आराम plasmids की तुलना में है। प्रत्येक बैंड एक topoisomer कि, एक कम या अधिक superhelical बारी से नीचे या ऊपर बैंड से अलग क्रमशः प्रतिनिधित्व करता है। बाएं हाथ के चाप नकारात्मक supercoiled प्रतिनिधित्व करता है (ve) प्रजातियों और दाएं हाथ चाप सकारात्मक supercoiled प्रतिनिधित्व करता है (+ ve) प्रजातियों। psoralen आईसीएल युक्त प्लाज्मिड आबादी (पी-आईसीएल) अधिक supercoiled नियंत्रण plasmids (पी) की तुलना में प्रजातियों में शामिल है। आर, आराम plasmids; एस, supercoiled प्लास्मिड; -1 डी,जेल वैद्युतकणसंचलन का पहला आयाम; 2 डी, जेल वैद्युतकणसंचलन का दूसरा आयाम। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

(अपने लक्ष्य के लिए TFO के बंधन आत्मीयता पर निर्भर अपने लक्ष्य डीएनए सब्सट्रेट के साथ TFO की ऊष्मायन के पहले, उचित बफर घटक (जैसे, MgCl 2) और समय: TFO निर्देशित ICLs के कुशल गठन के दो महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर है डुप्लेक्स, और सांद्रता) का इस्तेमाल किया; और दूसरा, यूवीए की उचित खुराक (365 एनएम) विकिरण कुशलता psoralen crosslinks के रूप में। इष्टतम Triplex गठन एचपीएलसी या जेल शुद्ध TFOs उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। TFO दूषित दोष अवांछित Crosslinked उत्पादों, जो आगे प्रयोगात्मक परिणाम जटिल हो सकता है हो सकता है। covalently एक 5'-एचएमटी psoralen से जुड़ी TFOs की स्थिरता को बढ़ाने के लिए, TFOs -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहित किया जाना चाहिए, के रूप में TFOs के कई फ्रीज पिघलना ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स की गिरावट में परिणाम हो सकता है। Triplex गठन के बाद एक विशिष्ट साइट पर psoralen निशाना बनाने के लिए (जैसे, 5'-टीए-3 'और 5'-AT-3' कर रहे हैं पूर्वferred psoralen साइटों crosslinking), psoralen आईसीएल गठन यूवीए के साथ विकिरण की आवश्यकता है। 1.8 जम्मू / 2 सेमी यूवीए की एक खुराक इन विट्रो में plasmids पर ICLs का इष्टतम गठन के लिए पर्याप्त है। जोखिम समय एक दीप्तिमापी का उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए। यूवीए दीपक स्रोत पर निर्भर करता है, 365 एनएम पर यूवी उत्सर्जन के अलावा, दीपक भी तरंग दैर्ध्य है, जो डीएनए रीढ़ की हड्डी के दौरान अनायास ही डीएनए की क्षति के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं फेंकना सकता है। TFO निर्देशित आईसीएल युक्त plasmids एक विशिष्ट साइट पर एक आईसीएल के डीएनए की मरम्मत से संबंधित अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, क्योंकि ऐसा अनायास ही photoproducts डीएनए की मरम्मत के अध्ययन के परिणाम उलझाना सकता है। इसलिए, एक Mylar फिल्टर तरंग दैर्ध्य के लिए नमूने के प्रदर्शन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सफल आईसीएल गठन भी यूवीए विकिरण के दौरान Triplex संरचना की स्थिरता पर निर्भर करता है। आवश्यक पराबैंगनी विकिरण के समय यूवीए स्रोत की वाट क्षमता पर निर्भर करता है। हमारे मामले में, 20-30 मिनट वें उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैई वांछित यूवीए की खुराक। इस समय के दौरान, दीपक द्वारा उत्पन्न गर्मी के नमूनों से बाष्पीकरणीय पानी की कमी हो सकती है। इस तरह के पानी की कमी बफर एकाग्रता को बदल सकता है और triplex संरचनाओं की अस्थिरता का कारण बन सकता है। यूवीए विकिरण के दौरान बर्फ पर प्रतिक्रियाओं रखकर नमूने के वाष्पीकरण को रोकने में मदद मिलेगी।

आदेश प्लाज्मिड substrates पर psoralen Crosslink गठन की क्षमता का निर्धारण करने के लिए, नमूने 1% क्षारीय agarose जैल में (चित्रा 1) सुलझाया गया। क्षारीय जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए सबसे प्रोटोकॉल, एक 2x क्षारीय जेल लोडिंग डाई का सुझाव है, हालांकि कुछ प्रोटोकॉल का सुझाव है कि क्षारीय लोडिंग डाई आवश्यक नहीं है, के रूप में जेल की अप्राकृतिकरण बफर हालत नमूनों denature करने के लिए पर्याप्त है। एक 2x डाई केंद्रित डीएनए नमूनों के साथ अच्छी तरह से काम करता है, इस प्रोटोकॉल एक बड़ा नमूना मात्रा लोड की आवश्यकता है। इसलिए, एक 6x क्षारीय जेल लोडिंग डाई का उपयोग करें। psoralen PL crosslinked के समुचित विकृतीकरण सुनिश्चित करने के लिएasmid substrates, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए लोड हो रहा है बफर में नमूने सेते हैं। इसके अलावा, 2 मिलीग्राम + मिलीग्राम (OH) क्षारीय परिस्थितियों में 2, जो डीएनए entraps और यह वेग को पैदा कर सकता है फार्म कर सकते हैं। Triplex के गठन प्रतिक्रिया बफर 2 मिलीग्राम + होता है, और इसलिए यह EDTA के साथ नमूने सेते हैं सुनिश्चित करने के लिए कि 2 मिलीग्राम + नमूने के क्षारीय लोडिंग डाई जोड़ने से पहले chelated है महत्वपूर्ण है। वैद्युतकणसंचलन के बाद, यह जेल बेअसर करने के लिए, के रूप में EtBr क्षारीय परिस्थितियों में डीएनए के साथ intercalate नहीं है महत्वपूर्ण है।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण TFO निर्देशित Crosslink गठन की क्षमता का आकलन करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing का इस्तेमाल होता है, लेकिन इस तकनीक को और अधिक श्रमसाध्य है, और plasmids टुकड़े के रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबलिंग के द्वारा पीछा के प्रतिबंध पाचन की आवश्यकता है। यह वर्तमान दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत सरल, डी करने के लिए अभी तक प्रभावी तरीका दर्शाता हैप्लाज्मिड substrates पर TFO निर्देशित आईसीएल के गठन की दक्षता etermine। हालांकि, इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से अन्य Crosslink के गठन एजेंटों द्वारा ICLs के गठन का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

प्लाज्मिड चिप परख के सफल परिणाम के लिए कई कारकों पर निर्भर करता है। प्रोटोकॉल और समस्या निवारण सुझावों के भीतर महत्वपूर्ण कदम यहां चर्चा कर रहे हैं। गंभीर इस परख में शामिल कदम, formaldehyde crosslinking, micrococcal nuclease पाचन, sonication, नमूना washes, और नमूने में formaldehyde प्रोटीन डीएनए crosslinks के उलट शामिल हैं। कुशल प्रोटीन डीएनए crosslinking के लिए, यह ताजा formaldehyde का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। 37% formaldehyde के शेयर बोतलें रोशनी करने के लिए, उद्घाटन के बाद अधिक से अधिक छह महीने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए जोखिम के रूप में और ऑक्सीजन formaldehyde degrades। इसलिए, यह भी सेल संस्कृति हुड में प्रकाश के बिना formaldehyde crosslinking प्रदर्शन करने के लिए फायदेमंद है। एक और महत्वपूर्ण कदम micrococcal nuclease (MNase) digestio हैनमूने के एन। MNase पाचन न केवल cleaves छोटे टुकड़ों में जीनोमिक डीएनए लेकिन यह भी किसी भी सुस्त plasmids कि अभिकर्मक विधि है, जो नाटकीय रूप से कम कर सकते हैं पृष्ठभूमि के दौरान कोशिकाओं में वितरित नहीं किए गए थे हटा। MNase पाचन की ऊष्मायन समय अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। अब पाचन, नमूने के नुकसान में परिणाम है, जबकि कम ऊष्मायन अवधि अवांछित डीएनए का अकुशल हटाने के लिए नेतृत्व कर सकता है। उत्कृष्ट परिणाम नलियों inverting द्वारा प्रतिक्रियाओं की सामयिक मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट ऊष्मायन के बाद देखा जा सकता है। कुशल immunoprecipitation के लिए, डीएनए 800-1,200 बीपी के बीच आकार के लिए खंडित किया जाना चाहिए। डीएनए के इस तरह के विखंडन के नमूनों की गहन sonication के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। नमूने के कुशल sonication पतली दीवारों पीसीआर नलियों में छर्रों को फिर से निलंबित और बाद में उन्हें एक पानी के स्नान sonicator में रखकर हासिल की जा सकती है। ध्वनि दालों सतत sonication की तुलना में अधिक प्रभावी हैं। addit मेंआयन, यह दालें प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए के बीच बर्फ पर नमूने जगह के लिए महत्वपूर्ण है, और यह भी, प्रोटीज अवरोधकों के साथ 1x चिप बफर के पूरक के रूप में स्थिर प्रोटीन एंटीबॉडी मान्यता और बाद में वर्षा चरणों के लिए आवश्यक हैं महत्वपूर्ण है। हालांकि, immunoprecipitation प्रक्रिया के दौरान, चुंबकीय मोतियों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, गैर विशिष्ट डीएनए नीचे खींच लिया जाएगा। इस तरह के गैर विशिष्ट टेम्पलेट्स से संकेतों को कम करने के लिए, कठोर धोने बिल्कुल जरूरी है। अन्त में, नमूने के प्रोटीन डीएनए crosslinks के समुचित उलट immunoprecipitated टेम्पलेट्स की पीसीआर प्रवर्धन के लिए आवश्यक है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, नमूने एसडीएस और proteinase लालकृष्ण साथ कम से कम 12 घंटे के लिए incubated किया जाना चाहिए जीनोमिक चिप assays पर एक प्लाज्मिड आधारित चिप परख का उपयोग कर के लाभ कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, लक्षित डीएनए की क्षति को आसानी से एक जीनोमिक ठिकाना में TFO-लक्षित घाव गठन की तुलना में एक प्लास्मिड डीएनए सब्सट्रेट और एक TFO का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। द एसब्सट्रेट के पहाड़ भी जब एक TFO-लक्षित क्षतिग्रस्त प्लाज्मिड का उपयोग कर संकेतों की तीव्रता मिलाना नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के substrates पसंद के किसी भी कोशिका लाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है और विभिन्न उम्मीदवार प्रोटीन के साथ सहयोग के लिए परीक्षण किया है, इस प्रकार के प्रसंस्करण और ICLs की मरम्मत पर अध्ययन के दायरे का विस्तार।

सुपर कॉइलिंग परख रैखिक और supercoiled प्लास्मिड डीएनए के बीच आकार में अंतर के आधार पर किया जाता है। Supercoiled डीएनए plasmids अधिक कॉम्पैक्ट हैं और आराम से plasmids की तुलना में जेल मैट्रिक्स के माध्यम से तेजी से पलायन। प्रोटोकॉल और समस्या निवारण सुझावों के भीतर महत्वपूर्ण कदम यहां चर्चा कर रहे हैं। क्योंकि वास्तु प्रोटीन क्षतिग्रस्त डीएनए substrates, आराम plasmids के सुपर कॉइलिंग की प्रेरण के माध्यम से मापा पर topological संशोधनों की सुविधा है, यह पूरी तरह से topoisomerase I. साथ plasmids आराम करने के लिए महत्वपूर्ण है यह डीएनए छूट की हद तक agarose जेल के माध्यम से topoisomerase मैं की वजह से जांच करने के लिए आवश्यक है वैद्युतकणसंचलन।सुपर कॉइलिंग बफर में 2 MgCl वर्तमान समय के साथ तेज़ कर सकते हैं, और 2 MgCl की उपस्थिति सकारात्मक supercoils के गठन की सुविधा से सकारात्मक और नकारात्मक supercoils के थर्मल वितरण को प्रभावित करता है। इसलिए, यह मिश्रण करने के लिए अलग से 2 MgCl जोड़ने या ताजा बफर हर बार तैयार करने के लिए फायदेमंद है। (~ 2 वी / सेमी) तो डीएनए की है कि मुख्य रूप से प्रवास के अणुओं की संरचना / आकार पर आधारित है प्लाज्मिड आबादी के topoisomers अलग करने के लिए, यह एक बहुत कम वोल्टेज पर जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। अगर topoisomerase मैं द्वारा plasmids की छूट पूरा नहीं हुआ है, तो ऊष्मायन समय और / या इस्तेमाल किया एंजाइम की राशि में वृद्धि की जानी चाहिए। पूरी छूट बाद में डीएनए सुपर कॉइलिंग कदम पर चलती है क्योंकि अधूरे आराम plasmids के साथ सुपर कॉइलिंग परख के उपयोग के डेटा की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और परिणामों को दोहराने के लिए मुश्किल हो सकता है इससे पहले यह सुनिश्चित किया जाना है। एक बार जब complEte छूट हासिल किया गया है, सुपर कॉइलिंग परख प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। इस परख के एक महत्वपूर्ण घटक एक डीएनए की मरम्मत संश्लेषण बफर का इस्तेमाल होता है। phosphocreatine और creatine phosphokinase मिश्रण करने के लिए हर बार एटीपी उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए आवश्यक हैं। सुपर कॉइलिंग कदम के बाद, यह एसडीएस और proteinase लालकृष्ण एसडीएस डीएनए से प्रोटीन को अलग करने में सहायता करता है और proteinase कश्मीर प्रोटीन है, जो डीएनए सुपर कॉइलिंग के विभिन्न स्तरों के साथ बरकरार पत्ते degrades साथ incubating द्वारा प्लास्मिड डीएनए से प्रोटीन को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रोटीन पूरी तरह से हटा नहीं है, तो topoisomers के थर्मल वितरण स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं होगा। क्लोरोफॉर्म: डीएनए से फिनोल शुद्ध नहीं किया जा सकता isoamyl शराब और इथेनॉल उपजी है क्योंकि इस विधि (और अन्य) कर सकते हैं निक डीएनए, सुपर कॉइलिंग के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप। एक और महत्वपूर्ण कदम बफर करने के लिए क्लोरोक्वीन के अतिरिक्त है। क्लोरोक्विन एक intercalating एजेंट है और डीएनए unwinds। के ऊपरमध्यनिवेश, यह नकारात्मक supercoiled डीएनए को आराम से और आराम डीएनए जो सुपर कॉइलिंग के एक उच्च घनत्व वाले topoisomers की जुदाई की सुविधा के लिए सकारात्मक सुपर कॉइलिंग का परिचय। इस प्रकार के सकारात्मक और नकारात्मक supercoils भेदभाव किया जा सकता है। यह आम तौर पर एक सतही प्रयोग है और जब सभी अंक ऊपर माना जाता है अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

हालांकि, अगर कोई सुपर कॉइलिंग स्पष्ट है, तो यह जरूरी है कि ब्याज की प्रोटीन की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए है। 2 डी सुपर कॉइलिंग परख वास्तु प्रोटीन 27 से मदद की topological संशोधनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस परख मानव कोशिकाओं में TFO निर्देशित ICLs के डीएनए की क्षति प्रसंस्करण के संदर्भ में यहां इस्तेमाल किया गया है। HMGB1, उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ TFO निर्देशित ICLs को बांधता है, जैसा कि पहले इन विट्रो जेल electrophoretic गतिशीलता पारी assays 20 के माध्यम से और प्लाज्मिड चिप परख 16 में वर्णित का उपयोग मानव कोशिकाओं में प्रदर्शन किया। इधर, यू2 डी सुपर कॉइलिंग परख यह दिखा दिया है कि substrates पर नकारात्मक सुपर कॉइलिंग के गठन में सेल मुक्त अर्क, HMGB1 सहायता हेला में TFO निर्देशित ICLs के लिए बाध्य पर (चित्रा 3), जो की मरम्मत में एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है गाना घाव क्योंकि नकारात्मक सुपर कॉइलिंग एनईआर मार्ग 25 के माध्यम से डीएनए की क्षति को हटाने की सुविधा के लिए जाना जाता है। वहाँ कई वास्तु प्रोटीन है कि डीएनए की क्षति प्रसंस्करण में फंसाया गया है कि इस परख का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण में इन विट्रो अध्ययन तक सीमित है, फिर भी, यह डीएनए की क्षति की मरम्मत के संदर्भ में वास्तु प्रोटीन की संरचना समारोह संबंध पूछताछ करने के लिए एक सरल और उपयोगी परख है। हालांकि, चिप प्रोटोकॉल आसानी से, जीनोम के संदर्भ में डीएनए, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है इस तरह के संबंधों से डीएनए सुपर कॉइलिंग पर प्रभाव का आकलन करते हुए काफी मुश्किल साबित हो सकता है। हम और अन्य समूहों वास्तव में पी हैएक जीनोमिक ठिकाना 31-33 और 3) प्लाज्मिड अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं में psoralen संशोधित TFO (और यूवीए विकिरण) को शामिल करके लक्षित करने से erformed Triplex आधारित अध्ययन 1) जीनोम 28-30 2) में डीएनए के स्थिर अभिकर्मक से 10।

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Acknowledgments

लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए Vasquez प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था [CA097175, CA093279 Kmv करने के लिए]; और कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के रिसर्च इंस्टीट्यूट [RP101501]। ओपन एक्सेस चार्ज करने के लिए अनुदान: स्वास्थ्य / के राष्ट्रीय संस्थानों राष्ट्रीय कैंसर संस्थान [KMV को CA093279]।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

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References

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आनुवंशिकी अंक 117 Triplex के गठन oligonucleotide डीएनए की मरम्मत डीएनए interstrand crosslinks प्लाज्मिड चिप परख 2 डी सुपर कॉइलिंग परख HMGB1
हेलिक्स विकृत, साइट-विशिष्ट डीएनए Interstrand crosslinks के प्रसंस्करण में वास्तु प्रोटीन HMGB1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपकरण
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Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

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