Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

Boîte de high mobility group 1 (HMGB1) protéine est une protéine non-histone architecturale qui est impliquée dans la régulation de nombreuses fonctions importantes dans le génome, tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la réparation d'ADN. HMGB1 se lie à l'ADN structurellement déformée avec une affinité supérieure à celle de l'ADN-B canonique. Par exemple, nous avons constaté que la HMGB1 se lie à l'ADN (reticulations interbrins CIST), qui lient de manière covalente les deux brins de l'ADN, provoquent la déformation de l'hélice, et si on les laisse non réparée peut provoquer la mort cellulaire. En raison de leur potentiel cytotoxique, plusieurs agents ICL-inductrices sont actuellement utilisés comme agents chimiothérapeutiques dans la clinique. Alors que les agents ICL formant montrent des préférences pour certaines séquences de base (par exemple, 5'-TA-3 'est le site de réticulation préféré pour psoralène), ils induisent en grande partie des dommages de l' ADN d'une manière aveugle. Cependant, en couplant de façon covalente l'agent induisant la LSC à un oligonucléotide formant triplex (TFO), qui se lie à l'ADN dans une séquence spécifiqueAinsi, des dommages de l'ADN cible peut être atteint. Ici, nous utilisons un TFO conjugué de manière covalente sur 'extrémité à un 4'-hydroxyméthyl-4,5' 5 (HMT) psoralène, 8-triméthylpsoralène pour générer un ICL site spécifique sur un plasmide mutation-reporter pour l'utiliser comme un outil pour étudier la modification architecturale, le traitement et la réparation des lésions de l'ADN complexes par HMGB1 dans les cellules humaines. Nous décrivons les techniques expérimentales pour préparer ICL TFO dirigés sur des plasmides rapporteurs et d'interroger l'association de HMGB1 avec les ICL TFO dirigées dans un contexte cellulaire en utilisant des tests chromatine immunoprécipitation. En outre, nous décrivons des tests de surenroulement de l'ADN pour évaluer la modification d'architecture spécifique de l'ADN endommagé en mesurant la quantité de tours superhélices introduits sur le psoralène réticulé plasmide par HMGB1. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier les rôles des autres protéines impliquées dans le traitement et la réparation des ICL TFO dirigées ou d'autres dommages à l'ADN ciblé dans toute lignée cellulaire d'intérêt.

Introduction

Formant des triplex d' oligonucléotides (OFT) un ADN duplex se lient d'une manière spécifique d' une séquence via une liaison de Hoogsteen d'hydrogène pour former des structures en triple hélice 1-5. La technologie triplex a été utilisé pour interroger une variété de mécanismes biomoléculaires, tels que la transcription, la réparation des dommages de l' ADN et le ciblage génique (passé en revue dans les références 6-8). OFT ont été largement utilisés pour induire des dommages spécifiques au site sur les plasmides rapporteurs 9,10. Notre laboratoire et d' autres ont déjà utilisé un TFO, AG30, attaché à une molécule de psoralène pour induire l' ADN interbrins réticulations spécifiques du site (de ICL) dans le gène supF sur le pSupFG1 plasmidique 5,10-12. ICL sont hautement cytotoxique que ces lésions réticulent de manière covalente les deux brins d'ADN, et si elle unrepaired, peut bloquer la transcription des gènes et empêcher la réplication des machines d'ADN 13,14. En raison de leur potentiel cytotoxique, des agents induisant ICL ont été utilisés comme médicaments chimiothérapeutiques dans le traitementdu cancer et d' autres maladies 15. Cependant, le traitement et la réparation des ICL dans les cellules humaines ne sont pas bien comprises. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le traitement des ICL dans les cellules humaines peut aider à améliorer l'efficacité des régimes chimiothérapeutiques à base d'ICL. ICL TFO-induits et leurs intermédiaires de réparation ont le potentiel de provoquer des distorsions structurelles importantes à l'hélice de l'ADN. De telles distorsions sont des cibles probables pour les protéines d' architecture, qui se lient à l' ADN déformé avec une affinité supérieure à canonique B-forme duplex ADN 16-20. Ici, nous avons étudié l'association d'une protéine architecturale très abondante, HMGB1 avec ICL dans les cellules humaines par l'intermédiaire d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) essais sur des plasmides de psoralène-réticulé et identifié un rôle pour HMGB1 dans la modulation de la topologie de l'ADN plasmidique psoralène réticulé chez l'homme des lysats de cellules cancéreuses.

HMGB1 est une très abondante et ubiquitaire non sonton protéine architecturale qui se lie à l' ADN endommagé et les substrats d'ADN alternativement structurés avec une affinité supérieure canonique forme B de l' ADN 17-20. HMGB1 est impliqué dans plusieurs processus ADN métaboliques, tels que la transcription, la réplication de l' ADN et la réparation d' ADN 16,21-23. Nous avons déjà démontré que HMGB1 se lie à ICL TFO dirigées in vitro avec une grande affinité 20. De plus, nous avons démontré que le manque de HMGB1 a augmenté le traitement mutagène de ICL TFO dirigées et HMGB1 identifié comme une réparation nucleotide excision (NER) co-facteur 23,24. Récemment, nous avons constaté que HMGB1 est associée à ICL TFO dirigées dans les cellules humaines et son recrutement à ces lésions dépend de la protéine NER, XPA 16. Surenroulement négatif de l' ADN a été montré pour favoriser l'élimination efficace des lésions de l' ADN par NER 25, et nous avons constaté que HMGB1 induit surenroulement négatif préférentiellement sur plas ICL contenant TFO dirigéessubstrats milieu ( par rapport aux plasmides substrats non endommagés) 16, fournissant une meilleure compréhension du rôle (s) potentiel de HMGB1 comme un co-facteur de NER. Le traitement des ICL est pas entièrement comprise dans les cellules humaines; ainsi, les techniques et les analyses développées sur la base des outils moléculaires décrits ici pourraient conduire à l'identification de protéines supplémentaires impliquées dans la réparation ICL, qui peut à son tour servir de cibles pharmacologiques qui peuvent être exploitées pour améliorer l'efficacité des traitements de chimiothérapie du cancer.

Ici, une approche efficace pour évaluer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée dans l'ADN plasmidique par électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose a été discuté. En outre, en utilisant les plasmides contenant les ICL TFO dirigées, des techniques pour déterminer l'association de HMGB1 avec des plasmides ICL endommagés dans un contexte cellulaire en utilisant des essais ChIP modifiés ont été décrits. En outre, une méthode facile pour étudier les modifications topologiques introduites par ee protéine HMGB1 architecturale, en particulier sur des substrats de plasmide ICL endommagés dans les lysats de cellules humaines a été déterminée en effectuant des essais de surenroulement par électrophorèse sur gel d'agarose à deux dimensions. Les techniques décrites peuvent être utilisées pour favoriser la compréhension de l'implication de la réparation de l'ADN et des protéines d'architecture dans le traitement des lésions de l'ADN ciblé sur des plasmides dans les cellules humaines.

Nous décrivons des protocoles détaillés pour la formation d'ICL psoralène spécifiques au site TFO dirigés sur l'ADN de plasmide et le plasmide subséquent ChIP et surenroulement des dosages pour identifier des protéines qui associent les lésions et les protéines qui modifient la topologie de l'ADN, respectivement. Ces dosages peuvent être modifiés pour produire avec d'autres agents endommageant l'ADN, OFT, des substrats de plasmide et des lignées de cellules de mammifères présentant un intérêt. En fait, nous avons montré qu'il existe au moins un site potentiel TFO affinité de liaison unique et élevé au sein de chaque gène annoté dans le génome humain 26. Commentjamais, pour plus de clarté, nous avons décrit ces techniques pour l'utilisation d'un TFO spécifique psoralène-conjugué (pAG30) sur un plasmide mutation-rapporteur spécifique (pSupFG1) dans les cellules U2OS humaines que nous avons utilisé dans Mukherjee & Vasquez 2016 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de ICL TFO dirigés sur le plasmide Substrats

  1. Incuber quantités équimolaires de plasmide pSupFG1 10,11 ADN (ADN plasmidique 5 ug est un bon point de départ) avec psoralène conjugué TFO AG30 dans 8 pi de tampon de triplex de liaison [50% de glycérol, Tris 10 mM (pH 7,6), mM MgCl 10 2] , et dH 2 O pour un volume final de 40 pi dans un tube de couleur ambre. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas. Laisser incuber la réaction à 37 ° C bain d'eau pendant 12 heures.
  2. Réchauffez la lampe UVA pour assurer la pleine puissance. Placez la réaction de triplex sur la pellicule de paraffine, et placer le film de paraffine sur la glace sous la (nM 365) lampe UVA. Placer un filtre mylar entre la lampe et la réaction.
  3. UVA irradient pour une dose totale de 1,8 J / cm 2. Conserver les échantillons à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
    Attention: Porter des lunettes de protection et des vêtements avec une irradiation UVA.
  4. Linéariser 200 ng du plasmide préparé ci-dessus avec la restriction enzyme Eco R1 dans un volume total de 20 ul à l' aide du fabricant fourni 10x tampon. Heat dénaturent l'enzyme pendant 20 min à 65 ° C. Faites tourner les échantillons pendant 10 minutes à 10.000 xg et stocker à 4 ° C.
  5. Préparer 50x tampon alcaline [NaOH 1,5 M, 50 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)]. Ajouter 0,5 mg d'agarose à 50 ml dH 2 O. Faire bouillir pour dissoudre l'agarose et le placer dans un bain d'eau à 50 °.
  6. Après que la température de l'agarose dissous est à 50 ° C, ajouter 1 ml de tampon 50x alcaline, mélanger puis verser le gel dans le bac de gel. Prévoyez du temps pour le gel de se solidifier à la température ambiante avant utilisation.
  7. Ajouter 4 ul de 0,5 M d'EDTA à 20 ul d'échantillon d'ADN linéarisée et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante.
  8. Ajouter un tampon de chargement de gel alcalin 6x (NaOH 300 mM, 6 mM d' EDTA, 18% (p / v) d'un polysaccharide de poids moléculaire élevé, à 0,06% de vert de bromocrésol dans dH 2 O) aux échantillons et à une échelle d' ADN de 1 kb.
    NOTE: Il est important d'utiliser un tampon de chargement de gel alcalin 6x, s'il vous plaît voir la discussion.
  9. Charger les échantillons sur le gel dans la chambre froide et courir la nuit dans un tampon alcalin 1x (12-16 h) à 3,2 volts par cm. Une fois que les échantillons sont entrés dans le gel, placer une plaque de verre sur le dessus du gel pour l'empêcher de flotter.
  10. Neutraliser les échantillons par trempage du gel dans un tampon de neutralisation [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M de NaCl, 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2)] pendant 45 min à température ambiante.
  11. Colorer le gel de l'ADN avec 4 ul de 1% de bromure d'éthidium (EtBr) dans 50 ml d'eau pendant 1 heure à température ambiante. Destain avec de l'eau pendant 15 min. Visualiser l'ADN en utilisant un système d'imagerie.
    Attention: EtBr est un mutagène puissant et peut être absorbé par la peau. Éviter tout contact direct avec EtBr.

2. Transfection et immunoprécipitation de ICL contenant Plasmides TFO dirigées dans des cellules humaines

  1. Plate 400.000 cellules de mammifères (par exemple, U2OS ocellules steosarcoma) par boîte de 60 mm dans du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) sans antibiotiques 24 heures avant la transfection. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Avant la transfection, le milieu de croissance chaud et du tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C dans un bain d'eau. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante.
  3. Incuber 30 ul de réactif de transfection avec 500 ul de milieu de croissance 1x (mélange 1) et 2 pg de tubes à fond rond TFO dirigés ICL contenant des plasmides dans 500 ul de 1 x milieu de croissance (mélange 2) dans séparés 14 ml pendant 10 min à température ambiante.
  4. Ajouter mélange 1 à mélanger 2, bien mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 25-30 minutes à la température ambiante.
  5. Laver les cellules deux fois avec du PBS chaud. Ajouter le mélange de transfection d'une manière goutte à goutte répartir uniformément dans toute la plaque de cellules. Ajouter 1 ml de milieu de croissance de la plaque, et amener le volume final à 2 ml. Mélanger nousll. Placez les plaques de culture à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pendant 4 heures.
  6. Remplacer le support avec 3 ml de milieux de croissance supplémenté avec 10% de FBS, et on incube encore pendant 16 heures. Ne pas utiliser des antibiotiques.
  7. Traiter les cellules avec 80 pl de 37% de formaldéhyde fraîche par plaque à une concentration finale d'environ 1% et on incube pendant 10 minutes à la température ambiante en l'absence de lumière.
    Attention: Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. l'exposition au formaldéhyde peut causer des dommages à la peau, des yeux et des voies respiratoires.
  8. Étancher le formaldéhyde réticulant par addition de 300 ul de glycine réfrigérée (fournie dans le kit disponible dans le commerce) par plaque et incuber pendant 5 min. Retirez les médias et laver deux fois avec PBS refroidi, puis recueillir des cellules par grattage dans 1 ml refroidi (4 ° C) PBS dans un tube de microcentrifugeuse. Gardez les échantillons sur la glace en tout temps.
  9. Préparer des pastilles de cellules par centrifugation à 4 ° C pendant 5 min, unet 13.400 xg en utilisant une table réfrigérée centrifugeuse. Pipet le surnageant et placer le culot cellulaire sur la glace.
  10. De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon A (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Mélanger de temps en temps en inversant le tube. cellules à granules comme avant (voir l'étape 2.9 ci-dessus).
  11. De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon B (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min avec un mélange occasionnel par inversion. cellules à granules par centrifugation comme précédemment (voir étape 2.9 ci-dessus).
  12. Resuspendre les cellules à nouveau dans 200 pi réfrigérés Buffer B. Ajouter 2 pl de micrococcique nucléase (MNase) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Mélanger la réaction de temps en temps en tapotant le tube. Arrêter la réaction MNase en plaçant le tube sur de la glace et en ajoutant 40 mM d'EDTA. cellules à granules comme avant (voir l'étape 2.9 ci-dessus).
  13. Resuspendre les cellules dans 100 immunopr chromatine ul 1xecipitation tampon (ChIP) du tampon (fournie dans le kit disponible dans le commerce) additionné de cocktail inhibiteur de protease.
  14. Placez les cellules remises en suspension dans un tube de microcentrifugation à paroi mince. Soniquer les échantillons en les faisant flotter sur l'eau de bain sonicateur pendant 20 secondes puis 20 secondes d'incubation sur de la glace. Répétez les étapes 9 fois sonication pour générer ~ 800-1200 fragments de pb.
    1. 20 ul des échantillons soniqués ajoute 3 ul de NaCl 5 M et 1 pi de RNase A. Bien mélanger par tourbillonnement et on incube à 37 ° C pendant 30 min. Par la suite, ajouter 2 pl Proteinase K et incuber pendant 2 heures à 65 ° C. Purifier les échantillons en utilisant un kit de purification PCR. Exécutez des échantillons sur un gel d'agarose à 1% et visualiser avec EtBr.
      REMARQUE: L'intensité maximale de l'ADN qui en résulte doit être égal ou inférieur à 1000 pb.
  15. Dans trois tubes séparés, ajouter 30 ul de lysat dans un tube siliconé prérefroidi, puis ajouter 70 ul de tampon de puces 1x réfrigérées avec des inhibiteurs de protéase ajoutée. Ajouter 1 μg d'anti-immunoglobuline G (IgG), H3 anti-histones (comme témoin positif) ou des anticorps anti-HMGB1 aux tubes respectifs. Laisser incuber pendant une nuit dans une chambre froide avec une rotation continue.
  16. Resuspendre protéines G perle homogène dans la chambre froide. Ajouter 4 ul de billes de protéine G par le tube et laisser incuber pendant 2-4 heures dans une chambre froide avec une rotation.
  17. L'utilisation d'un support magnétique, sédimenter les billes et retirer le surnageant. Ajouter 200 ul de 1 x tampon ChIP mélangé avec un cocktail inhibiteur de la protéase au culot et laver pendant 5 min dans la chambre froide avec la rotation. Répétez laver deux fois.
  18. Effectuer un lavage supplémentaire avec haute teneur en sel tampon 1x ChIP (contenant 70 mM de NaCl).
  19. Remettre en suspension les pastilles avec un tampon d'élution de 160 ul (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et incuber à 37 ° C avec rotation pendant 30 min.
  20. Pellet les perles et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 6 pi 5 M de NaCl et 2 pl de proteinase K, et incuber une nuit à 65° C.
  21. On purifie l'ADN en utilisant un kit de purification de produit de PCR et éluer l'ADN en utilisant 50 ul dH 2 O.
  22. Effectuer PCR 16 réactions en utilisant des jeux d'amorces pour la région (s) d'intérêt, et de résoudre les produits sur un gel d' agarose 1% coloré avec EtBr.

3. surenroulement Assay et 2 dimensions Agarose Gel Electrophoresis

  1. Préparer l' ADN du tampon de synthèse de réparation (45 mM de Hepes-KOH, pH 7,8, 70 mM de KCl, 7,4 mM MgCl2, DTT mM , 0,9, EDTA 0,4 mM, 2 mM d' ATP, 20 uM de dNTP, 3,4% de glycerol et 18 ug sérumalbumine bovine) . Conserver à -80 ° C. Thaw sur la glace et avant utilisation ajouter 40 phosphocréatine mM et 2,5 pg de la créatine phosphokinase.
  2. Préparer 10x surenroulement tampon [Tris 500 (pH 8,0), NaCl 500 mM, MgCl2 25 mM, EDTA 1 mM], et conserver à la température ambiante.
  3. Linéariser 300 ng d'ADN plasmidique surenroulé pSupFG1 complètement en utilisant 1 ul de virus de la vaccine topoisomérase I (5-15 U / pl), avec 1xtampon de surenroulement dans une réaction de 10 ul. Laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Décongeler HeLa extrait exempt de cellules 24 sur la glace. Pour les plasmides complètement détendus, ajoutez l'extrait exempt de cellules HeLa 25 pi et un tampon de synthèse de réparation d'ADN. Bien mélanger. Ajouter 1 pl supplémentaires de Vaccinia topoisomérase I au mélange, et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  5. Mettre un terme aux réactions par addition de dodécylsulfate de sodium (SDS) (1% en concentration finale) et de la proteinase K (0,25 mg / ml de concentration finale). Incuber à 65 ° C pendant 2 heures.
  6. Couler un gel d'agarose 1% avec 1 x Tris Borate EDTA (TBE). Ajouter colorant de chargement de l'ADN et charger les réactions directement sur le gel au moins 4 voies en dehors. Exécutez le gel pendant 8-10 h à 2 V / cm 1x TBE (dimension 1) à la température ambiante pour résoudre les topo-isomères.
    NOTE: Préparer une solution stock 5x TBE dans 1 L de dH 2 O en ajoutant 54 g de base Tris. 27,5 g d'acide borique et 20 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).
  7. Préparer 2 L de 1xTBE avec 3 pg / ml chloroquine-phosphate. Faire tremper le gel dans 200 ml de cette solution pendant 20 min. Couvrir le plateau de gel avec du papier d'aluminium.
  8. Pour l'électrophorèse du gel dans la deuxième dimension, tourner le gel de 90 ° dans le sens horaire et l'exécuter pour 4-6 heures à 2 V / cm chloroquine contenant 1x TBE pour résoudre les supertours positifs et négatifs.
  9. Colorer le gel avec EtBr pendant 1 heure sur une bascule. Décolorer le gel avec dH2Û pendant 15 min, puis de visualiser la distribution thermique des topo - isomères à l' aide d' une caméra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La formation de la LSC TFO dirigée est essentielle pour les dosages à base de plasmides, qui sont utilisées pour interroger les rôles des protéines architecturales dans le traitement ICL dans les cellules humaines. Dénaturation électrophorèse sur gel d'agarose est un moyen facile de déterminer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée. Les plasmides hébergeant ICL TFO dirigés migrent avec une mobilité plus lente à travers la matrice de gel d'agarose (figure 1A, piste 3), par rapport aux plasmides témoins non réticulé (figure 1A, piste 2). La quantification densitométrique des bandes dans les pistes 2 et 3 (figure 1A) montre environ 70% de la population plasmidique migre à travers le gel avec une mobilité ralenti (identifié par une flèche noire), ce qui indique la formation TFO dirigée ICL sur ces plasmides.

Les analyses d'immunoprécipitation de chromatine effectuées sur des extraits de U2OS humaine cellules transfected soit avec le plasmide de contrôle (P) ou des plasmides contenant ICL TFO-dirigés (P-ICL) montrent un enrichissement de HMGB1 dans la région de P-ICL par rapport à la région de contrôle (P), lorsque immunoprécipité avec un anticorps anti-HMGB1 (Figure 2 , panneau supérieur, pistes 2 et 3). Ces résultats indiquent que les HMGB1 associés avec les ICL dans les cellules humaines. Lorsque HMGB1 a été épuisé dans les cellules via le traitement siRNA, l'enrichissement P-ICL-spécifique a été diminuée (Figure 2, panneau supérieur, pistes 4 et 5), comme prévu. Quand les mêmes échantillons ont été immunoprécipités en utilisant un anticorps anti-IgG en tant que témoin de spécificité d'anticorps, aucune amplification de la PCR a été détectée, comme prévu (figure 2, panneau supérieur, pistes 6-10). Lanes 10-14 (panneau supérieur) de la figure 2 sont des échantillons d'entrée utilisés pour la normalisation. Le panneau supérieur montre l'amplification par PCR par les amorces à proximité du site ICL TFO-dirigé et le panneau inférieur montre l'amplification par PCR lorsque les amorces distales à la TFO dirigéele site ICL ont été utilisés.

HMGB1 est une protéine d'architecture, qui se lie à l'ADN déformé avec une affinité supérieure à ce qu'elle se lie à l'ADN endommagé. Les tests ADN de surenroulement résolues par électrophorèse sur gel d' agarose à deux dimensions montrent une modification architecturale des plasmides TFO dirigés ICL contenant (P-ICL) par rapport à contrôler les plasmides (P) par HMGB1 dans des extraits de cellules HeLa (Figure 3). La modification architecturale induite par HMGB1 de préférence sur P-ICL contenant des substrats est détectée comme augmentation de surenroulement négatif. plasmides superenroulé migrent plus rapidement grâce à des gels d'agarose par rapport aux plasmides détendues ou linéaires. La distribution des topo - isomères indique plus surenroulement du P-ICL par rapport à P , en présence d'HMBG1 (figure 3). ADN surenroulé négativement fonctionne comme arc gaucher dans la deuxième dimension, en présence de chloroquine. La surenroulement induite par HMGB1 sur P-ICLsemble consister principalement des topo-isomères qui forment un arc de la main gauche (~ 14 topo-isomères ont été identifiés sur la LSC TFO dirigée contenant des plasmides par rapport à ~ 7 topo-isomères à partir du plasmide témoin), ce qui indique la formation de superhélices négatives. Au total, ces données suggèrent que les plasmides avec ICL TFO dirigés peuvent être utilisés comme un outil pour étudier l'association à haute affinité de la HMGB1 protéine architecturale avec des lésions de l'ADN dans les cellules humaines par le biais de tests d'immunoprécipitation chromatine. En outre, des modifications architecturales particulières des substrats de la P-ICL par HMGB1 peuvent également être étudiés en utilisant des essais de surenroulement et des gels d'agarose à deux dimensions.

Figure 1
Figure 1: méthode de dosage par électrophorèse sur gel d' agarose alcalin pour quantifier la formation TFO dirigée sur le rendement ICL pSupFG1 plasmide (A) Voie 1, 1 kb ladder ADN;. piste 2, plasmid pSupFG1 (P) utilisé comme témoin; et la piste 3, TFO-dirigé ICL contenant pSupFG1 (P-ICL). Les plasmides hébergeant ICL migrent plus lentement dans le gel comme démontré dans le couloir 3 (indiqué par la flèche noire sur le côté droit du gel). (B) la quantification densitométrique des bandes dans la piste 2 et la piste 3 indiquent qu'environ 70% des plasmides sont réticulés. Ce chiffre a été modifié par la référence 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: analyse ChIP démontrant l' enrichissement de la HMGB1 sur la région LSC contenant TFO dirigée du plasmide réticulé (A). L'amplification par PCR des fragments ont été immunoprécipitées resolved sur un gel d' agarose 1% en utilisant un ensemble d'amorces proximale à proximité du site TFO-dirigé ICL (B; P1 et P2, panneau supérieur) et un second ensemble d'amorces utilisées en tant que témoin de spécificité qui étaient encore (environ 2000 pb) à partir de l'dirigée ICL (B; P3 et P4, panneau inférieur). Les pistes 2 et 3 montrent un enrichissement de HMGB1 près de la LSC TFO dirigée (piste 3) par rapport à l'ADN non endommagé (piste 2). Pistes 4 et 5 sont des contrôles de spécificité d'anticorps en utilisant un anticorps IgG. Voies 6 et 7 sont des échantillons d'entrée. Piste 8 est un témoin négatif pour la réaction de PCR et ne contient pas de matrice d'ADN. P, le plasmide pSupFG1. P-ICL, TFO-dirigé ICL contenant le plasmide pSupFG1. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 16. (B) Un schéma de principe du pSupFG1 plasmidique montrant les sites d'amorce pour P1 et P2 ainsi que P3 et P4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: 2D électrophorèse sur gel d' agarose montrant la formation de superhélices négatives dans des plasmides d' ICL contenant TFO dirigés, facilitée par HMGB1 Le gel d' agarose TBE 1x révèle la distribution thermique des topo - isomères générés par le plasmide seul (P) ou le psoralène réticulé. plasmide (P-ICL). La mobilité des espèces surenroulées est plus rapide par rapport aux plasmides détendus. Chaque bande représente un topoisomer qui diffère de la bande au-dessous ou au-dessus d'un tour plus ou moins superhélice, respectivement. L'arc de la main gauche représente surenroulé négativement (-ve) espèces et l'arc à droite représente positivement superenroulé (+ ve) espèces. Le psoralène ICL contenant population plasmidique (P-ICL) contient plus d'espèces que les plasmides de contrôle (P) superenroulé. R, plasmides détendus; S, les plasmides surenroulés; 1D,première dimension de l'électrophorèse sur gel; 2D, seconde dimension de l'électrophorèse sur gel. Ce chiffre a été modifié depuis 16 ans. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La formation efficace des ICL TFO dirigés dépend de deux facteurs essentiels: premièrement, des composants tampons appropriée (par exemple, MgCl 2) et le temps d'incubation de la TFO avec son substrat d'ADN cible ( en fonction de l'affinité de liaison de l'TFO à sa cible recto-verso, et que les concentrations utilisées); et deuxièmement, la dose appropriée des UVA (365 nm), l'irradiation pour former des reticulations de psoralène de manière efficace. la formation d'un triplex optimale peut être obtenue en utilisant une CLHP ou de gel OFT purifiées. Impuretés contaminantes l'TFO peuvent conduire à des produits réticulés indésirables, qui peuvent compliquer davantage les résultats expérimentaux. Pour augmenter la stabilité de l'OFT fixé de manière covalente à une extrémité 5 'HMT psoralène, les OFT doivent être stockés dans des aliquotes à -80 ° C, en tant que multiple congélation-décongélation de l'OFT peut entraîner une dégradation des oligonucléotides. Après la formation du triplex pour cibler le psoralène à un site spécifique (par exemple, 5'-TA-3 'et 5'-AT-3' sont prépsoralène préféré sites de réticulation), la formation ICL psoralène nécessite une irradiation UVA. Une dose de 1,8 J / cm2 UVA est suffisant pour la formation optimale de ICL sur des plasmides in vitro. Le temps d'exposition doit être déterminée à l'aide d'un photomètre. En fonction de la source de la lampe ultraviolette, en plus d'émettre des UV à 365 nm, la lampe peut également émettre des longueurs d'ondes plus courtes, ce qui peut conduire à la formation de lésions de l'ADN non volontaire tout au long de l'épine dorsale de l'ADN. Parce que les plasmides ICL contenant TFO dirigées seront utilisées pour les études liées à la réparation de l'ADN d'un ICL à un site spécifique, ces photoproduits involontaires peuvent confondre les résultats des études de réparation d'ADN. Par conséquent, un filtre en Mylar doit être utilisé pour empêcher l'exposition des échantillons à des longueurs d'onde plus courtes. la formation d'ICL réussie dépend également de la stabilité de la structure triplex lors de l'irradiation UVA. Le temps d'irradiation UV nécessaire dépend de la puissance de la source de rayons UVA. Dans notre cas, 20-30 min est nécessaire pour générer ee désirée dose d'UVA. Pendant ce temps, la chaleur produite par la lampe peut provoquer une perte d'eau par évaporation à partir des échantillons. Une telle perte d'eau peut modifier la concentration du tampon et peut provoquer une déstabilisation des structures triplex. Mise en place des réactions sur la glace lors de l'irradiation UVA contribuera à empêcher l'évaporation des échantillons.

Afin de déterminer l'efficacité de la formation de liaisons transversales psoralène sur les substrats de plasmide, les échantillons ont été résolus dans 1% des gels d'agarose alcalin (figure 1). La plupart des protocoles d'électrophorèse sur gel alcalin suggèrent un gel alcalin 2x colorant de charge, bien que certains protocoles suggèrent que le colorant alcalin de chargement est pas nécessaire, car l'état de la mémoire tampon dénaturant du gel est suffisante pour dénaturer les échantillons. Alors qu'un colorant 2x fonctionne bien avec des échantillons d'ADN concentrés, ce protocole nécessite le chargement d'un grand volume d'échantillon. Par conséquent, utiliser un colorant alcalin de chargement de gel 6x. Pour assurer une bonne dénaturation du psoralène réticulé plasmid substrats, incuber les échantillons dans le tampon de charge pendant 10 min à température ambiante. En outre, Mg 2+ peuvent former Mg (OH) 2 dans des conditions alcalines, ce qui emprisonne l'ADN et peut l' amener à précipiter. Le tampon de réaction formant des triplex contient Mg 2+, et par conséquent il est important de faire incuber les échantillons avec de l' EDTA pour faire en sorte que le Mg 2+ est chélaté avant d'ajouter le colorant alcalin de chargement des échantillons. Après l'électrophorèse, il est important de neutraliser le gel, comme EtBr ne s'intercale pas avec l'ADN dans des conditions alcalines.

Une autre approche pour évaluer l'efficacité de la formation de liaisons transversales dirigées TFO est l'utilisation d'électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide, mais cette technique est plus laborieuse et nécessite une digestion de restriction des plasmides suivie par un isotope radioactif marquage des fragments. Cette approche actuelle démontre une méthode relativement simple, mais efficace pour déterminer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée sur des substrats de plasmide. Cependant, cette technique peut être utilisée pour évaluer la formation d'ICL par d'autres agents de réticulation formant ainsi.

succès de l'essai plasmide ChIP dépend d'un certain nombre de facteurs. Les étapes critiques dans le protocole et les suggestions de dépannage sont discutés ici. Les étapes critiques impliqués dans cet essai, comprennent le formaldehyde réticulation, micrococcique digestion nucléase, sonication, lavages de l'échantillon, et l'inversion des formaldéhyde réticulations protéine-ADN dans les échantillons. Efficace pour la reticulation protéine-ADN, il est important d'utiliser du formaldéhyde fraîche. bouteilles mères de 37% de formaldéhyde ne doivent pas être utilisés pendant plus de six mois après l'ouverture, l'exposition à la lumière et l'oxygène dégrade le formaldéhyde. Par conséquent, il est également avantageux d'effectuer la réticulation de formaldéhyde sans lumière dans la hotte de culture cellulaire. Une autre étape importante est la nucléase micrococcique (MNase) digestion des échantillons. MNase digestion non seulement clive l'ADN génomique en fragments plus petits, mais supprime également tous les plasmides persistants qui ne sont pas livrés dans les cellules au cours du procédé de transfection, ce qui peut réduire considérablement l'arrière-plan. Le temps d'incubation de la MNase digestion doit être déterminée de manière empirique. digestion plus longue peut entraîner une perte d'échantillons, alors que les périodes d'incubation plus courtes peuvent conduire à l'élimination inefficace de l'ADN non désirée. D'excellents résultats peuvent être observés après 10 minutes d'incubation à température ambiante avec un mélange occasionnel des réactions en inversant les tubes. Pour l'immunoprécipitation efficace, l'ADN doit être fragmenté à des tailles entre 800-1200 pb. Une telle fragmentation de l'ADN peut être obtenue par une sonication en profondeur des échantillons. sonication efficace des échantillons peut être obtenue en remettant en suspension les pastilles dans des tubes de PCR à paroi mince et en les plaçant dans un sonicateur à bain-marie par la suite. impulsions Sonic sont plus efficaces par rapport à sonication continue. Dans Addition, il est important de placer les échantillons sur de la glace entre les impulsions pour prévenir la dégradation des protéines, et il est également important de compléter le tampon 1 x ChIP avec les inhibiteurs de protéase, sous forme de protéines stables sont nécessaires pour la reconnaissance par l'anticorps et les étapes de précipitation ultérieure. Cependant, au cours du processus d'immunoprécipitation, en raison de la nature hydrophobe des billes magnétiques, un ADN non spécifique sera tirée vers le bas. Pour réduire les signaux à partir de ces modèles non spécifiques, le lavage rigoureux est absolument nécessaire. Enfin, une bonne inversion des reticulations protéine-ADN des échantillons est nécessaire pour l'amplification par PCR des modèles immunoprécipitées. Pour obtenir des résultats optimaux, les échantillons doivent être mis en incubation pendant au moins 12 heures avec du SDS et de la proteinase K. Il existe des avantages de l'utilisation d'un dosage ChIP à base plasmidique par rapport aux dosages ChIP génomiques. Par exemple, les dommages à l'ADN cible peut être facilement réalisée en utilisant un substrat d'ADN plasmidique et un TFO, par rapport à la formation de lésions TFO ciblée dans un locus génomique. Le Amontage du substrat peut également être contrôlée pour moduler l'intensité des signaux lors de l'utilisation d'un plasmide endommagé TFO ciblé. En outre, de tels substrats peuvent être utilisés dans toute lignée cellulaire de choix et testés pour l'association avec diverses protéines candidates, ce qui étend le champ d'application des études sur le traitement et la réparation des ICL.

Le dosage de surenroulement est basée sur la différence de forme entre le linéaire et l'ADN de plasmide superenroulé. les plasmides d'ADN superenroulé sont plus compacts et migrent plus rapidement à travers la matrice de gel par rapport à des plasmides détendues. Les étapes critiques dans le protocole et les suggestions de dépannage sont discutés ici. Parce que les protéines architecturales facilitent les modifications topologiques sur des substrats d'ADN endommagés, mesurée par l'induction de surenroulement des plasmides détendus, il est essentiel de se détendre complètement les plasmides avec la topoisomérase I. Il est nécessaire d'examiner l'étendue de la relaxation de l'ADN causées par topoisomérase I via un gel d'agarose électrophorèse.MgCl2 présent dans le tampon de surenroulement peut précipiter au fil du temps et de la présence de MgCl 2 affecte la distribution thermique des superhélices positives et négatives en facilitant la formation de superhélices positifs. Par conséquent, il est avantageux d'ajouter du MgCl2 séparément au mélange ou à préparer un tampon frais à chaque fois. Pour séparer les topo-isomères des populations de plasmide, il est important d'effectuer l'électrophorèse sur gel à une tension très faible (~ 2 V / cm) de telle sorte que la migration de l'ADN est principalement basée sur la structure / forme des molécules. Si la détente des plasmides par topoisomérase I est pas complète, le temps d'incubation et / ou la quantité d'enzyme utilisée doit être augmentée. relaxation complète doit être assurée avant de passer à l'étape ADN surenroulement ultérieure parce que l'utilisation du test de surenroulement avec des plasmides incomplètement détendues peut conduire à une mauvaise interprétation des données et les résultats peuvent être difficiles à reproduire. Une fois complrelaxation ete a été atteint, le dosage de surenroulement est relativement facile à réaliser. Une composante importante de ce dosage est l'utilisation d'un tampon de synthèse de réparation d'ADN. La phosphocréatine et la créatine phosphokinase doivent être ajoutés au mélange à chaque fois pour générer l'ATP. Suite à l'étape de surenroulement, il est important d'éliminer les protéines de l'ADN de plasmide par incubation avec du SDS et de la proteinase K. SDS contribue à la dissociation des protéines à partir de l'ADN et de la proteinase K dégrade la protéine, ce qui laisse l'ADN intact avec différents niveaux de surenroulement . Si la protéine n'a pas été complètement éliminé, la distribution thermique des topo-isomères ne sera pas clairement visible. L'ADN ne peut pas être purifié par phénol: chloroforme: alcool isoamylique et précipité dans l'éthanol parce que cette méthode (et d'autres) peuvent nick l'ADN, ce qui entraîne la perte de surenroulement. Une autre étape importante est l'addition de chloroquine dans la mémoire tampon. La chloroquine est un agent intercalant de l'ADN et dévide. Surintercalation, il détend l'ADN surenroulé négativement et introduit surenroulement positif à l'ADN détendue qui facilite la séparation des topo-isomères contenant une forte densité de surenroulement. Ainsi superhélices positives et négatives peuvent être différenciées. Ceci est généralement une expérience facile et est hautement reproductible lorsque tous les points ci-dessus sont considérés.

Toutefois, si aucune surenroulement est évidente, il est alors nécessaire de déterminer l'activité de la protéine d'intérêt. Le dosage de surenroulement 2D a été utilisé pour étudier les modifications topologiques facilitées par des protéines architecturales 27. Cet essai a été utilisé ici dans le contexte des dommages à l'ADN de traitement ICL TFO dirigées dans des cellules humaines. HMGB1 se lie à ICL TFO dirigées avec une grande affinité et spécificité, comme précédemment démontré par l' intermédiaire d'un gel d' électrophorèse in vitro , des dosages de décalage de mobilité et 20 dans des cellules humaines en utilisant le dosage plasmide ChIP décrit 16 à l'intérieur. Ici, uchanter la surenroulement test 2D , il a été démontré que lors de la liaison aux ICL TFO dirigées dans HeLa extraits exempts de cellules, HMGB1 aide à la formation de surenroulement négatif sur les substrats (figure 3), qui peut être une étape importante dans la réparation des la lésion parce surenroulement négatif est connu pour faciliter l'élimination des lésions de l' ADN par la voie NER 25. Il y a beaucoup de protéines architecturales qui ont été impliqués dans l'ADN des dommages traitement qui pourraient être étudiés en utilisant ce test. Cette approche est limitée à des études in vitro, cependant, il est un test simple et utile d'interroger la relation structure-fonction des protéines architecturales dans le contexte de l' ADN de réparation des dommages. Cependant, le protocole de puce peut être facilement modifié pour étudier les interactions protéine-ADN dans le contexte du génome, tout en évaluant les effets sur le surenroulement de l'ADN par de telles interactions peuvent se révéler très difficile. Nous et d'autres groupes ont en effet pDes études sur la base erformed triplex 1) , par transfection stable de l'ADN du plasmide dans le génome de 28 à 30 février) par ciblage d' un locus génomique 31-33 et 3) en incorporant le psoralène modifié TFO (et l' irradiation UVA) dans les cellules après transfection plasmidique 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Vasquez pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé / Institut national du cancer [CA097175, CA093279 à KMV]; et la prévention du cancer et de l'Institut de recherche du Texas [RP101501]. Le financement des frais d'accès ouvert: National Institutes of Health / National Cancer Institute [de CA093279 à KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

Genetics numéro 117 oligonucléotides triplex formation réparation de l'ADN l'ADN InterStrand réticulations dosage ChIP plasmidique 2D essai de surenroulement HMGB1
Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter