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Genetics

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

casella di gruppo ad alta mobilità 1 proteine ​​(HMGB1) è una proteina di architettura non-istone che è coinvolto nella regolazione di molte funzioni importanti nel genoma, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA. HMGB1 si lega al DNA strutturalmente distorto con maggiore affinità rispetto alla canonica B-DNA. Ad esempio, abbiamo scoperto che HMGB1 si lega al DNA interstrand legami crociati (ICL), che collegano covalentemente i due filamenti del DNA, causa la distorsione dell'elica, e se non riparati può causare la morte delle cellule. A causa della loro potenziale citotossico, diversi agenti ICL-inducono sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici in clinica. Mentre gli agenti ICL-formatura mostrano preferenze per alcune sequenze di base (ad esempio, 5'-TA-3 'è il sito di reticolazione preferito per psoraleni), che in gran parte inducono danni al DNA in modo indiscriminato. Tuttavia, covalentemente accoppiando l'agente ICL induce ad un oligonucleotide triplex-formatura (TFO), che si lega al DNA in una sequenza specificamodo, il danno al DNA mirato può essere raggiunto. Qui, usiamo un TFO covalente coniugata sulla 'fine a una 4'-idrossimetil-4,5' la 5 (HMT) psoralen, 8-trimethylpsoralen per generare un ICL site-specific su un plasmide mutazione giornalista da utilizzare come strumento di per studiare la modifica architettonica, trasformazione e riparazione delle lesioni del DNA complessi HMGB1 in cellule umane. Descriviamo tecniche sperimentali per preparare ICL TFO-dirette sui plasmidi reporter, e di interrogare l'associazione di HMGB1 con le ICL TFO-orientate in un contesto cellulare utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, descriviamo saggi superavvolgimento DNA per valutare specifica modifica architettonica del DNA danneggiato misurando la quantità di giri superelica introdotte sul plasmide psoralen-reticolato da HMGB1. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare i ruoli di altre proteine ​​coinvolte nella trasformazione e riparazione di ICL TFO-dirette o altri danni al DNA mirato in qualsiasi linea cellulare di interesse.

Introduction

Triplex di formazione oligonucleotidi (TFOS) DNA legano duplex in modo specifico per la sequenza tramite incollaggio Hoogsteen-idrogeno per formare strutture a tripla elica 1-5. La tecnologia Triplex è stata usata per interrogare una varietà di meccanismi biomolecolari, come la trascrizione, il DNA riparazione dei danni, e gene targeting (rivisto in riferimenti 6-8). TFOS sono stati ampiamente utilizzati per indurre un danno site-specific su plasmidi reporter 9,10. Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato in precedenza un TFO, AG30, legato ad una molecola psoraleni per indurre site-specific legami crociati interstrand DNA (ICL) nel gene supF sul plasmide pSupFG1 5,10-12. ICL sono altamente citotossico come queste lesioni reticolazione covalente i due filamenti di DNA, e se non riparati, possono bloccare la trascrizione del gene e impedire il meccanismo di replicazione del DNA 13,14. A causa della loro potenziale citotossico, agenti ICL-induttori sono stati utilizzati come farmaci chemioterapici nel trattamentodi cancro e altre malattie 15. Tuttavia, la trasformazione e la riparazione di ICL in cellule umane non è ben compreso. Così, una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nella trasformazione di ICLs in cellule umane può contribuire a migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici ICL-base. ICL TFO-indotte e dei loro intermedi di riparazione hanno il potenziale di causare notevoli distorsioni strutturali per l'elica del DNA. Tali distorsioni sono obiettivi probabili per le proteine di architettura, che si legano al DNA distorto con maggiore affinità rispetto a B-forma canonica duplex DNA 16-20. Qui, abbiamo studiato l'associazione di una proteina architettonica altamente abbondanti, HMGB1 con ICL in cellule umane tramite immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) saggi su plasmidi psoraleni reticolato e identificato un ruolo per HMGB1 nel modulare la topologia del DNA plasmide psoralen-reticolato in umana lisati cellulari di cancro.

HMGB1 è altamente abbondante e ubiquitariamente espresso non suatono proteina architettonica che si lega al DNA danneggiato e substrati di DNA in alternativa strutturati con affinità maggiore di B-forma canonica DNA 17-20. HMGB1 è coinvolta in numerosi processi metabolici del DNA, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA 16,21-23. Abbiamo precedentemente dimostrato che HMGB1 si lega al ICL TFO-diretti in vitro con alta affinità 20. Inoltre, abbiamo dimostrato che la mancanza di HMGB1 aumentato il trattamento mutageno di ICL TFO-diretti e HMGB1 identificato come una riparazione per escissione di nucleotidi (NER) co-fattore 23,24. Recentemente, abbiamo scoperto che HMGB1 è associata con ICL TFO-diretti nelle cellule umane e la sua assunzione di tali lesioni dipende dalla proteina NER, XPA 16. Superavvolgimento negativo del DNA ha dimostrato di promuovere la rimozione efficiente di lesioni del DNA da NER 25, e abbiamo scoperto che HMGB1 induce superavvolgimento negativo preferenzialmente su TFO-diretti plas ICL contenentisubstrati metà (relativi ai substrati non danneggiati plasmidi) 16, fornendo una migliore comprensione del ruolo potenziale (s) di HMGB1 come cofattore NER. Il trattamento dei ICLs non è pienamente compresa in cellule umane; in tal modo, le tecniche e le analisi sviluppate sulla base degli strumenti molecolari qui descritte potrebbe portare all'identificazione di proteine ​​supplementari coinvolte nella riparazione ICL, che a loro volta possono servire come bersagli farmacologici che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici cancro.

Qui, un approccio efficace per valutare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto nel DNA plasmidico da denaturazione agarosio elettroforesi su gel è stato discusso. Inoltre, utilizzando i plasmidi contenenti le ICL TFO-diretti, le tecniche per determinare l'associazione di HMGB1 con plasmidi ICL-danneggiati in un contesto cellulare utilizzando saggi ChIP modificati sono stati descritti. Inoltre, un metodo facile per studiare modifiche topologiche introdotte da the HMGB1 proteine ​​architettonico, in particolare su substrati plasmide ICL-danneggiati in lisati cellulari umane è stata determinata eseguendo saggi superavvolgimento tramite elettroforesi bidimensionale agarosio. Le tecniche descritte possono essere utilizzate per favorire la comprensione del coinvolgimento di riparazione del DNA e delle proteine ​​architetturali nel trattamento dei danni DNA mirate su plasmidi in cellule umane.

Descriviamo protocolli dettagliati per la formazione di TFO-diretti ICLs psoraleni sito-specifici sul DNA plasmidico, e successiva ChIP plasmid e superavvolgimento saggi per identificare le proteine ​​che associano con le lesioni e proteine ​​che alterano la topologia DNA, rispettivamente. Questi test possono essere modificati per eseguire con altri agenti che danneggiano il DNA, TFOS, substrati plasmidi, e linee cellulari di mammiferi di interesse. Infatti, abbiamo dimostrato che non vi è almeno un potenziale unico e ad alta affinità sito TFO vincolante all'interno di ogni gene annotata nel genoma umano 26. Comemai, per chiarezza, abbiamo descritto queste tecniche per l'uso di un TFO specifica psoralen-coniugato (pAG30) su uno specifico plasmide mutazione giornalista (pSupFG1) in cellule umane U2OS abbiamo utilizzato in Mukherjee & Vasquez 2016 16.

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Protocol

1. Preparazione di ICL TFO-dirette sui plasmidi Substrati

  1. Incubare quantità equimolari di plasmide pSupFG1 10,11 DNA (DNA plasmide 5 mg è un buon punto di partenza) con psoraleni coniugato TFO AG30 in 8 ml di triplex tampone di legame [50% glicerolo, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] e dH 2 O ad un volume finale di 40 microlitri in un tubo ambra. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la reazione a 37 ° C bagnomaria per 12 ore.
  2. Riscaldare la lampada UVA per garantire la piena potenza. Posizionare la reazione triplex su pellicola di paraffina, e posizionare il film di paraffina sul ghiaccio sotto la (nm 365) lampada UVA. Collocare un filtro Mylar tra la lampada e la reazione.
  3. UVA irradiare per una dose totale di 1,8 J / cm 2. Conservare i campioni a 4 ° C per un ulteriore uso.
    Attenzione: Indossare occhiali protettivi corretta e abbigliamento con UVA irradiazione.
  4. Linearizzare 200 ng del plasmide sopra preparato con il restriction enzima Eco R1 in un volume totale di 20 microlitri con il produttore fornito 10x tampone. Calore denaturare l'enzima per 20 minuti a 65 ° C. Spin i campioni per 10 minuti a 10.000 xg e conservare a 4 ° C.
  5. Preparare 50x tampone alcalino [1,5 M di NaOH, 50 mM etilendiamminotetraacetico acido (EDTA)]. Aggiungere 0,5 mg di agarosio a 50 ml dH 2 O. Far bollire per sciogliere l'agarosio e metterlo in un bagno d'acqua a 50 ° C.
  6. Dopo che la temperatura del agarosio disciolto è fino a 50 ° C, aggiungere 1 ml di tampone 50x alcalina, mescolare e poi versare il gel nel vassoio gel. Attendere che il gel di solidificare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  7. Aggiungere 4 ml di 0,5 M EDTA ai 20 ml di campione di DNA linearizzato e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
  8. Aggiungere 6x tampone di gel loading alcalina (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) ad alto peso molecolare polisaccaride, 0,06% verde di bromocresolo in dH 2 O) per campioni e ad una scaletta DNA 1 kb.
    NOTA: E 'importante utilizzare 6x tampone di caricamento del gel alcalino, si prega di consultare la discussione.
  9. Caricare i campioni sul gel nella stanza fredda e correre durante la notte in un tampone alcalina 1x (12-16 ore) a 3,2 volt per cm. Una volta che i campioni sono entrati nel gel, posizionare una lastra di vetro sulla superficie del gel per evitare che galleggianti.
  10. Neutralizzare i campioni immergendo il gel in tampone di neutralizzazione [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M acetato di sodio (pH 5,2)] per 45 min a temperatura ambiente.
  11. Macchia il gel per il DNA con 4 ml di 1% etidio bromuro (EtBr) in 50 ml di acqua per 1 ora a temperatura ambiente. Decolorare con acqua per 15 minuti. Visualizzare il DNA utilizzando un sistema di imaging.
    Attenzione: EtBr è un agente mutageno potente e può essere assorbito attraverso la pelle. Evitare il contatto diretto con EtBr.

2. Trasfezione e immunoprecipitazione di TFO diretti da plasmidi ICL contenenti in cellule umane

  1. Piastra 400.000 cellule di mammifero (ad esempio, U2OS Ocellule steosarcoma) per piatto di 60 millimetri in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) senza antibiotici 24 ore prima della trasfezione. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C con 5% di CO 2.
  2. Prima di trasfezione, mezzi di crescita caldo e tampone fosfato isotonico (PBS) a 37 ° C in un bagno d'acqua. Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente.
  3. Incubare 30 ml di reagente di trasfezione con 500 ml di terreni di crescita 1x (Mix 1) e 2 mg di TFO-diretti ICL contenenti plasmidi in 500 ml di 1x terreni di crescita (mix 2) in separati 14 ml provette con fondo arrotondato per 10 min a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere mix 1 a mescolare 2, mescolare bene pipettando su e giù. Incubare per 25-30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lavare le cellule due volte con PBS caldo. Aggiungere la miscela trasfezione in modo goccia a goccia distribuendo uniformemente tutta la piastra di cellule. Aggiungere 1 ml di terreni di crescita alla piastra e portare il volume finale a 2 ml. mescolare noill. Posizionare le piastre di coltura nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 4 ore.
  6. Sostituire il supporto con i media da 3 ml crescita supplementato con 10% FBS e incubare ulteriormente per 16 ore. Non usare antibiotici.
  7. Trattare cellule con 80 ml di 37% di formaldeide fresco per piastra ad una concentrazione finale di circa 1% e incubare per 10 min a temperatura ambiente in assenza di luce.
    Attenzione: La formaldeide è tossica e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. esposizione alla formaldeide può causare danni alla pelle, degli occhi e delle vie respiratorie.
  8. Quench formaldeide reticolazione aggiungendo 300 ml di glicina refrigerati (fornito nel kit disponibili in commercio) per piastra e incubando per 5 min. Rimuovere il supporto e lavare due volte con PBS freddo, e poi raccogliere le cellule raschiando in 1 ml freddo (4 ° C) PBS in una provetta. Mantenere i campioni in ghiaccio in ogni momento.
  9. Preparare pellet cellulari mediante centrifugazione a 4 ° C per 5 min at 13.400 xg con un tavolo refrigerata centrifuga. Pipettare il supernatante e posizionare il pellet di cellule in ghiaccio.
  10. Omogeneamente risospendere il pellet in 1 ml freddo (4 ° C) tampone A (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 min. Mescolare di tanto in tanto invertendo il tubo. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9).
  11. Omogeneamente risospendere il sedimento in 1 ml di freddo (C 4 °) Buffer B (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 minuti con miscelazione occasionale invertendo. Cellule pellet per centrifugazione come prima (vedi sopra punto 2.9).
  12. Risospendere nuovamente le cellule in 200 microlitri refrigerati tampone B. Aggiungere 2 ml di micrococcica nucleasi (MNase) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Mescolare di tanto in tanto la reazione muovendo il tubo. Arrestare la reazione MNase ponendo la provetta in ghiaccio e aggiunta di 40 mM EDTA. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9).
  13. Risospendere le cellule in 100 microlitri 1x immunopr cromatinaecipitation tampone (chip) di buffer (in dotazione nel kit disponibili in commercio) integrato con cocktail inibitore della proteasi.
  14. Mettere le cellule risospese in una provetta per microcentrifuga a parete sottile. Sonicare i campioni da loro galleggia sull'acqua bagno sonicatore per 20 secondi seguita da 20 sec incubazione in ghiaccio. Ripetere i passaggi da sonicazione 9 volte per generare ~ 800-1.200 frammenti bp.
    1. A 20 ml di campioni sonicati aggiungere 3 ml 5 M NaCl e 1 ml RNasi A. Mescolare bene nel vortex e incubare a 37 ° C per 30 min. Successivamente, aggiungere 2 ml proteinasi K e incubare per 2 ore a 65 ° C. Purificare i campioni utilizzando un kit di purificazione PCR. Esegui campioni su 1% gel e visualizzare con EtBr.
      NOTA: Intensità massima del DNA risultante dovrebbe essere pari o inferiore a 1.000 bp.
  15. In tre tubi separati, aggiungere 30 ml di lisato in un tubo siliconato pre-raffreddata e quindi aggiungere 70 ml di tampone ChIP refrigerata 1x con inibitori della proteasi aggiunto. Aggiungere 1 μg di anti-immunoglobulina G (IgG), H3 anti-istone (come controllo positivo), o anti-HMGB1 alle rispettive provette. Incubare per una notte in una camera fredda con rotazione continua.
  16. perline risospendere proteina G in modo omogeneo nella cella frigorifera. Aggiungere 4 ml di proteine ​​G perline per provetta e incubare per un altro 2-4 ore in cella con rotazione.
  17. Utilizzando un sostegno magnetico, agglomerare le perline e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone ChIP mescolato con cocktail di inibitori delle proteasi al pellet e lavare per 5 min in cella con rotazione. Ripetere il lavaggio due volte.
  18. Eseguire un lavaggio supplementare con sale alta 1x chip di buffer (contenente 70 mM NaCl).
  19. Risospendere il pellet con tampone di eluizione 160 microlitri (fornita in kit disponibili in commercio) e incubare a 37 ° C con rotazione per 30 min.
  20. Agglomerare le perline e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 6 ml di 5 M NaCl e 2 ml di proteinasi K, e incubare una notte a 65° C.
  21. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione prodotto di PCR ed eluire il DNA utilizzando 50 ml dH 2 O.
  22. Eseguire la PCR 16 reazioni utilizzando set di primer alla regione (s) di interesse, e risolvere i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con EtBr.

3. superavvolgimento Assay e 2-dimensionale in Gel di Agarosio

  1. Preparare DNA tampone di sintesi di riparazione (45 mm Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mm KCl; 7,4 mm MgCl 2; 0,9 mm DTT; 0,4 mm EDTA; 2 mM ATP, 20 mM dNTP, 3,4% glicerolo e 18 mg albumina sierica bovina) . Conservare a -80 ° C. Scongelare su ghiaccio e prima dell'uso aggiungere 40 mM fosfocreatina e 2,5 microgrammi creatinfosfochinasi.
  2. Preparare 10x tampone superavvolgimento [500 mm Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl 2, 1 mM EDTA], e conservare a temperatura ambiente.
  3. Linearizzare 300 ng di DNA pSupFG1 plasmide supercoiled completamente con 1 ml Vaccinia topoisomerasi I (5-15 U / ml) con 1xtampone superavvolgimento in una reazione 10 ml. Incubare la miscela a 37 ° C per 1 ora.
  4. Scongelare HeLa cell-free estratto 24 sul ghiaccio. Per i plasmidi completamente rilassato, aggiungere 25 ml estratto cellulare HeLa e buffer di sintesi di riparazione del DNA. Mescolare bene. Aggiungere ulteriori 1 ml di vaccinico topoisomerasi I del mix, e incubare per 1 ora a 37 ° C.
  5. Terminate le reazioni aggiungendo sodio dodecil solfato (SDS) (1% concentrazione finale) e proteinasi K (0,25 mg / ml concentrazione finale). Incubare a 65 ° C per 2 ore.
  6. Cast un gel di agarosio 1% con 1x Tris Borato EDTA (TBE) buffer. Aggiungere DNA colorante carico e caricare le reazioni direttamente sul gel almeno 4 corsie a parte. Eseguire il gel per 8-10 ore a 2 V / cm a 1x TBE (dimensione 1) a temperatura ambiente per risolvere i topoisomero.
    NOTA: Preparare una soluzione madre 5x TBE in 1 L di dH 2 O con l'aggiunta di 54 g di Tris base. 27,5 g di acido borico e 20 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  7. Preparare 2 L di 1xTBE con 3 mg / ml clorochina fosfato. Immergere il gel in 200 ml di questa soluzione per 20 min. Coprire il vassoio gel con un foglio di alluminio.
  8. Per elettroforesi il gel nella seconda dimensione, ruotare il gel 90 ° in senso orario ed eseguirlo per 4-6 ore a 2 V / cm in clorochina contenente 1x TBE per risolvere i supercoils positivi e negativi.
  9. Macchia gel con EtBr per 1 ora su una sedia a dondolo. Decolorare il gel con dH 2 O per 15 minuti e successivamente visualizzare la distribuzione termica dei topoisomero usando un imager.

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Representative Results

Formazione del ICL TFO-diretta è critica per la metodica plasmidi basati, che vengono utilizzati per interrogare i ruoli delle proteine ​​architettoniche nella lavorazione ICL in cellule umane. Denaturazione agarosio elettroforesi su gel è un modo facile per determinare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto. I plasmidi che ospitano ICL TFO-diretti migrano con una mobilità più lenta attraverso la matrice gel (Figura 1A, corsia 3) se confrontato con i plasmidi di controllo non-reticolati (Figura 1A, corsia 2). Quantificazione densitometrica delle bande nelle corsie 2 e 3 (Figura 1A) rivela circa il 70% della popolazione plasmide migra attraverso il gel con mobilità rallentato (identificato da una freccia nera), indicando la formazione ICL TFO diretto su tali plasmidi.

I saggi di immunoprecipitazione della cromatina effettuati su estratti di U2OS umano cellule Transfected sia con il plasmide di controllo (P) o plasmidi contenenti ICLs TFO-diretti (P-ICL) mostra arricchimento HMGB1 in corrispondenza della zona P-ICL rispetto alla regione di controllo (P), quando immunoprecipitati con un anticorpo anti-HMGB1 (Figura 2 , pannello superiore, corsie 2 e 3). Questi risultati indicano che associa HMGB1 con le ICL nelle cellule umane. Quando HMGB1 stata esaurita dalle cellule mediante trattamento siRNA, l'arricchimento P-ICL-specifico è stato ridotto (figura 2, pannello superiore, corsie 4 e 5), come previsto. Quando gli stessi campioni sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-IgG come controllo anticorpo specificità, nessuna amplificazione PCR è stato rilevato, come previsto (figura 2, pannello superiore, corsie 6-10). Lanes 10-14 (pannello superiore) nella figura 2 sono stati campioni di input utilizzati per la normalizzazione. Il pannello superiore mostra amplificazione PCR con i primer nei pressi del sito ICL TFO-diretto e il pannello inferiore mostra l'amplificazione PCR quando primer distali al TFO direttosito ICL sono stati utilizzati.

HMGB1 è una proteina architettonico, che si lega al DNA distorto con maggiore affinità di quello che lega il DNA danneggiato. I saggi superavvolgimento DNA risolti tramite elettroforesi bidimensionale agarosio dimostrano modifica architettonico dei plasmidi ICL contenenti TFO-diretti (P-ICL) rispetto al controllo plasmidi (P) di HMGB1 in estratti cellulari HeLa (Figura 3). La modifica architettonica indotta da HMGB1 preferibilmente su substrati P-ICL-contenenti è rilevato come incremento superavvolgimento negativo. plasmidi supercoiled migrano più velocemente attraverso gel di agarosio relativi al plasmidi rilassato o lineari. La distribuzione dei topoisomero indica più superavvolgimento del P-ICLs rispetto al P in presenza di HMBG1 (figura 3). Negativamente supercoiled DNA viene eseguito come arco mancino nella seconda dimensione, in presenza di clorochina. Il superavvolgimento indotta da HMGB1 su P-ICLsembra consistere principalmente di topoisomero che formano un arco mancina (~ 14 topoisomero sono stati individuati in ICL TFO diretto contenenti plasmidi rispetto a ~ 7 topoisomero dal plasmide di controllo), che indica la formazione di supercoils negativi. Complessivamente, questi dati suggeriscono che i plasmidi con ICL TFO-diretto può essere utilizzato come strumento per studiare l'associazione ad alta affinità del HMGB1 proteina architettonica con lesioni del DNA nelle cellule umane attraverso immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, specifiche modificazioni architettoniche dei substrati P-ICL di HMGB1 possono anche essere studiate usando saggi superavvolgimento e gel di agarosio bidimensionali.

Figura 1
Figura 1: saggio di agarosio elettroforesi su gel alcalina di quantificare TFO-diretto efficienza formazione ICL sul pSupFG1 plasmide (A) Corsia 1, 1 kb scala del DNA;. corsia 2, plasmid pSupFG1 (P) utilizzata come controllo; e corsia 3, TFO-diretto ICL contenenti pSupFG1 (P-ICL). I plasmidi che ospitano ICLs migrano più lentamente nel gel come dimostrato in corsia 3 (indicato dalla freccia nera sul lato destro del gel). (B) densitometrica quantificazione delle bande in corsia 2 e 3 corsie indicano che circa il 70% dei plasmidi sono reticolati. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: ChIP assay dimostrazione arricchimento HMGB1 sulla regione TFO diretto ICL contenenti del plasmide reticolato (A). Amplificazione PCR dei frammenti immunoprecipitati erano resolved su un gel di agarosio 1% utilizzando un set di prossimali primer vicino al sito TFO diretto ICL (B, P1 e P2, pannello superiore) e una seconda serie di primer utilizzati come controllo di specificità che erano maggiori (circa 2000 bp) dal il sito-ICL (B, P3 e P4, pannello inferiore). Corsie 2 e 3 indicano arricchimento HMGB1 vicino alla ICL TFO diretto (corsia 3) rispetto al DNA danneggiato (corsia 2). Corsie 4 e 5 sono controlli specificità anticorpale, utilizzando un anticorpo IgG. Corsie 6 e 7 sono i campioni di ingresso. Corsia 8 è un controllo negativo per la reazione PCR e non contiene DNA stampo. P, plasmide pSupFG1. P-ICL, TFO-diretto ICL contenenti plasmide pSupFG1. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 16. (B) un diagramma schematico della pSupFG1 plasmide che mostra i siti di primer per P1 e P2, nonché P3 e P4. Cliccate qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.

Figura 3
Figura 3: 2D agarosio gel elettroforesi mostra formazione di supercoils negativi in TFO-diretti plasmidi ICL contenenti, facilitato dalla HMGB1 Il gel di agarosio 1x TBE rivela la distribuzione termica dei topoisomero generati da sola (P) il plasmide o psoralen-reticolato. plasmide (P-ICL). La mobilità delle specie supercoiled è più veloce rispetto ai plasmidi rilassato. Ogni banda rappresenta un topoisomero che differisce dalla banda inferiore o superiore di un giro meno o più superelicoidale rispettivamente. L'arco mancino rappresenta negativamente superavvolto specie (-ve) e l'arco di mano destra rappresenta positivamente superavvolto (+ ve) specie. La Lci contenenti popolazione psoraleni plasmide (P-ICL) contiene più specie rispetto ai plasmidi di controllo (P) superavvolto. R, plasmidi rilassato; S, plasmidi supercoiled; 1D,prima dimensione della elettroforesi su gel; 2D, seconda dimensione della elettroforesi su gel. Questa cifra è stata modificata da 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La formazione efficiente ICLs TFO-diretti dipende da due fattori fondamentali: in primo luogo, i componenti corretta tampone (per esempio, MgCl 2) e il tempo di incubazione del TFO con il suo substrato DNA bersaglio (dipende l'affinità di legame del TFO al suo obiettivo duplex, e le concentrazioni utilizzate); e in secondo luogo, la corretta dose di UVA (365 nm) irradiazione per formare legami crociati psoraleni efficiente. formazione triplex ottimale può essere ottenuto utilizzando HPLC o gel TFOS purificati. Le impurità che contaminano il TFO possono portare a prodotti reticolati indesiderati, che possono complicare ulteriormente il risultato sperimentale. Per aumentare la stabilità del TFOS covalentemente attaccata ad un psoraleni 5'-HMT, i TFOS devono essere conservati in aliquote a -80 ° C, come multipli congelamento scongelamento del TFOS può provocare degrado degli oligonucleotidi. Dopo la formazione triplex di indirizzare il psoraleni a un sito specifico (ad esempio, 5'-TA-3 'e 5'-AT-3' sono prepsoraleni FERRED siti di reticolazione), la formazione di ICL psoraleni richiede l'irradiazione con raggi UVA. Una dose di 1,8 J / cm 2 UVA è sufficiente per la formazione ottimale ICLs sui plasmidi in vitro. Il tempo di esposizione deve essere determinata utilizzando un fotometro. A seconda della fonte della lampada UVA, oltre a emettitori UV a 365 nm, la lampada può anche emettere lunghezze d'onda minori, che possono portare alla formazione di danno al DNA non volute tutta la spina dorsale DNA. Poiché i TFO diretti da plasmidi ICL-contenenti saranno utilizzati per studi relativi a riparazione del DNA di un ICL in un sito specifico, tali fotoprodotti indesiderate possono confondere i risultati degli studi di riparazione del DNA. Pertanto, un filtro Mylar deve essere utilizzato per impedire l'esposizione dei campioni per lunghezze d'onda più corte. formazione ICL successo dipende anche dalla stabilità della struttura triplex durante UVA irradiazione. Il tempo di irradiazione UV richiesto dipende dalla potenza della sorgente UVA. Nel nostro caso, 20-30 min è necessaria per generare the desiderata dose di raggi UVA. Durante questo tempo, il calore generato dalla lampada può causare la perdita di acqua per evaporazione dai campioni. Tale perdita di acqua può alterare la concentrazione del tampone e può causare la destabilizzazione delle strutture triplex. Posizionando le reazioni sul ghiaccio durante l'irradiazione UVA aiuterà a prevenire l'evaporazione dei campioni.

Per determinare l'efficienza di formazione di reticolazione psoralen sui substrati plasmide, i campioni sono stati risolti in 1% gel di agarosio alcaline (Figura 1). La maggior parte dei protocolli per gel elettroforesi alcalina suggeriscono un colorante di caricamento del gel 2x alcalina, anche se alcuni protocolli suggeriscono che dye loading alcalina non è necessario, come condizione di buffer denaturazione del gel è sufficiente per denaturare i campioni. Mentre un colorante 2x funziona bene con i campioni di DNA concentrati, questo protocollo richiede il caricamento di un volume di campione di grandi dimensioni. Pertanto, utilizzare un colorante caricamento del gel alcalino 6x. Per garantire il corretto denaturazione del psoraleni reticolato plsubstrati asmid, incubare i campioni nel tampone di caricamento per 10 min a temperatura ambiente. Inoltre, Mg 2+ può formare Mg (OH) 2 in condizioni alcaline, che intrappola il DNA e può causare a precipitare. Il tampone di reazione triplex formazione contiene Mg 2+, e pertanto è importante incubare i campioni con EDTA per garantire che il Mg 2+ è chelato prima di aggiungere il colorante alcalino carico ai campioni. Dopo l'elettroforesi, è importante per neutralizzare il gel, come EtBr non intercalate con il DNA in condizioni alcaline.

Un approccio alternativo per valutare l'efficacia della formazione reticolazione TFO-diretto è l'uso di gel di poliacrilammide denaturante, ma questa tecnica è più laborioso e richiede restrizione digestione dei plasmidi seguiti da marcatura radioattiva dei frammenti. Questo approccio corrente dimostra una relativamente semplice, ma efficace metodo per determine l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto su substrati plasmide. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata per valutare la formazione di ICLs da altri agenti di reticolazione che formano pure.

esito positivo del test plasmide ChIP dipende da una serie di fattori. Le fasi critiche all'interno del protocollo e la risoluzione dei problemi suggerimenti sono discussi qui. passaggi critici coinvolti in questo test, sono reticolazione formaldeide, micrococcica digestione nucleasi, sonicazione, lavaggi del campione, e l'inversione dei legami crociati formaldeide proteina-DNA nei campioni. Per efficiente reticolazione proteina-DNA, è importante utilizzare formaldeide fresco. Bottiglie Stock di formaldeide al 37% non devono essere utilizzati per più di sei mesi dopo l'apertura, l'esposizione alla luce e ossigeno degrada formaldeide. Pertanto, è anche utile per eseguire la reticolazione formaldeide senza luce nella cappa coltura cellulare. Un altro passo importante è nucleasi micrococcica (MNase) digestion dei campioni. MNase digestione non solo scinde il DNA genomico in frammenti più piccoli, ma elimina anche eventuali plasmidi persistente che non sono stati consegnati nelle cellule durante il metodo di trasfezione, che può ridurre drasticamente il fondo. Il tempo di incubazione di MNase digestione dovrebbe essere empiricamente determinata. Più digestione può provocare la perdita di campioni, mentre i periodi di incubazione più brevi possono portare alla rimozione inefficiente del DNA indesiderato. Ottimi risultati sono visibili già dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente con occasionale miscelazione delle reazioni invertendo i tubi. Per immunoprecipitazione efficiente, il DNA deve essere frammentato di dimensioni tra i 800-1.200 bp. Tale frammentazione del DNA può essere ottenuto mediante sonicazione approfondita dei campioni. sonicazione efficiente dei campioni può essere ottenuto mediante ri-sospensione il pellet in tubi a parete sottile per PCR e successivamente mettendoli in un sonicatore bagnomaria. impulsi sonici sono più efficaci rispetto a sonicazione continuo. in Additione, è importante posizionare i campioni sul ghiaccio tra impulsi per prevenire la degradazione delle proteine, e è anche importante integrare il buffer 1x chip con inibitori della proteasi, come sono necessarie per il riconoscimento anticorpale e successive fasi di precipitazione delle proteine ​​stabili. Tuttavia, durante il processo di immunoprecipitazione, a causa della natura idrofoba delle sfere magnetiche, DNA non specifico verrà abbattuta. Per ridurre i segnali provenienti da modelli simili non specifici, rigoroso lavaggio è assolutamente necessario. Infine, una corretta inversione dei legami crociati proteina-DNA dei campioni è necessaria per l'amplificazione PCR dei modelli immunoprecipitati. Per ottenere risultati ottimali, i campioni devono essere incubate per almeno 12 ore con SDS e proteinasi K. Ci sono vantaggi di utilizzare un saggio ChIP plasmide basati su saggi ChIP genomiche. Ad esempio, il danno al DNA bersaglio può essere realizzato facilmente utilizzando un DNA plasmidico substrato e un TFO, rispetto a formazione di lesioni TFO targeting in un locus genomico. L'amonte di substrato può essere controllata anche per modulare l'intensità dei segnali quando si utilizza un plasmide danneggiata TFO mirati. Inoltre, tali substrati possono essere utilizzati in qualsiasi linea cellulare di scelta e testati per associazione con varie proteine ​​candidate, estendendo così la portata di studi sulla trasformazione e riparazione di ICLs.

Il saggio superavvolgimento si basa sulla differenza di forma tra lineare e DNA plasmidico superavvolto. plasmidi supercoiled sono più compatti e migrano più velocemente attraverso la matrice di gel rispetto ai plasmidi rilassato. Le fasi critiche all'interno del protocollo e la risoluzione dei problemi suggerimenti sono discussi qui. Poiché le proteine ​​architettoniche facilitare modifiche topologiche su substrati DNA danneggiato, misurata attraverso l'induzione di superavvolgimento dei plasmidi rilassato, è fondamentale per rilassarsi completamente i plasmidi con topoisomerasi I. E 'necessario esaminare la misura di relax DNA causati da topoisomerasi I via gel elettroforesi.Il MgCl 2 nel buffer superavvolgimento può precipitare nel tempo, e la presenza di MgCl 2 influenza la distribuzione termica dei supercoils positivi e negativi facilitando la formazione di supercoils positivi. Pertanto, è vantaggioso aggiungere MgCl 2 separatamente alla miscela o preparare tampone fresco ogni volta. Per separare le topoisomero delle popolazioni plasmide, è importante effettuare l'elettroforesi su gel ad una tensione molto bassa (~ 2 V / cm) in modo che la migrazione del DNA si basa principalmente sulla struttura / forma delle molecole. Se rilassamento dei plasmidi di topoisomerasi non è completa, allora il tempo di incubazione e / o la quantità di enzima utilizzato dovrebbe essere aumentato. Completa il rilassamento deve essere garantita prima di passare alla fase successiva superavvolgimento DNA perché l'uso del test superavvolgimento con i plasmidi non completamente rilassato può portare a interpretazioni errate dei dati e dei risultati può essere difficile da replicare. Una volta complete relax è stato raggiunto, il test superavvolgimento è relativamente facile da eseguire. Una componente importante di questo test è l'uso di un tampone di sintesi di riparazione del DNA. La fosfocreatina e creatina fosfochinasi devono essere aggiunti alla miscela ogni volta per generare ATP. Successivamente alla fase di superavvolgimento, è importante rimuovere le proteine ​​dal DNA plasmidico incubando con SDS e proteinasi K. SDS aiuta a dissociare le proteine ​​dal DNA e proteinasi K degrada la proteina, che lascia il DNA intatto con vari livelli di superavvolgimento . Se la proteina non viene rimosso completamente, la distribuzione termica delle topoisomero non sarà chiaramente visibile. Il DNA non può essere purificato mediante fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e etanolo precipitati perché questo metodo (e altri) può intaccare la DNA, con conseguente perdita di superavvolgimento. Un altro passo importante è aggiunta di clorochina nel buffer. Clorochina è un agente intercalante e si snoda il DNA. Suintercalazione, rilassa il DNA supercoiled negativamente e introduce superavvolgimento positivo al DNA rilassato che facilita la separazione delle topoisomero contenenti un'alta densità di superavvolgimento. Così supercoils positivi e negativi possono essere differenziati. Questo è generalmente un esperimento facile ed è altamente riproducibile quando tutti i punti di cui sopra sono considerati.

Tuttavia, se non superavvolgimento è evidente, allora è necessario determinare l'attività della proteina di interesse. Il saggio superavvolgimento 2D è stato utilizzato per studiare le modifiche topologiche facilitati da proteine architettonici 27. Questo test è stato usato qui nel contesto del DNA trasformazione danni di ICLs TFO-diretti in cellule umane. HMGB1 si lega al ICL TFO-diretti con alta affinità e specificità, come precedentemente dimostrato tramite gel elettroforesi in vitro saggi di mobilità-shift 20 e nelle cellule umane usando il test plasmide ChIP descritto all'interno di 16. Qui, ucantare saggio superavvolgimento 2D è stato dimostrato che dopo il legame alle ICLs TFO-diretti in HeLa estratti privi di cellule, assiste HMGB1 nella formazione di superavvolgimento negative sui substrati (Figura 3), che può essere un passo importante nella riparazione di la lesione perché superavvolgimento negativo è noto per facilitare la rimozione del danno al DNA attraverso la via NER 25. Ci sono molte proteine ​​architettonici che sono stati implicati nel DNA di trasformazione danni che potrebbero essere studiate usando questo test. Questo approccio è limitata a studi in vitro, tuttavia, è un test semplice e utile per interrogare il rapporto struttura-funzione delle proteine architettonici nel contesto del DNA riparazione danni. Tuttavia, il protocollo chip può essere facilmente modificato per studiare le interazioni DNA-proteina nel contesto del genoma, mentre valutare gli effetti sul superavvolgimento DNA da tali interazioni possono rivelarsi molto difficile. Noi e gli altri gruppi hanno infatti pstudi erformed triplex basati 1) mediante trasfezione stabile del DNA plasmide nel genoma FEBBRAIO 28-30) avendo come obiettivo un locus genomico 31-33 e 3) incorporando il TFO psoralen-modificato (e UVA irradiazione) nelle cellule dopo plasmide trasfezione 10.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Vasquez per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 per KMV]; e la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas [RP101501]. Il finanziamento per la carica di accesso aperto: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 per KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

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References

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Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

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