Abstract
높은 이동성 그룹 상자 1 (HMGB1) 단백질은 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 등 게놈 많은 중요한 기능을 조절에 관여하는 히스톤 비 구조적 단백질이다. HMGB1은 정식 B-DNA보다 더 높은 친화력과 구조적으로 왜곡 된 DNA에 결합한다. 예를 들어, 우리는 HMGB1은 DNA가 나선의 왜곡을 야기 공유 결합 DNA의 두 가닥을 연결 가교 (ICLS)를 interstrand, 왼쪽 경우 복구되지 않은 세포 사망을 일으킬 수에 결합하는 것을 발견했다. 때문에 자신의 세포 독성 잠재력, 여러 ICL 유도 에이전트는 현재 병원에서 화학 요법 제로서 사용된다. ICL-형성 제는 특정 염기 서열 (예, '- TA-3 5'는 소 랄렌에 대한 선호 가교 사이트)에 대한 환경 설정을 표시하는 동안, 그들은 크게 무차별 방식으로 DNA 손상을 유도한다. 그러나, 공유 결합 서열 - 특이 적으로 DNA에 결합하는 삼중 - 형성 올리고 뉴클레오티드 (TFO)에 ICL 유도제를 연결함으로써방법은 타겟 DNA 손상이 달성 될 수있다. 여기서는 도구로 사용할 돌연변이 리포터 플라스미드의 부위 특이 ICL을 생성하는 공유 8 trimethylpsoralen (HMT) 랄렌 5 '은 4'- 히드 록시 메틸 4,5'말단에 컨쥬 게이션 TFO를 사용 인간의 세포에서 HMGB1에 의해 복잡한 DNA 병변의 건축 변경, 처리 및 수리를 공부합니다. 우리는 실험 기술 리포터 플라스미드에 TFO 지시 ICLS을 준비하고, 염색질 면역 침전 분석법을 사용하여 휴대 맥락에서 TFO 지시 ICLS와 HMGB1의 연결을 심문에 대해 설명합니다. 또, HMGB1 의해 소라렌 가교 플라스미드 도입 superhelical 회전의 양을 측정함으로써 손상된 DNA의 특정 구조적 변형을 평가하기 위해 수퍼 코일 DNA의 분석을 설명한다. 이러한 기술은 TFO 지시 ICLS 또는 관심있는 세포주 다른 타겟 DNA 손상의 복구 처리에 관여하는 다른 단백질의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
Introduction
삼중 나선 구조를 형성하는 1-5 훅 스틴 수소 결합을 통해 서열 - 특이 적 방식으로 올리고 뉴클레오티드 (TFOs) 바인드 듀플렉스 DNA를 플렉스가 형성. 플렉스 기술은 이러한 전사, DNA 손상을 복구하고 유전자 타겟팅 (참고 문헌 6-8에서 검토)와 같은 생체 분자 메커니즘의 다양한 심문 사용되고있다. TFOs는 리포터 플라스미드 9,10-에 부위 - 특이 적 손상을 유도하기 위해 널리 사용되어왔다. 우리의 실험실과 다른 사람은 이전에 플라스미드 pSupFG1 5,10-12에 supF 유전자에 사이트 별 DNA의 interstrand의 가교 (ICLS)을 유도하기 위해 소 랄렌 분자에 닿는 TFO, AG30을 사용하고 있습니다. ICLS 이러한 병변 공유 개의 DNA 가닥 가교로서 매우 독성이며, 수리되지두면 유전자 전사를 차단하고, DNA 복제 장치 (13, 14)을 방해 할 수있다. 때문에 독성 잠재력, ICL 유도 화제는 치료에 항암제로 사용되어왔다암 및 기타 질병 15. 그러나, 인간의 세포에서 ICLS의 처리 및 수리가 잘 이해되지 않습니다. 따라서, 인간 세포에서 ICLS의 처리에 관여하는 메카니즘에 대한 이해는 ICL 계 화학 요법의 효능을 개선하는 데 도움이된다. TFO 유도 ICLS 및 수리 중간체는 DNA의 나선 구조에 상당한 왜곡을 야기 할 가능성이있다. 이러한 왜곡은 정규 B 형 이중 DNA 16-20보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합 건축 단백질에 대한 가능성이 대상입니다. 여기, 우리는 염색질 면역 (칩) 소 랄렌 교 플라스미드에 대한 분석을 통해 인간의 세포에서 ICLS와 매우 풍부한 건축 단백질 협회, HMGB1을 공부하고 인간의 소 랄렌 가교 플라스미드 DNA의 토폴로지를 변조에 HMGB1의 역할을 확인 암 세포 용 해물.
HMGB1은 매우 풍부하고 재하 표현이 아닌 자신의정규 B 형 DNA 17-20보다 더 높은 친화력으로 손상된 DNA와 대안 구조화 된 DNA 기판에 결합 톤 건축 단백질. HMGB1 그러한 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 16,21-23 여러 DNA 대사 과정에 관여한다. 우리는 이전에 HMGB1 높은 친 화성 (20)와 체외에서 TFO 지시 ICLS에 결합하는 것을 증명하고있다. 또한, 우리는 HMGB1의 부족 뉴클레오티드 절단 수리 (NER) 보조 인자 (23, 24)로 TFO 지시 ICLS의 돌연변이 처리 및 확인 HMGB1 증가 있음을 증명하고있다. 최근에, 우리는 HMGB1는 인간의 세포에서 TFO 지시 ICLS과 관련된 이러한 병변의 채용은 NER 단백질, XPA (16)에 의존하는 것을 발견했다. DNA의 음의 수퍼 코일은 NER (25)에 의해 DNA 병변의 효율적인 제거를 촉진하기 위해 표시되었습니다, 우리는 HMGB1는 TFO 지시 ICL 함유 플라스틱으로에 우선적으로 부정적인 수퍼 코일을 유도하는 것을 발견했다NER 공동 인자로서 HMGB1의 잠재적 인 역할 (들)에 대한 이해를 제공한다 (비 손상된 플라스미드 기판에 대해) 중간 기판 (16). ICLS의 처리는 완전한 인간 세포에서 알려져 있지 않다; 따라서, 본 명세서에 기재된 분자 도구에 기초한 기술과 개발 분석 차례로 암 화학 요법의 효능을 향상시키기 위해 이용 될 수있는 바와 같이 약물 표적을 제공 할 수있다 ICL 수리에 관련된 추가적인 단백질의 동정을 초래할 수있다.
여기서, 효과적인 방법은 논의 된 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하여 플라스미드 DNA의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 평가. 또한, TFO 지시 ICLS를 포함하는 플라스미드를 사용하는 기술이 설명되었다 변성 칩 어 세이를 이용하여 셀룰러 환경에서 ICL 손상된 플라스미드 HMGB1 연관을 결정한다. 또한, 손쉬운 방법은 제 도입 위상 수정을 공부구체적으로는 인간 세포 용 해물에서 ICL 손상된 플라스미드 기판상의 전자 구조적 단백질 HMGB1은 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 수퍼 코일 분석을 수행함으로써 측정되었다. 설명 된 기술은 인간 세포에서 플라스미드의 타겟 DNA 손상 처리에 DNA 수리 및 구조적 단백질 관여의 이해를 촉진하기 위해 사용될 수있다.
우리는 플라스미드 DNA, 이후 플라스미드 칩 각각 DNA 토폴로지 변경 병변과 연관 단백질 및 단백질을 확인하는 분석을 수퍼 코일에 TFO 지시 부위 특이 랄렌 ICLS의 형성에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 이러한 분석은 다른 DNA 손상 제, TFOs 플라스미드 기판 및 관심 포유 동물 세포 라인을 수행하도록 변형 될 수있다. 사실, 우리는 적어도 하나의 전위와 친 화성이 높은 고유 TFO 결합 부위는 인간 게놈 26의 모든 주석 유전자 내에 있다는 것을 보여 주었다. 방법우리 케르 및 바스, 2016 (16)에 이용되는 것처럼 지금까지, 명확성을 위해, 우리는 인간 U2OS 세포에서 특정 돌연변이 리포터 플라스미드 (pSupFG1)의 특정 랄렌 공역 TFO (pAG30)의 사용을위한 이러한 기술을 설명했다.
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Protocol
플라스미드 기판에 TFO 지시 ICLS 1. 준비
- 10,11 DNA 삼중 결합 완충액 [50 % 글리세롤, 10 mM 트리스 (PH 7.6), 10 mM의를 MgCl2 8 μL에 랄렌 공역 TFO AG30와 (5 μg의 플라스미드 DNA 좋은 출발점) 플라스미드 pSupFG1 몰량 부화 2] 호박색 튜브에서 40 μL의 최종 부피 DH 2 O. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 12 시간 동안 37 ℃로 물을 욕조에서 반응을 품어.
- 최대 전력 출력을 보장하기 위해 UVA 램프 워밍업. 파라핀 영화의 삼박자 반응을 배치하고, UVA (365 ㎚) 램프 아래에 얼음에 파라핀 필름을 배치합니다. 램프와 반응 사이의 마일 라 (Mylar) 필터를 놓습니다.
- UVA가 18 J / ㎠의 총 투여 량에 대해 조사한다. 더 사용하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다.
주의 : UVA 조사와 적절한 보호 안경과 복을 착용 할 것. - 재와 상기 제조 된 플라스미드 200 ng의 선형화제조업체를 사용하여 20 μl의 총 부피에 striction 효소 에코 R1 10 배 버퍼를 제공. 열은 65 ° C에서 20 분 동안 효소를 변성. 10,000 XG에 10 분 동안 샘플을 스핀 4 ℃에서 저장한다.
- 50 배 알칼리 버퍼 [1.5 M의 NaOH, 50 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)]를 준비합니다. 50 ㎖ DH 2 O.에 아가로 오스의 0.5 mg을 추가 아가로 오스를 해산하고 50 ° C의 물을 욕조에 배치하는 끓인다.
- 용해 된 아가로 오스의 온도가 아래로 50 ° C에 후에는 50 배 알칼리 버퍼 1 ㎖를 추가하여 혼합 한 후 젤 트레이에 젤을 붓는다. 젤은 사용하기 전에 실온에서 응고 할 때까지 기다립니다.
- 선형화 된 DNA 시료를 20 ㎕의 0.5 M EDTA 4 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼 추가 (300 mM의 NaOH를 6 mM의 EDTA (승 / 18 % v)의 고 분자량 폴리 사카 라이드, 0.06 % 브로 모 크레졸 그린 DH 2 O)에 샘플 및 1 킬로바이트 DNA 사다리.
주 : 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼를 사용하는 것이 중요하다, 논의를 참조하시기 바랍니다. - 로드 추운 방에 젤 위에 샘플 cm 당 3.2 볼트에서 하룻밤 1X 알칼리 버퍼 (12-16 시간)에서 실행합니다. 샘플이 겔을 입력하면, 플로팅되는 것을 방지하기 위하여, 겔 위에 유리판을 배치했다.
- 중화 완충액 [1 M 트리스 CL (PH 7.6), 1.5 M의 NaCl, 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2)]을 실온에서 45 분 동안의 겔을 침지하여 시료를 중화.
- 실온에서 1 시간 동안 50 ml의 물에 1 %의 에티 디움 브로마이드 (EtBr로) 4 μL에 대한 DNA 젤 얼룩. 15 분 동안 물 Destain. 촬상 시스템을 이용하여 DNA를 시각화.
주의 : EtBr이 돌연변이는 강력하고 피부를 통해 흡수 될 수있다. EtBr이 직접 접촉을 피하십시오.
인간의 세포에서 TFO 지시 ICL 포함하는 플라스미드 2. 형질과 면역 침전
- 플레이트 400,000 포유류 세포 (예를 들면, O U2OS둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 60mm 접시 당 steosarcoma 세포)를 형질 감염 24 시간 전에 항생제없이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 5 % CO 2와 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어.
- 수욕에서 37 ° C로 형질 따뜻한 성장 배지 및 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 앞서. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게.
- 10 분에 500 1 배 성장 미디어 μL (혼합 1)과 (2) 별도의 14 mL에 1 배 성장 미디어 (혼합 2) 500 μL의 플라스미드를 ICL 함유 TFO 지시 둥근 바닥 튜브 μg의와 형질 전환 시약의 30 μl를 품다 실온.
- 2 믹스로 pipetting 아래로 잘 혼합 믹스 1을 추가합니다. 실온에서 25 ~ 30 분 동안 품어.
- 따뜻한 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포의 플레이트에 걸쳐 균등하게 분배 적가 방식으로 형질 전환 혼합물을 추가한다. 접시에 성장 배지 1 ㎖를 추가하고 2 ml의에 최종 볼륨을 가지고. 우리 믹스게요. 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 배양 플레이트를 놓습니다.
- 10 % FBS와 보충 3 ㎖ 성장 미디어와 미디어를 교체하고 16 시간 동안 더 배양한다. 항생제를 사용하지 마십시오.
- 대략 1 %의 최종 농도로 플레이트 당 신선한 37 % 포름 알데히드의 80 μL로 세포를 처리하고, 빛의 부재하에 실온에서 10 분 동안 배양한다.
주의 : 포름 알데히드는 독성 및 안전 지침에 따라 처리되어야한다. 포름 알데히드의 노출은 피부, 눈과 호흡 기관에 해를 입힐 수 있습니다. - 접시 당 (시판 키트에 공급) 냉장 글리신의 300 μl를 추가하고 5 분 동안 배양하여 포름 알데히드 가교을 끄다. 용지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척 한 후 microcentrifuge 관에 냉장 (4 ℃) PBS 1 ml의 근근이 살아가고에 의해 세포를 수집합니다. 항상 얼음에 샘플을 유지합니다.
- 5 분 a를 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 펠렛을 준비탁상 냉장 원심 분리기를 사용하여 13,400 XG에서 t. 피펫 밖으로 뜨는을하고 얼음에 세포 펠렛을 배치합니다.
- 균일 1 ml의 냉장 (4 ℃) 버퍼 A (시판 키트에 공급)에 펠렛을 재현 탁하고 10 분 동안 얼음에 품어. 튜브를 반전 가끔 섞는다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조).
- 균일하게 냉각 한 용액에 펠릿 (4 ° C) 버퍼 B를 (시판 키트에 제공) 재현 탁하고 반전 가끔 믹싱과 10 분 동안 얼음에 품어. 이전 원심 분리하여 펠렛 세포 (위의 단계 2.9 참조).
- 버퍼 B. 냉각 200 μL에 다시 세포를 재현 탁하면 Micrococcal의 클레아 제 (MNase)의 2 μl를 추가하고 10 분 동안 실온에서 품어. 튜브를 쓸어 넘겨 때때로 반응을 섞는다. 얼음에 튜브를 배치하고 40 mM의 EDTA를 첨가하여 MNase 반응을 멈춘다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조).
- 100 ㎕의 1 배 염색질 immunopr에 재현 탁 세포프로테아제 억제제 칵테일로 보충 ecipitation 버퍼 (칩) 버퍼 (시판 키트에 제공).
- 얇은 벽의 microfuge 튜브에 재현 탁 세포를 놓습니다. 얼음에 20 초 동안 배양 한 다음 20 초 동안 물 목욕 초음파기에 그들을 떠하여 샘플을 sonicate하세요. 반복 초음파는 ~ 800-1,200 bp의 단편을 생성하기 위해 9 번 단계를 반복합니다.
- 초음파 처리 된 샘플 20 μL에 텍싱에 의해 잘 3 ㎕의 5 M NaCl을 1 μL의 RNase A. 믹스를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 그 후, 2 μL 테 K를 추가하고 65 ° C에서 2 시간 동안 품어. PCR 정제 키트를 이용하여 시료를 정제. 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행하고 EtBr이 함께 시각화.
참고 : 결과 DNA의 최대 강도에서 1,000 bp의 아래에 있어야한다.
- 초음파 처리 된 샘플 20 μL에 텍싱에 의해 잘 3 ㎕의 5 M NaCl을 1 μL의 RNase A. 믹스를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 그 후, 2 μL 테 K를 추가하고 65 ° C에서 2 시간 동안 품어. PCR 정제 키트를 이용하여 시료를 정제. 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행하고 EtBr이 함께 시각화.
- 세 개의 튜브에 미리 냉장 실리콘 처리 된 튜브에 해물 30 μl를 추가 한 다음 추가 프로테아제 억제제와 냉장 1 배의 칩 버퍼의 70 μl를 추가합니다. 1 μ 추가각각의 튜브에 안티 - 면역 글로불린 G (IgG를) (양성 대조군으로), 안티 - 히스톤 H3, 또는 안티 HMGB1 항체의 g. 연속 회전 추운 방에서 밤새 품어.
- 균일하게 추운 방에 재현 탁 단백질 G 비즈. 튜브 당 단백질 G 비즈의 4 μl를 추가하고 회전 추운 방에 또 다른 2-4 시간 동안 배양한다.
- 자기 랙을 사용하여 구슬 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 펠렛에 프로테아제 억제제 칵테일 혼합 200 μl의 1X 칩 버퍼를 추가하고 회전 추운 방에서 5 분간 씻는다. 두 번 씻어 반복합니다.
- 높은 소금 1 배 칩 버퍼 (70 mM의 NaCl을 함유하는)와 하나의 추가 세척을 수행합니다.
- (시판 키트에 제공됨) 160 ㎕의 용출 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고, 30 분 동안 회전하여 37 ° C에서 배양한다.
- 구슬을 펠렛과 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 5 M NaCl을 6 μL와 단백질 분해 효소 K 2 μl를 추가, 65에서 하룻밤 배양기음.
- PCR의 산물 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 50 μL의 2 O. DH를 사용하여 DNA를 용출
- PCR에게 관심 영역 (들)에 프라이머 세트를 사용하여 16 반응을 수행하고 EtBr이 물들 1 % 아가 로스 겔에 제품을 해결.
3. 수퍼 코일 분석 및 2 차원 전기 영동 아가로 스겔
- DNA 수리 합성 버퍼를 준비한다 (45 mM의 헤 페스-KOH, pH가 7.8, 70 mM의 KCl을 7.4 밀리미터의 MgCl 2, 0.9 mM의 DTT, 0.4 mM의 EDTA, 2 mM의 ATP, 20 μM의 dNTPs, 3.4 % 글리세롤, 18 μg의 소 혈청 알부민) . -80 ° C에서 보관하십시오. 얼음과 이전에 녹여 40 밀리미터 크레아틴 인산 및 2.5 μg의 크레아틴 포스 포 키나제를 추가 사용할 수 있습니다.
- 실온에서 10 배 수퍼 코일 버퍼 [500 mM 트리스 (산도 8.0), 500 mM의 NaCl을, 25 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA], 및 저장을 준비합니다.
- 완전히 1X 1 μL 백시 토포 이소 머라 제 I (5-15 U / μL)을 사용하여 수퍼 코일 pSupFG1 플라스미드의 DNA 300 ng의 선형화10 μl의 반응에서 수퍼 코일 버퍼입니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션.
- 얼음 헬라 무 세포 추출물 (24)를 해동. 완전히 이완 된 플라스미드로 25 μL 헬라 무 세포 추출물 및 DNA 수선 합성 버퍼에 추가한다. 잘 섞다. 믹스에 백시 니아 토포 이소 머라 제 I의 추가 1 μl를 추가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (1 % 최종 농도) 및 프로 티나 제 K (0.25 ㎎ / ㎖ 최종 농도)을 첨가하여 반응을 종료한다. 2 시간 동안 65 ° C에서 품어.
- 1X 트리스 붕산염 EDTA (TBE) 완충액으로 1 % 아가 로스 겔을 전송. DNA 로딩 염료를 추가하고 최소 4 차선 떨어져 겔에 직접 반응을로드합니다. topoisomers를 해결하기 위해 실온에서 1 배 TBE 2 V / cm (차원 1)에 8 ~ 10 시간 동안 젤을 실행합니다.
주 : 트리스 염기 54g을 첨가함으로써 DH 2 O 1 L의 5 배 TBE 원액을 준비한다. 붕산 27.5 g과의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ㎖. - 1 배의이 L 준비3 μg의 / ㎖의 클로로퀸 포스페이트와 TBE. 20 분 동안이 용액 200 ㎖에 젤을 만끽 해보세요. 알루미늄 호일로 겔 트레이를 커버.
- 두 번째 차원의 젤을 electrophorese하려면 시계 방향 방식으로 겔 90 °를 설정하고 양극과 음극 supercoils를 해결하기 위해 1X TBE를 포함 클로로퀸 2 V / cm에서 4-6 시간 동안 실행합니다.
- 로커에 1 시간 동안 EtBr이와 젤을 얼룩. 15 분 동안 DH 2 O로 겔 Destain이어서 이미 저를 사용하여 topoisomers의 열분포를 시각화.
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Representative Results
TFO 지시 ICL의 형성은 인간 세포에서 ICL 처리에서의 구조적 단백질의 역할을 심문하는 데 사용되는 플라스미드 기반 분석을 위해 중요하다. 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하면 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 결정하기위한 용이 한 방법이다. TFO 지시 ICLS 은닉 플라스미드는 비 - 가교 결합 된 제어 플라스미드 (도 1a, 레인 2)에 비교하여, 아가 로스 겔 매트릭스 (도 1a, 레인 3)을 통해 느린 이동성으로 이동한다. 레인 2, 3 (그림 1A)에서 밴드의 농도계 정량은 플라스미드 인구의 약 70 %가 그 플라스미드에 TFO 지시 ICL 형성을 나타내는, (검은 색 화살표로 식별) 둔화 이동성을 가진 젤을 통해 마이그레이션 알 수있다.
인간의 U2OS 세포 그럴 추출물에 수행 된 염색질 면역 침전 분석제어 플라스미드 (P) 또는 TFO 지시 ICLS 함유 플라스미드 중 하나와 ansfected (P-ICL) 제어 (P) 영역, 항 HMGB1 항체로 면역 침전 (도 2와 비교하여 P-ICL 영역에서 HMGB1의 표시 엔리치 , 상단 패널) 2 차선과 3. 이러한 결과는 인간의 세포에서 ICLS와 그 HMGB1 동료를 나타냅니다. HMGB1는 siRNA의 처리를 통하여 세포가 고갈되었을 때, P-ICL 특정 농축가 감소 하였다 (도 2, 상단 패널, 레인 4 및 5)에서, 예상대로. 동일한 샘플을 항체 특이성 대조군으로서 항 IgG 항체를 사용하여 면역 침강 된 경우에는 PCR 증폭은 예상대로 (도 2, 상단 패널, 레인 6-10), 검출되지 않았다. 그림 2 레인 10-14 (상단 패널) 정상화에 사용되는 입력 샘플이었다. 상단 패널에 말단 프라이머 TFO-지시가있는 경우 TFO 지시 ICL 사이트와 하단 패널 근처의 프라이머로 PCR 증폭은 PCR 증폭을하기 전시회ICL 사이트를 사용 하였다.
HMGB1은 손상되지 않은 DNA를 결합보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합하는 건축 단백질이다. 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 해결하는 DNA 수퍼 코일 분석법은 헬라 세포 추출물에서 HMGB1 (도 3)에 의해 플라스미드 (P)을 제어하기 위해 비교 TFO 지시 ICL 함유 플라스미드 (P-ICL)의 구조적 변경을 보여준다. P-ICL 함유 기판 상에 바람직 HMGB1에 의해 유도 건축 수정은 음의 수퍼 코일의 증가로 감지된다. 수퍼 코일 플라스미드는 완화 또는 선형 플라스미드를 기준으로 아가 로스 젤을 통해 빠르게 이동한다. topoisomers의 분포 HMBG1의 존재 P (도 3)에 비하여 P-ICLS 이상의 수퍼 코일을 나타낸다. 클로로퀸의 존재의 두 번째 차원의 호를 왼손잡이로 부정적으로 수퍼 코일 DNA를 실행합니다. P-ICL HMGB1에 의해 유도되는 수퍼 코일대부분 부정적인 supercoils의 형성을 나타내는 왼손잡이 호 (~ 14 topoisomers가 제어 플라스미드에서 ~ 7 topoisomers에 비해 플라스미드를 포함하는 TFO 지시 ICL에 확인되었다)를 형성 topoisomers 구성 것으로 보인다. 모두, 이러한 데이터는 TFO 지시 ICLS와 플라스미드는 크로 마틴 면역 분석을 통해 인간의 세포에서 DNA 병변과 건축 단백질 HMGB1의 높은 친 화성 관계를 연구하는 도구로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다. 또한 HMGB1 의한 P-ICL 기판 특정 구조적 변형은 수퍼 코일 분석 및 이차원 아가 로스 겔을 이용하여 연구 할 수있다.
도 1 : 알칼리 아가 로스 겔 전기 영동 분석은 플라스미드 pSupFG1에 TFO 지시 ICL 형성 효율을 정량화하는 (A) 레인 1, 1 킬로바이트 DNA 사다리]. 레인 2, PLasmid pSupFG1 (P)을 대조군으로 사용; 레인 3, ICL 함유 pSupFG1 (P-ICL)를 TFO는-지시했다. (겔의 우측의 검정색 화살표로 나타낸) 레인 3에서 설명한 바와 같이 ICLS 은닉 플라스미드 겔에서 더 느리게 이동한다. 차선 2 차선 3의 밴드 (B) 농도계 정량은 플라스미드의 약 70 %가 가교 있음을 나타냅니다. 이 그림은 참조 (16)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 가교 플라스미드의 TFO 지시 ICL 함유 영역에 HMGB1의 칩 분석 시연 농축 (A). 면역 단편의 PCR 증폭을 연구했다(, P1과 P2, 상단 패널 B) 및 상기 (약 2000 BP) 있었던 특이성 대조군으로 사용 된 프라이머의 제 2 세트에서 TFO 지시 ICL 사이트 근처 근위 프라이머 세트를 사용하여 1 % 아가 로스 겔상에서 esolved 사이트 지시 ICL (B; P3와 P4, 하단 패널). 레인 2와 3은 (레인 3) 손상되지 않은 DNA (레인 2)에 상대를 TFO 지시 ICL 근처 HMGB1의 농축을 나타냅니다. 레인 4 및 5는 IgG 항체를 사용하여 항체 특이성을 제어한다. 레인 6 및 7은 입력 샘플이다. 레인 8은 PCR 반응 음성 대조군과 더 DNA 템플릿을 포함하지 않는다. P 플라스미드 pSupFG1. P-ICL, ICL 포함하는 플라스미드 pSupFG1을 TFO는 지시. 이 수치는 기준 (16)에서 수정되었습니다. (B) P1 및 P2뿐만 아니라, P3와 P4의 프라이머 사이트를 표시하는 플라스미드 pSupFG1의 개략도. 더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.
그림 3 : TFO 지시 ICL 함유 플라스미드에 부정적인 supercoils의 2D 아가로 오스 겔 전기 영동 표시 형성, HMGB1에 의해 촉진 1 배 TBE 아가 로스 젤 혼자 (P) 플라스미드에 의해 생성 된 topoisomers의 열 분포를 보여준다 또는 소 랄렌 가교. 플라스미드 (P-ICL). 수퍼 코일 종의 이동이 빠르게 완화 된 플라스미드와 비교된다. 각 밴드는 각각 하나 작거나 더 superhelical 차례 아래 또는 위의 밴드는 다른 topoisomer을 나타냅니다. 왼쪽 손으로 아크 음 (- 제가) 종 수퍼 코일 나타냅니다와 오른 손잡이 아크 긍정적 (+가했습니다) 종 수퍼 코일 나타냅니다. 랄렌 ICL 포함하는 플라스미드 인구 (P-ICL)를 더 제어 플라스미드 (P)보다 종 수퍼 코일 포함되어 있습니다. R, 편안한 플라스미드; S, 수퍼 코일 플라스미드; 1D,겔 전기 영동 제 사이즈; 2D 겔 전기 영동 번째 차원. 이 수치가 16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TFO 지시 ICLS의 효율적 형성이 중요한 요인에 따라 달라집니다 : 목표에 TFO의 결합 친화도에 따라 그 대상 DNA의 기판과의 TFO의 배양, 적절한 버퍼 구성 요소 (예를 들어,의 MgCl 2) 첫 번째 시간 (종속 이중 및 농도)를 사용; 둘째, UVA의 적절한 투여 량 (365 ㎚)을 조사 효율적 소라렌 가교 결합을 형성한다. 최적 삼중 형성 HPLC 또는 겔 정제 TFOs를 사용함으로써 달성 될 수있다. TFO 오염 불순물은 더 실험 결과를 복잡하게 원치 않는 가교 결합 된 제품으로 이어질 수 있습니다. TFOs 여러 동결 해동 올리고 뉴클레오티드 저하 될 수 있으므로 공유 5'- HMT의 랄렌에 부착 TFOs의 안정성을 증가시키기 위해, TFOs는 -80 ℃에서 분취 량으로 저장한다. 삼중 형성 후 특정 사이트에 랄렌을 대상 (예 : 5'-TA-3 '와 5'-AT-3'예비있다ferred 랄렌 사이트를 가교), 소 랄렌 ICL 형성은 UVA 조사가 필요합니다. 1.8 J / ㎠의 UVA 투여 량은 시험 관내에서 플라스미드 ICLS 최적 형성하기에 충분하다. 노출 시간은 광도계를 사용하여 결정되어야한다. UVA 램프 소스에 따라, 365 nm에서 UV 발광에 부가하여, 램프는 DNA 백본에 걸쳐 의도적 DNA 손상의 생성으로 이어질 수 짧은 파장을 방출 할 수있다. TFO 지시 ICL 함유 플라스미드는 특정 부위에서 ICL의 DNA 복구에 관련된 연구에 사용되므로, 그러한 의도 감광 생성물은 DNA 복구 과정의 결과를 혼동 할 수있다. 따라서 일러 필터는 짧은 파장으로 샘플의 노출을 방지하기 위해 사용되어야한다. 성공적인 ICL 형성은 UVA 조사 중에 삼중 구조의 안정성에 의존한다. 필요한 UV 조사 시간은 UVA 소스의 전력량에 의존한다. 우리의 경우에는, 20 ~ 30 분은 제를 생성하는 데 필요한전자 UVA의 복용량을 원했다. 이 시간 동안, 램프에서 발생하는 열은 샘플에서 증발 수분 손실을 일으킬 수있다. 물 손실 버퍼 농도를 변경할 수 있고, 삼중 구조의 불안정을 일으킬 수있다. UVA 조사하는 동안 얼음에 반응을 배치하면 샘플의 증발을 방지하는 데 도움이 될 것입니다.
플라스미드 기판 상 소라렌 가교 결합 형성의 효율성을 결정하기 위해, 샘플은 1 % 아가 로스 겔 알칼리성을 (도 1)을 해결 하였다. 일부 프로토콜은 겔 변성 완충액 조건 샘플을 변성 충분한로서 알칼리 로딩 염료가 필요가 없다고 제시하지만 알칼리 겔 전기 영동을위한 대부분의 프로토콜은 2 배 알칼리 겔 로딩 염료를 제안한다. 2 배 염료가 농축 된 DNA 샘플 잘 작동하지만,이 프로토콜은 큰 샘플 볼륨을로드해야합니다. 따라서, 6 배 알칼리 겔 로딩 염료를 사용합니다. PL 가교 결합 랄렌의 적절한 변성을 보장하기 위해asmid 기판은 실온에서 10 분 동안 로딩 버퍼 내의 샘플을 배양한다. 또한, Mg 등 2+ DNA를 entraps하고 침전시킬 수의 Mg (OH) 알칼리 조건 (2)를 형성 할 수있다. 플렉스 - 형성 반응 완충액 2+ 마그네슘을 포함하고, 따라서 2+ mg의 샘플에 알칼리 로딩 염료를 첨가하기 전에 킬레이트되도록 EDTA와 샘플을 배양 중요하다. 전기 영동 한 결과, EtBr이 알칼리성 조건 하에서 DNA에 인터 칼하지 않는 겔을 중화하는 것이 중요하다.
TFO 지시 가교 결합 형성의 효율성을 평가하는 다른 방법은 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 변성의 사용이지만,이 기술은 더 힘든이고, 단편, 방사성 동위 원소 표지 하였다 플라스미드의 제한 효소를 필요로한다. 이것은 현재의 방법은 (D)에 상대적으로 간단하면서도 효과적인 방법을 보여플라스미드 기판상의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 etermine. 그러나,이 기술은 또한 다른 가교 - 형성 제에 의해 ICLS의 형성을 평가하기 위해 적용될 수있다.
플라스미드 칩 분석의 성공적인 결과는 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 프로토콜 및 문제 해결 제안 내의 중요한 단계는 여기에 설명되어 있습니다. 이 분석에 관여하는 중요한 단계는, 포름 알데히드 가교, micrococcal 클레아 제 소화, 초음파, 샘플 세척 및 샘플에서 포름 알데히드 단백질 DNA의 가교의 반전을 포함한다. 효율적인 단백질 DNA 가교를 들면, 신선한 포름 알데히드를 사용하는 것이 중요하다. 37 %의 포름 알데히드의 재고 병 빛에 노출로, 개봉 후 6 개월 이상 사용할 수 없습니다 산소는 포름 알데히드를 저하시킨다. 따라서, 세포 배양 후드에서 광 않고 포름 알데히드 가교를 수행하는 것이 유익하다. 또 다른 중요한 단계는 micrococcal 클레아 제 (MNase) digestio입니다샘플 N. MNase의 소화뿐만 아니라 절단 작은 조각으로 게놈 DNA를뿐만 아니라 극적으로 배경을 줄일 수있는 형질 전환 방법, 동안 세포로 전달되지 않은 모든 남아있는 플라스미드를 제거합니다. MNase 소화 배양 시간은 경험적으로 결정되어야한다. 짧은 배양 기간이 원치 않는 DNA의 비효율적 제거 될 수 있습니다 반면 긴 소화, 샘플의 손실이 발생할 수 있습니다. 우수한 결과는 튜브를 반전시킴으로써 반응 가끔 혼합하면서 실온에서 10 분 배양 후에 알 수있다. 효율적인 면역를 들어, DNA는 800-1,200 bp의 사이의 크기로 조각난해야합니다. 이러한 DNA의 단편화가 샘플들의 철저한 초음파에 의해 달성 될 수있다. 샘플의 효율적인 초음파 수욕에서 초음파 처리에 배치이어서 얇은 PCR 튜브에 펠렛을 재 - 현탁에 의해 달성 될 수있다. 소닉 펄스는 지속적인 초음파에 비해 더 효과적이다. 되어온에서이온은, 단백질 분해를 방지하기위한 펄스 사이의 얼음에 샘플을 배치하는 것이 중요하고, 안정한 단백질 항체 인식 및 후속 침전 단계에 필요한 바와 같이 프로테아제 억제제와 1X 칩 버퍼를 보충하는 것도 중요하다. 그러나, 면역 과정에서, 자성 비드의 소수성 때문에, 비특이적 DNA는 내려 오게된다. 이러한 비특이적 템플릿으로부터 신호를 줄이기 위해 엄격한 세척은 절대적으로 필요하다. 마지막으로, 시료의 단백질 DNA 가교를 적절한 반전은 면역 템플릿의 PCR 증폭에 대한 필요가있다. 최적의 결과를 달성하기 위해, 샘플은 유전자 칩 분석을 통해 플라스미드 기반의 칩 분석을 사용하는 이점이있다 SDS 및 테 K. 적어도 12 시간 동안 배양한다. 예를 들어, 타겟 DNA 손상은 쉽게 게놈 로커스에서 TFO 표적 병변 형성에 비해 플라스미드 DNA 기판과 TFO를 사용하여 달성 될 수있다. 다음은기판의 장착도 TFO 타겟 손상 플라스미드를 사용하는 경우 신호의 강도를 조절하도록 제어 될 수있다. 또한, 이러한 기재는 따라서 ICLS 처리 및 수리에 대한 연구의 범위가 확장 선택 셀 라인에서 사용되는 각종 후보 단백질과 관련하여 테스트 할 수있다.
수퍼 코일 분석은 선형, 수퍼 플라스미드 DNA 사이의 형상의 차이에 기초한다. 수퍼 코일 DNA 플라스미드보다 컴팩트하고 빠르게 겔 매트릭스를 통해 이완 된 플라스미드와 비교하여 이동한다. 프로토콜 및 문제 해결 제안 내의 중요한 단계는 여기에 설명되어 있습니다. 구조적 단백질은 이완 된 플라스미드 수퍼 코일의 유도를 통해 측정 손상된 DNA 기질에 위상 수정을 용이하게하기 때문에, 그것 아가로 스겔로 토포 이소 머라 제 I에 의한 DNA 이완의 정도를 검사 할 필요가 전혀 토포 이소 I.로 플라스미드 긴장 중요 전기.수퍼 코일 버퍼에의 MgCl 2 본은 시간에 석출 할 수 있으며, 2의 MgCl의 존재 하에서 긍정적 supercoils의 형성을 용이하게함으로써 양극과 음극 supercoils의 열분포에 영향을 미친다. 따라서, 혼합 별도의 MgCl 2를 추가하거나 새로운 버퍼 매번 제조 유리하다. 플라스미드 개체군의 topoisomers를 분리하기 위해, 매우 낮은 전압에서 전기 영동을 수행하는 것이 중요하다 (~ 2 V / cm) 때문에, DNA의 이동은 주로 분자의 구조 / 형상에 기초한다. 토포 이소 머라 제 I에 의해 플라스미드 이완이 완료되지 않은 경우, 배양 시간 및 / 또는 사용되는 효소의 양이 증가한다. 완전 이완 불완전하게 이완 된 플라스미드와 수퍼 코일 분석의 사용은 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수 있고, 그 결과는 복제하기 어려울 수 있기 때문에 후속 수퍼 코일 DNA의 단계로 이동하기 전에 확보되어야한다. COMPL 번ETE 완화는 수퍼 코일 분석 수행 비교적 쉽게 달성되었다. 상기 분석의 한 가지 중요한 구성 요소는 DNA 복구 합성 버퍼의 사용이다. 크레아틴 인산과 크레아틴 포스 포 키나제는 혼합 ATP를 생성 할 때마다 추가 될 필요가있다. 수퍼 코일 단계 이후, SDS와 K. SDS는 DNA에서 단백질을 해리의 지원과 테는 K가 수퍼 코일 다양한 수준 그대로 DNA 잎 단백질을 분해 단백질 분해 효소와 함께 배양하여 플라스미드 DNA에서 단백질을 제거하는 것이 중요하다 . 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, topoisomers의 열분포 분명히 보이지 않을 것이다. 클로로포름 : DNA를 페놀로 정제 할 수없는 이소 아밀 알코올, 에탄올 침전으로 인해이 방법 (등) 수 칼자국 DNA, 수퍼 코일의 손실의 결과. 또 다른 중요한 단계는 버퍼 클로로퀸의 추가이다. 클로로퀸은 인터 제인 및 DNA를 풀릴. 에인터, 그것은 음으로 수퍼 코일 DNA를 이완 수퍼 코일 고밀도 함유 topoisomers의 분리를 용이하게 완화 DNA 긍정적 수퍼 코일을 소개한다. 따라서 긍정적이고 부정적인 supercoils는 차별화 될 수있다. 이것은 일반적으로 손쉬운 실험하고 모든 점은 위의 고려 때 높은 재현성이다.
수퍼 코일 더 분명하지 않을 경우에는, 다음 관심의 단백질의 활성을 측정 할 필요가있다. 2 차원 분석은 수퍼 코일 구조적 단백질 (27)에 의해 용이하게 변형 위상을 연구하기 위해 사용되었다. 이 분석은 인간 세포에서 TFO 지시 ICLS의 DNA 손상 처리의 컨텍스트에서 현재 사용되고있다. 이전에 체외 겔 전기 영동 이동성 이동 분석 (20)를 통해 16에서 설명 플라스미드 칩 분석을 사용하여 인간의 세포에서 입증 된 바와 같이 HMGB1은 높은 친화력과 특이성으로 TFO 지시 ICLS에 결합한다. 여기서, U를수리에서 중요한 단계가 될 수는 기판에 부정적인 수퍼 코일 형성에 헬라의 TFO 지시 ICLS에 무 세포 추출물, HMGB1의 어시스트를 결합시 그 입증 된 2 차원 수퍼 코일 분석 (그림 3), 노래 병변 제외 수퍼 코일이 NER 통로 (25)를 통해 DNA 손상의 제거를 촉진하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 이 분석을 이용하여 연구 할 수있는 DNA 손상 처리에 관여 한 여러 구조적 단백질이있다. 이 방법은 시험 관내 연구에 한정되며, 그럼에도 불구하고, DNA 손상 수리 상황에서 구조적 단백질의 구조 - 기능 관계를 심문하는 간단하고 유용한 분석이다. 매우 어려운 것으로 입증 될 그러한 상호 작용에 의해 DNA의 수퍼 코일에 미치는 영향을 평가하면서 그러나, 칩 프로토콜 용이 게놈 DNA 상황에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 수정 될 수있다. 우리와 다른 그룹은 참으로 페이지가게놈 궤적 31-33, 3) 플라스미드 형질 감염 후 세포로 소 랄렌 수정 TFO (와 UVA 조사)를 통합하여을 대상으로 게놈 28 ~ 30 2)에 플라스미드 DNA의 안정적인 형질 전환에 의해 erformed 삼중 기반 연구 1) 10.
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Acknowledgments
저자는 도움이 토론 바스케즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 [KMV하는 CA097175, CA093279] 건강 / 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 암 예방 및 텍사스 연구소 [RP101501]합니다. 오픈 액세스 요금 자금 : 국립 연구소 건강 / 국립 암 연구소 [KMV에 CA093279].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
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