Abstract
Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA'ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA'ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, '-TA-3 5'psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA'ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 'Bir 4'-hidroksimetil-4,5' ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için 1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar 6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler 9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle gergin bir TFO, AG30, kullandık. ICLs bu lezyonlar kovalent iki DNA ipliklerini çapraz gibi son derece sitotoksik olan ve unrepaired bırakılırsa, gen transkripsiyonunu bloke ve DNA replikasyonu makineleri 13,14 engelleyebilir. Çünkü bunların sitotoksik potansiyel ICL-uyarıcı maddeler tedavisinde kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmış olanKanser ve diğer hastalıkların 15. Bununla birlikte, insan hücrelerinde ICLs işleme ve tamir iyi anlaşılmamıştır. Bu nedenle, insan hücrelerinde ICLs işleme oluşumundaki mekanizmaların daha iyi anlaşılması ICL tabanlı kemoterapik rejimlerin etkinliğinin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. TFO kaynaklı ICLs ve onarım ara DNA sarmalının önemli yapısal bozuklukların neden olma potansiyeli var. Bu tür bozulmalar kanonik B formu çift katlı DNA 16-20 daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA'ya bağlanan, mimari proteinleri muhtemel hedeflerdir. Burada, kromatin immunoprecipitation (ChIP) psoralen-çapraz plazmidler üzerinde deneyler yoluyla insan hücrelerinde ICLs ile son derece bol bir mimari protein dernek, HMGB1 okudu ve insan psoralen-çapraz plazmid DNA topolojisini modüle HMGB1 bir rol tespit kanser hücre lizatları.
HMGB1 son derece bol ve yayg ifade non-onunkanonik B formu DNA 17-20 daha yüksek afinite ile hasar görmüş DNA ve alternatif olarak yapılandırılmış DNA alt tabakaları bağlanan sesi mimari proteini. HMGB1 örneğin transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı 16,21-23 gibi çeşitli DNA metabolik süreçlerde, yer almaktadır. Daha önce HMGB1 yüksek afiniteyle 20 ile in vitro TFO yönelik ICLs bağlanan olduğunu göstermiştir. Dahası, HMGB1 olmaması bir nükleotid eksizyon onarım (EŞ) ko-faktör 23,24 olarak TFO yönelik ICLs mutajenik işleme ve tespit HMGB1 artış olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, HMGB1 insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs ilişkili olan ve bu lezyonların olan alım NER protein, DA 16 bağlıdır olduğunu bulduk. DNA negatif süper NER 25 DNA lezyonları randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını teşvik ettiği gösterilmiştir, ve HMGB1 TFO yönelik ICL içeren ÜLR'lerde tercihen negatif süper indükler bulmuşlardırBir NER ko-faktör olarak HMGB1 potansiyel rolü (ler) daha iyi anlaşılmasını sağlayan (non-hasarlı plazmidler yüzeylere göre) orta yüzeyler 16. ICLs işleme tamamen insan hücrelerinde anlaşılmamıştır; Bu nedenle, burada tarif edilen moleküler araçlar göre teknikler ve gelişmiş deneyler da kanser kemoterapi rejimleri etkinliğini arttırmak için kullanılabilir farmakolojik hedefler olarak hizmet verebilir ICL onarımında yer alan ilave edilen proteinlerin tanımlanması için yol açabilir.
Burada, etkili bir yaklaşım tartışılmıştır agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon ile plazmid DNA TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini değerlendirmek. Bundan başka, TFO-yönlendirilmiş ICLs içeren plasmidler kullanılarak teknikler tarif edilmiştir Chip tahlilleri kullanarak hücresel bir çerçevede ICL hasarlı plazmidler ile HMGB1 ilişkisini belirlemek için. Ayrıca, bir uyduruk bir yöntem th tarafından tanıtıldı topolojik değişiklikleri incelemek içinözellikle insan hücre lizatlarında ICL hasarlı plazmid yüzeylerde e mimari proteini HMGB1, iki boyutlu agaroz jel elektroforez ile sarılma tahlilleri gerçekleştirilerek tespit edilmiştir. tarif edilen teknikler, insan hücrelerinde plazmid hedefli DNA hasarının işleme DNA tamiri ve mimari proteinlerin katılımı anlaşılmasını ilerletmek için de kullanılabilir.
Bu plazmid DNA, ve daha sonra plazmid çip ve sırasıyla, DNA topolojisi değiştirebilir lezyonlar ile ilişkilendirmek proteinler ve proteinleri belirlemek için deneyleri sarılma ilgili TFO-yönelimli site özel psoralen ICLs oluşumu için ayrıntılı protokoller tarif eder. Bu deneyler, diğer DNA hasar verici maddeler, TFOlar, plazmid alt tabakalar ve ilgi memeli hücre hatları ile gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Aslında, en azından bir olası benzersiz ve yüksek afiniteli TFO-bağlama bölgesi, insan genomunda 26 her açıklamalı geni içinde olduğunu göstermiştir. NasılBiz Mukherjee ve Vasquez 2016, 16 kullanılan gibi bir zamanda, netlik sağlamak için, insan U2OS hücrelerinde spesifik mutasyon haberci plazmid (pSupFG1) belirli bir psoralen-konjuge TFO (pAG30) kullanımı için bu teknikleri tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plazmid substratlar üzerinde TFO yönelik ICLs hazırlanması 1.
- 10,11, DNA tripleks bağlanma tamponu [% 50 gliserol, 10 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgC 8 ul psoralen-konjuge TFO AG30 (5 ug plazmid DNA, iyi bir başlangıç noktasıdır) plazmid pSupFG1 eşit molar miktarlarda inkübe 2] ve amber rengi bir tüp içinde 40 ul'lik nihai bir hacme kadar dH 2 O. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. 12 saat boyunca 37 ° C su banyosunda reaksiyon inkübe edin.
- Tam güç çıkışı sağlamak için UVA lamba ısıtın. parafin filmde tripleks reaksiyonu yerleştirin ve UVA (365 nM) lambası altında buz üzerinde parafin filmi yerleştirin. lamba ve tepki arasındaki bir Mylar filtre yerleştirin.
- UVA 1.8 J / cm2 toplam doz için ışın tedavisi. Daha fazla kullanım için 4 ° C'de örnekleri saklayın.
Dikkat: UVA ışınlama ile uygun koruyucu gözlük ve giysiler giyin. - RE yukarıda hazırlanan plazmid 200 ng Linearizeüreticisi kullanılarak 20 ul toplam hacmi sınırlandırması enzim Eko R1 10x tampon verilir. Isıtma 65 ° C'de 20 dakika süreyle enzim denatüre. 10,000 x g'de 10 dakika süre ile numuneler spin ve 4 ° C'de depolayın.
- 50x alkalin tampon [1.5 M NaOH, 50 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)] hazırlanır. 50 ml dH 2 O ile agaroz 0.5 mg ekle agaroz çözülür ve 50 ° C su banyosunda yerleştirmek için kaynatın.
- çözündürüldü agaroz ısılar 50 ° C sonra, 50x alkali 1 ml tampon eklemek, karıştırmak ve daha sonra jel tepsiye jel dökün. Jel kullanmadan önce oda sıcaklığında katılaşmaya için zaman tanıyın.
- Doğrusal hale getirilen DNA örneğin 20 ul 0.5 M EDTA 4 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
- 6x alkali jel yükleme tamponu ekleyin (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, (w /% 18 hacim), yüksek molekül ağırlıklı polisakkarid,% 0.06 bromokresol dH 2 O) örnekleri ve 1 kb DNA merdiveni.
NOT: 6x alkali jel yükleme tamponu kullanılması önemlidir, tartışma bakın. - Yük soğuk oda jel üzerine örnekleri ve cm başına 3.2 volt gecede 1x alkali tampon (12-16 saat) çalıştırın. Örnekler jel girdikten sonra, yüzer önlemek için jel üstünde bir cam plaka yerleştirin.
- nötralizasyon tamponu [1 M Tris-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCI, 3 M sodyum asetat (pH 5.2)], oda sıcaklığında 45 dakika boyunca jel ıslatılmasıyla, örnekleri nötrleştirmek.
- Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 50 ml su içinde% 1, etidyum bromür (EtBr) 4 ul DNA jel leke. 15 dakika boyunca su ile destain. Bir görüntüleme sistemi ile DNA görselleştirmek.
Dikkat: EtBr güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. EtBr ile doğrudan temastan kaçının.
İnsan hücrelerinde TFO yönelik ICL-içeren plazmidlerin 2. transfeksiyonu ve immüno-çökeltme
- Plaka 400,000 memeli hücreleri (örneğin, U2OS ODulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 60 mm tabak başına steosarcoma hücre) 24 saat transfeksiyondan önce antibiyotikler olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe hücreleri.
- Bir su banyosu içinde 37 ° C transfeksiyon sıcak büyüme ortamı ve fosfat tamponlu tuz (PBS) önce. Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın.
- 10 dk için 500 1 x büyüme ortamı ul (karışım 1) ve 2 ayrı 14 ml 1 x büyüme ortamı (karışım 2) 500 ul plazmidler ICL içeren TFO yönelik yuvarlak tabanlı tüp ug transfeksiyon reaktifi 30 ul inkübe oda sıcaklığı.
- 2, mix yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın karışımı 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 25-30 dakika inkübe edilir.
- sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücrelerin plaka boyunca eşit dağıtarak damla damla moda transfeksiyon karışımı ekleyin. plakasına büyüme ortamının 1 ml ilave edilir ve 2 ml nihai hacim getirmek. biz mixll. 4 saat% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör kültür plakaları yerleştirin.
- % 10 FBS ile takviye edilmiş 3 mi büyüme ortamı ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edilir. Antibiyotik kullanmayın.
- yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona plaka başına% 37 taze formaldehit 80 ul hücreleri tedavi ve ışıksız ortamda, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
Dikkat: Formaldehit toksik ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. Formaldehit maruziyeti deri, göz ve solunum yollarında zarar verebilir. - Plaka başına (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) soğutulmuş glisin 300 ul ilave edildikten ve 5 dakika için inkübe edilmesi ile formaldehid çapraz bağlanmasını Quench. Ortamı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içine soğutulmuş (4 ° C) PBS, 1 ml kazınarak hücreleri toplamak. her zaman buz üzerinde örnekleri tutun.
- Ve 5 dakika 4 ° C 'de santrifüj ile hücre pelletleri hazırlamakBir masa buzdolabında santrifüj kullanılarak 13.400 xg t. Pipet dışarı Süpernatantı ve buz üzerinde hücre pelet yerleştirin.
- Homojen olarak 1 ml soğutulmuş (4 ° C) tampon A (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) pelet tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Tersine tüp bazen karıştırın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız).
- Homojen soğutulmuş 1 ml pelet (4 ° C) tampon B (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) tekrar süspansiyon ve çevrilmesi ile ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri (yukarıdaki adım 2.9).
- Tampon B soğutulmuş 200 ul içinde tekrar hücrelerin tekrar micrococcal nükleaz (MNase) 2 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. tüp hafifçe vurarak bazen tepkisini karıştırın. Buz üzerinde tüp yerleştirilmesi ve 40 mM EDTA eklenerek MNase reaksiyonu durdurun. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız).
- 100 ul 1x kromatin immunopr yeniden süspanse hücreleriproteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş ecipitation tamponu (ChIP) tamponu (piyasada mevcut kitler verilir).
- ince duvarlı mikrofüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. buz üzerinde 20 sn inkübasyon tarafından takip 20 saniye boyunca su banyosu sonikatör bunları yüzen tarafından örnekleri sonikasyon. Tekrarlayın sonikasyon ~ 800-1,200 bp parçaları üretmek için 9 kez yineleyin.
- sonike numunelerin 20 ul için vorteks yoluyla iyice 3 ul 5 M NaCl ve 1 ul RNaz A karışımını ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 2 ul Proteinaz K ekleyip 65 ° C'de 2 saat inkübe edilir. PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. % 1 agaroz jel örnekleri çalıştırın ve EtBr ile görselleştirmek.
NOT: Elde edilen DNA maksimum yoğunluğu veya 1000 bp altında olmalıdır.
- sonike numunelerin 20 ul için vorteks yoluyla iyice 3 ul 5 M NaCl ve 1 ul RNaz A karışımını ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 2 ul Proteinaz K ekleyip 65 ° C'de 2 saat inkübe edilir. PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. % 1 agaroz jel örnekleri çalıştırın ve EtBr ile görselleştirmek.
- Üç ayrı tüplerde, önceden soğutulmuş bir silikonlu bir tüp içinde lizat 30 ul ve ilave proteaz inhibitörleri ile soğutulmuş 1x ChIP tamponu 70 ul ekle. 1 u eklemeilgili borular anti-immünoglobulin G (IgG) (pozitif kontrol olarak), anti-histon H3, ya da anti-HMGB1 antikor örn. sürekli dönmesi ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin.
- homojen soğuk odada süspanse protein G boncuk. tüp başına protein G boncuk 4 ul ekleyin ve rotasyon ile soğuk bir odada bir 2-4 saat süre ile inkübe edilir.
- manyetik raf kullanarak, boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak. pelet proteaz inhibitör kokteyli ile karıştırılmış 200 ul 1x ChIP tamponu ilave edin ve rotasyon ile soğuk bir odada 5 dakika yıkayın. iki kez yıkayın tekrarlayın.
- yüksek tuzlu 1x ChIP tamponu (70 mM NaCl ihtiva eden) sahip bir ek yıkama yapın.
- (Ticari olarak temin edilebilir kitler temin) 160 ul yıkama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca rotasyon ile 37 ° C'de inkübe edin.
- boncuk pelet ve taze bir tüp içinde süpernatant toplamak. 5 M NaCl 6 ul proteinaz K 2 ul ekleyin ve 65 ° C'de gece boyunca inkübe° C.
- Bir PCR ürünü saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve 50 ul dH 2 O kullanılarak DNA Zehir
- PCR ilgi bölgesi (ler) primer setleri kullanılarak 16 reaksiyonları gerçekleştirmek ve EtBr ile boyanmış bir% 1 agaroz jeli üzerinde ürün çözümler.
3. süperburulma Testi ve 2 boyutlu Agaroz Jel Elektroforez
- DNA tamir sentez tamponu hazırlayın (45 mM Hepes-KOH, pH 7.8; 70 mM KCI, 7.4 mM MgCl2, 0.9 mM DTT, 0.4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTP,% 3.4 gliserin ve 18 ug sığır serum albümini) . -80 ° C'de saklayın. buz ve önceki üzerinde çözülme 40 mM phosphocreatine ve 2.5 ug kreatin fosfokinaz eklemek kullanmak için.
- Oda sıcaklığında 10 x sarılma tamponu [500 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCI, 25 mM MgCI2, 1 mM EDTA] ve mağaza hazırlayın.
- Tamamen 1x 1 ul Vaccinia Topoizomeraz I (5-15 U / ml) kullanılarak süper-plazmid pSupFG1 DNA 300 ng Linearize10 ul reaksiyon tampon maddesi sarılma. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe karışımı.
- Buz üzerinde HeLa hücre içermeyen özü 24 çözülme. tamamen rahat plasmidler için, 25 ul HeLa hücresi serbest özütü ve DNA onarımı sentez tamponu ilave edin. İyice karıştırın. karışımı, Vaccinia topoizomeraz I ilave 1 ul ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
- sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1 son konsantrasyon) ve proteinaz-K (0.25 mg / ml son konsantrasyon) eklenerek reaksiyonlar sonlandırma. 2 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
- 1x Tris Borat EDTA (TBE) tamponu ile bir% 1 agaroz jeli Dökme. DNA yükleme boyası ekleyin ve en az 4 şerit dışında jel üzerine doğrudan tepkileri yükleyin. topoisomers çözmek için oda sıcaklığında 1 x TBE 2 V / cm (boyut 1) 8-10 st için jel üzerinde çalıştırıldı.
Not: Tris bazı, 54 g ekleyerek dH 2 O 1 L 5x TBE stok çözelti hazırlayın. borik asit 27.5 g ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mi. - 1x 2 L hazırlayın3 ug / ml miktarında klorokuin katılımının-fosfat TBE. 20 dakika için bu çözelti, 200 ml jel bekletin. alüminyum folyo ile jel tepsisi örtün.
- İkinci boyutta jel Electrophorese için, saat yönünde moda, jele 90 ° çevirin ve pozitif ve negatif sarımları çözmek için 1x TBE içeren klorokin 2 V / cm 4-6 saat çalıştırın.
- bir rocker 1 saat süreyle EtBr ile jel Leke. 15 dakika dH 2 O ile jel destain ve daha sonra bir görüntüleyici kullanarak topoisomers termal dağılımını görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TFO-yönlendirilmiş ICL'in oluşumu insan hücrelerinde ICL işleme mimari proteinlerin rolleri sorgulamak için kullanılan plazmid bazlı deneyler için önemlidir. agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini belirlemek için, basit bir yöntemdir. TFO-yönlendirilmiş ICLs barındıran plasmidleri un çapraz bağlanmış kontrol plazmid (Şekil 1A, şerit 2) ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi (Şekil 1A, yol 3) ile daha yavaş bir hareketliliğe sahip göç ederler. Şeritli 2 ve 3 (Şekil 1A) içinde bantların densitometrik ölçümü plazmid nüfusunun yaklaşık% 70'i bu plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICL oluşumunu gösteren (siyah ok tarafından belirlenen) yavaşlamış hareketlilik ile jel ile göç ortaya koymaktadır.
İnsan U2OS hücreleri tr alıntılar üzerinde yapılan kromatin immünopresipitasyonkontrol plasmidi (P) ya da TFO yönelik ICLs ihtiva eden plasmidler ile ya ansfected (P-ILC) kontrolü (P) bölgesinde, bir anti-HMGB1 antikoru ile imüno-çökeltilir (Şekil 2 ile karşılaştırıldığında p-ICL bölgesinde HMGB1 gösterisi zenginleştirme , üst panel) 2 şeritleri ve 3. Bu sonuçlar, insan hücrelerinde ICLs o HMGB1 ortakları göstermektedir. HMGB1 siRNA tedavi yoluyla hücrelerden tükendiği zaman, p-ICL özgü zenginleştirme azalmış (Şekil 2, üst panel, kulvarlar 4 ve 5), beklendiği gibi. Aynı örnekler bir antikor özgüllüğü kontrolü olarak bir anti-IgG antikoru kullanılarak immünopresipitasyon, hiçbir PCR amplifikasyonu, beklendiği gibi (Şekil 2, üst panel, 6-10 kulvar) tespit edilmiştir. Şekil 2'de şeritli 10-14 (üst panel) normalleşmesi için kullanılan giriş örnekleri vardı. Üst panel distal primerler tfo yönettiği zaman TFO yönettiği ICL site ve alt panel yakın primerler tarafından PCR PCR FuarlarICL Alanı kullanıldı.
HMGB1 Hasarsız DNA bağlayan daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA bağlanan bir mimari proteinidir. Iki boyutlu, agaroz jel elektroforezi vasıtasıyla çözülmüş DNA'nın kendi üstüne arılma deneyleri HeLa hücre ekstrelerinde HMGB1 (Şekil 3) plazmidler (P) kontrol grubuna göre TFO yönelik ICL içeren plazmidler (P-ILC) mimari değişiklik göstermektedir. P-ICL içeren yüzeylerde tercihen HMGB1 tarafından uyarılan mimari değişiklik negatif süperburulma artış olarak algılanır. Süper-plazmidler rahat veya lineer plazmidler göre agaroz jelleri ile hızlı göç. Topoisomers dağılımı HMBG1 mevcudiyetinde P (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında p-ICLs fazla sarılma gösterir. klorokin varlığında ikinci boyutta ark solak olumsuz yönde, süper DNA çalışır. P-ICL üzerinde HMGB1 tarafından uyarılan süperburulmaçok olumsuz sarımları oluşumunu gösteren solak yay (~ 14 topoisomers kontrol plasmidinden ~ 7 topoisomers göre plazmidleri içeren TFO-yönlendirilmiş ICL ile tespit edilmiştir) oluşturmak topoisomers oluşur gibi görünüyor. Özet olarak, bu veriler, TFO-yönlendirilmiş ICLs plasmidler kromatin immünopresipitasyon işlemleri ile insan hücrelerinde DNA lezyonları mimari proteini HMGB1 yüksek afinite ilişki incelemek için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, HMGB1 P-ICL substratların özel mimari değişiklikler de sarılma tahlilleri ve iki boyutlu agaroz jel kullanılarak incelenebilir.
Şekil 1: Alkali agaroz jel elektroforezi deney plazmid pSupFG1 ilgili TFO yönelik ICL oluşumu etkinliğini ölçmek için (A) Şerit 1, 1 kb DNA merdiveni,. şerit 2, plasmid pSupFG1 (P), bir kontrol olarak kullanılır; ve şerit 3, ICL içeren pSupFG1 (P-ICL) TFO yönetti. (Jel sağından siyah okla gösterilen) Şerit 3'te gösterildiği gibi ICLs barındıran plasmidleri jelde daha yavaş göç ederler. Lane 2 ve şerit 3 bantların (B) Densitometrik miktar plasmidlerin yaklaşık% 70 çapraz bağlı olduğuna işaret etmektedir. Bu rakam referans 16 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: çapraz bağlı plazmid TFO yönelik ICL içeren bölgeye HMGB1 yonga deney Gösteren zenginleştirme (A). immüno-parçalarının PCR amplifikasyonu, sırasıyla sağ(P1 ve P2, üst panel B) ve, bundan başka (yaklaşık 2000 bp) olduğu bir özgüllük kontrol olarak kullanılan primerlerin bir ikinci dizi TFO yönelik ICL alanının yakınında yakın bir primer seti kullanılarak bir% 1 agaroz jeli üzerinde esolved yer yönlendirmeli ICL (B; P3 ve P4, alt panel). Şerit 2 ve 3 (yol 3) hasarsız DNA (şerit 2) göre TFO yönelik ICL'in civarındaki HMGB1 zenginleştirme göstermektedir. Şerit 4 ve 5, bir IgG antikoru kullanılarak antikorun özgüllük kontrollerdir. Şerit 6 ve 7 giriş örnekleri vardır. Şerit 8 PCR reaksiyonu için bir negatif kontrol ve herhangi bir DNA şablonu içerir. P, plazmid pSupFG1. P-ICL, ICL içeren plazmid pSupFG1 TFO yönetti. Bu rakam referans 16 modifiye edilmiştir. (B) P1 ve P2 yanı sıra P3 ve P4 için astar siteleri gösteren plazmid pSupFG1 şematik diyagramı. Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.
Şekil 3: TFO yönelik ICL ihtiva eden plasmidler negatif üste sarımları 2D agaroz jel elektroforezi gösteren oluşumu, HMGB1 kolaylaştırılabilir 1x TBE agaroz jeli, tek başına (P) plazmid tarafından üretilen topoisomers ısı dağılımını gösterir veya psoralen-çapraz bağlanmış. plazmid (P-ILC). süper-türlerin hareket hızlı rahat plazmidler ile karşılaştırılır. Her bant sırasıyla bir az veya daha fazla süpersarmal dönüş aşağıda ya da yukarıda bant farklı bir topoisomer temsil eder. solak ark olumsuz (negatif) türleri, süper temsil ve sağ elini kullanan ark pozitif (+ ve) türleri, süper temsil eder. psoralen ICL içeren plazmid nüfus (P-ICL) daha fazla kontrol plazmidler (P) daha türler, süper içerir. R, rahat plazmidler; S, süperkoyllu plazmidler; 1D,jel elektroforezi ilk boyutu; 2B, jel elektroforezi İkinci boyut. Bu rakam 16 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebilir. Tfo kirletici safsızlıklar daha fazla deneysel sonucu karmaşık hale getirebilir istenmeyen çapraz ürünler yol açabilir. TFOlar çoklu dondurma-eritme oligonükleotidlerin düşmesine neden olabilir kovalent bir 5'-HMT psoralen bağlı TFOlar stabilitesini artırmak için, TFOlar, -80 ° C 'de parçalar halinde muhafaza edilmelidir. Tripleks oluşumu sonra belirli bir siteye psoralen hedef (örneğin, 5'-TA-3 've 5'-AT-3', önceden olanimtiyazlı psoralen sitesi çapraz bağlama), psoralen ICL formasyonu UVA ışıması gerektirir. 1.8 J / cm2 UVA dozu in vitro plasmidler üzerindeki ICLs optimal oluşumu için yeterlidir. maruz kalma süresi bir fotometre kullanılarak belirlenmelidir. UVA lambası kaynağına bağlı olarak, 365 nm'de UV yayan ilave olarak, lamba DNA omurgası boyunca istenmeyen DNA hasarının oluşumuna neden olabilir daha kısa dalga boylarına, yayabilir. TFO-yönlendirilmiş ICL içeren plazmidler özel bir bölgeden ICL'e DNA onarımı ile ilgili çalışmalar için kullanılacak olduğundan, bu tür istenmeyen PHOTOPRODUCTS DNA onarım çalışmalarının sonuçlarını karıştırıcı etki. Bu nedenle, bir Mylar filtresi daha kısa dalga boylarına örneklerin maruz kalmasını önlemek için kullanılmalıdır. Başarılı ICL oluşumu UVA ışınlama sırasında tripleks yapısının istikrarı bağlıdır. Gerekli UV ışınlaması zamanı UVA kaynağının watt bağlıdır. Bizim durumumuzda, 20-30 dk th üretmek için gereklidire UVA dozu istenen. Bu süre boyunca, lamba tarafından üretilen ısı örneklerinden buharlaşan su kaybına neden olabilir. Böyle bir su kaybı tampon konsantrasyonu değiştirebilir ve tripleks yapılarının istikrarsızlaştırma neden olabilir. UVA ışınlama sırasında buz üzerinde reaksiyonlar yerleştirilmesi numunelerin buharlaşmasını önlemek için yardımcı olacaktır.
Plazmid yüzeylerde psoralen çapraz oluşumu etkinliğini tespit etmek için, numuneler,% 1 alkali agaroz jelleri (Şekil 1) çözüldü. Bazı protokoller jel denatüre tampon koşulu örnekleri denatüre için yeterli alkali yükleme boya, gerekli olmadığını düşündürmektedir rağmen alkalin jel elektroforezi için en protokolleri, 2x alkalin jel yükleme boyası öneririz. 2x boya konsantre DNA örnekleri ile çalışır iken, bu protokol büyük bir örnek hacmi yükleme gerektirir. Bu nedenle, 6x alkali jel yükleme boyası kullanın. pl çapraz bağlanmış psoralen uygun denatürasyonunu sağlamak içinasmid alt-tabakalar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yükleme tamponu içinde örnekleri inkübe edin. Buna ek olarak, Mg2 + DNA hapseder ve çökelmesine neden olabilir Mg (OH) alkali koşullar altında 2, oluşturabilir. Tripleks oluşturan reaksiyon tamponu 2+ mg içerir ve bu nedenle, Mg2 + örnekleri alkali yükleme boyası eklemeden önce şelatlı sağlamak için EDTA ile örnekleri inkübe önemlidir. Elektroforezisten sonra, EtBr alkalin koşullar altında DNA ile enterkale etmez gibi, jel nötralize edilmesi önemlidir.
TFO-yönlendirilmiş çapraz oluşumu etkinliğini değerlendirmek için alternatif bir yaklaşım poliakrilamid jel elektroforezi ile denaturasyon kullanılması, ama bu teknik daha zahmetlidir ve fragmanlarının radyoaktif izotop etiketleme ve ardından plazmid sınırlama sindirimi gerektirir. Bu, geçerli bir yaklaşım d nispeten basit, ama etkili bir yöntem gösteriyorPlazmid yüzeylerde TFO yönelik ICL oluşumu etkinliğini etermine. Bununla birlikte, bu teknik, hem de diğer çapraz-oluşturucu ajanlar ICLs oluşumunu değerlendirmek için uygulanabilir.
Plazmid ChIP deneyi başarılı bir sonuç, bir dizi faktöre bağlıdır. protokol ve sorun giderme önerileri içinde kritik adımlar burada tartışılır. Bu deneyi içerisinde yer alan kritik adım formaldehit çapraz bağlanmasını, mikrokok nükleaz sindirimini, ses etkisi, örnek yıkama ve örneklerde formaldehit protein-DNA çapraz bağların ters bulunmaktadır. etkili bir protein-DNA çapraz bağlama için, taze formaldehid kullanılması önemlidir. % 37 formaldehit stok şişeleri ışık maruz kalma gibi, açıldıktan sonra en fazla altı ay süreyle kullanılmamalıdır ve oksijen formaldehit bozar. Nedenle, hücre kültürü kaputu ışıksız formaldehit çapraz bağlanmasını gerçekleştirmek için de faydalıdır. Bir başka önemli adım micrococcal nükleaz (MNase) digestio olduğunuÖrneklerin n. MNase sindirim sadece yaran küçük parçalara Genomik DNA değil, aynı zamanda dramatik arka plan azaltabilir transfeksiyon yöntemi sırasında hücrelere teslim edildi herhangi bir kalıcı plazmidler kaldırır. MNase sindirim inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. kısa inkübasyon süreleri, istenmeyen DNA'nın yetersiz uzaklaştırılmasına neden olabilir, oysa uzun sindirim, numunelerin kaybına neden olabilir. Mükemmel sonuçlar tüpler ters çevrilerek reaksiyonlar, ara sıra karıştırarak, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildikten sonra görülebilir. verimli immunoprecipitation için DNA 800-1,200 bp arasındaki boyutlarda parçalanmış edilmelidir. DNA bu şekilde dağılmış örneklerinin ayrıntılı sonikasyon ile elde edilebilir. Örneklerin etkin sonikasyon suda banyo sonikatörü içinde yerleştirerek, daha sonra ince duvarlı PCR tüpleri pelet yeniden süspansiyon ve elde edilebilir. Sonic bakliyat sürekli sonication göre daha etkilidir. addit içindeiyonu, protein bozulmasını önlemek için darbeler arasında buz üzerinde örneklerin yerleştirilmesi önemlidir ve kararlı proteinlerin antikorun tanınması ve daha sonra çökeltme aşamaları için gerekli olan, proteaz inhibitörleri ile 1x ChIP tampon tamamlamak için de önemlidir. Bununla birlikte, immüno işlemi sırasında manyetik boncuk hidrofobik doğası nedeniyle, spesifik olmayan bir DNA çekilecektir. Bu tür spesifik olmayan şablonlar sinyalleri azaltmak için, sıkı yıkama kesinlikle gereklidir. Son olarak, örneklerin protein-DNA çapraz bağlar doğru ters imüno şablonları PCR amplifikasyonu için gereklidir. En iyi sonuçları elde etmek için, numuneler genomik yonga deneyi boyunca plazmid tabanlı çip tahlili kullanılarak faydaları vardır SDS ve proteinaz K ile en az 12 saat süre ile inkübe edilmelidir. Örneğin, hedef DNA hasarı kolayca genomik lokusta TFO hedefli lezyon oluşumu ile karşılaştırıldığında, bir plazmid DNA alt-tabakayı ve bir TFO kullanılarak elde edilebilir. biralt-tabakanın bağlama, aynı zamanda, bir TFO-hedefli zarar plazmid kullanıldığında sinyallerin yoğunluğu modüle edilmesi için kontrol edilebilir. Bundan başka, bu gibi alt-tabakalar bu şekilde ICLs işlenmesi ve onarım çalışmaları kapsamının genişletilmesi, seçilen herhangi bir hücre hattı kullanılmıştır ve çeşitli aday protein ile birlikte test edilebilir.
Aşırı sargılanma deney lineer ve Süper sarmallı plazmid DNA ile şekil farka dayanır. Süperkoil DNA plasmidleri daha kompakt ve daha hızlı jel matrisi ile rahat plazmidler göre göç. protokol ve sorun giderme önerileri içinde kritik adımlar burada tartışılır. mimari proteinler rahat plazmid süperburulma indüksiyonu yoluyla ölçülen hasarlı DNA yüzeylerde, topolojik değişiklikler kolaylaştırmak için, agaroz jel vasıtasıyla Topoizomeraz I neden olduğu DNA gevşeme ölçüde incelemek gerekir tamamen Topoizomeraz I ile plazmidler dinlenmek için kritik öneme sahiptir Elektroforez.Aşırı sargılanma tamponu içinde MgCl2, bu, zaman içinde çökelebilir ve MgCI2 varlığı pozitif üste sarımları oluşumunu kolaylaştırarak pozitif ve negatif üste sarımları termal dağılımı etkilemektedir. Bu nedenle, karışımı ayrı MgCI2 eklemek veya taze tampon her hazırlanması için faydalıdır. Plazmid popülasyonlarının topoisomers ayırmak için, çok düşük bir voltajda jel elektroforezi gerçekleştirmek için önemlidir (~ 2 V / cm), DNA'nın göçün ağırlıklı moleküllerin yapısı / şekline bağlıdır. Topoizomeraz I tarafından plasmidlerin gevşeme tam değilse, o zaman kuluçkalama süresi ve / veya kullanılan enzim miktarı artırılmalıdır. Tam rahatlama eksik rahat plazmid ile süperburulma testinin kullanımı verilerinin yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve sonuçları çoğaltmak zor olabilir, çünkü bir sonraki DNA süperburulma adıma geçmeden önce sağlanmalıdır. compl kezete gevşeme sarılma deneyi gerçekleştirmek için nispeten kolaydır, elde edilmiştir. Bu tahlilde önemli bir bileşeni, bir DNA onarım sentez-tamponu kullanılmasıdır. fosfokreatin ve kreatin fosfokinaz karışımına ATP üretmek için her zaman ilave edilmesi gerekmektedir. Aşırı sargılanma aşamasından sonraki, SDS ve K. SDS DNA proteinleri ayırmasına yardımcı olur ve proteinaz K süperburulma çeşitli seviyelerde sağlam DNA bırakır protein düşer proteinaz ile inkübe edilerek plazmid DNA proteınlerı çıkarmak için önemlidir . Protein tamamen kaldırıldı değilse, topoisomers termal dağılımı açıkça görülebilir olmayacaktır. kloroform: DNA, fenol ile saflaştırılmıştır edilemez izoamil alkol ve etanol ile çökeltilmiştir, bu yöntem (ve diğerleri) olabilir ID DNA süperburulma kaybı ile sonuçlanır. Bir başka önemli adım tamponuna klorokin eklenmesidir. Klorokin bir interkalasyon temin edici madde ve DNA katlıyor. üzerineardalanması, bu olumsuz, süper DNA'yı rahatlatır ve süperburulma bir yüksek yoğunluklu içeren topoisomers ayrılmasını kolaylaştıran rahat DNA pozitif supercoiling tanıtır. Böylece pozitif ve negatif sarımları ayırt edilebilir. Bu genellikle bir basit deney ve tüm noktalar yukarıda göz önüne alındığında son derece tekrarlanabilir.
Resim sarılma açıktır, ancak, o zaman ilgili proteinin aktivitesinin belirlenmesi için gereklidir. 2B süperburulma tahlil mimari proteinler 27 kolaylaştırdı topolojik değişiklikleri incelemek için kullanılır olmuştur. Bu deney, insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs DNA hasarı işlem bağlamında burada kullanılmaktadır. Daha önce in vitro jel elektroforetik mobilite kayma analizleri 20 ile ve 16 içinde tanımlanan plazmid ChIP tahlili kullanılarak insan hücrelerinde görüldüğü gibi HMGB1 yüksek yakınlık ve özgüllük ile TFO yönelik ICLs bağlanır. Burada, utamir önemli bir adım olabilir bu alt tabakalar üzerinde negatif süper oluşumunda HeLa TFO yönelik ICLs hücre içermeyen özütler, HMGB1 asist bağlanma üzerine olduğu gösterilmiştir 2D sarılma deneyi (Şekil 3), şarkı lezyon negatif süperburulma-EŞ yolu 25 yoluyla DNA hasarının çıkarılmasını kolaylaştırmak için bilindiğinden. Bu tahlil kullanılarak incelenebilen DNA hasarı işleme implike edilmiştir birçok mimari protein vardır. Bu yaklaşım, in vitro çalışmalar ile sınırlıdır, yine de, DNA hasarı tamir bağlamında mimari proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisini sorgulamak için basit ve kullanışlı bir deneydir. oldukça zor olabileceği gibi etkileşimler DNA süperburulma üzerindeki etkilerini değerlendirmek Ancak, ChIP protokol kolayca, genom bağlamında DNA-protein etkileşimleri incelemek için modifiye edilebilir. Biz ve diğer gruplar gerçekten p varBir genomik 31-33 ve 3) plazmid transfeksiyon sonrasında hücreler içine psoralen ile modifiye edilmiş TFO (UVA ışıması) eklenerek hedefleme ile genomun Şubat 28-30) plazmid DNA'nın kararlı transfeksiyonu ile erformed tripleks dayalı çalışmalar 1) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar yararlı tartışmalar için Vasquez laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma [Kmv için CA097175, CA093279] Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü [RP101501] ve. açık erişim ücret karşılığında Fon: National Institutes Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü [KMV için CA093279].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
