Abstract
caixa de grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) a proteína é uma proteína não-histona arquitectónico que está envolvido na regulação de muitas funções importantes no genoma, tais como transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN. HMGB1 se liga ao DNA estruturalmente distorcida com maior afinidade do que a B-ADN canónica. Por exemplo, descobrimos que HMGB1 se liga ao DNA intercadeias ligações cruzadas (CIET), que covalentemente ligam as duas cadeias do DNA, causar distorção da hélice e, se deixada sem conserto pode causar morte celular. Devido ao seu potencial citotóxico, vários agentes indutores de ICL são actualmente utilizados como agentes quimioterapêuticos em clínica. Enquanto os agentes ICL-formando mostrar preferências por certas sequências de bases (por exemplo, 5'-TA-3 'é o local de reticulação preferido para psoraleno), que em grande parte induz danos no ADN de uma forma indiscriminada. No entanto, por acoplamento covalente do agente de indução de ICL a um oligonucleótido de formação de triplex (TFO), que se liga a DNA de uma sequência-específicaforma, o dano ao DNA alvo pode ser alcançado. Aqui, nós utilizamos um TFO covalentemente conjugado no "fim a um 4'-hidroximetil-4,5 'a 5 (HMT) psoraleno, 8-trimetilpsoraleno para gerar um ICL específica do local num plasmídeo repórter-mutação a ser usado como uma ferramenta para estudar a modificação de arquitectura, processamento, e reparação das lesões do ADN complexas por HMGB1 em células humanas. Descrevemos técnicas experimentais para preparar ICLs TFO dirigidos em plasmídeos repórter, e para interrogar a associação de HMGB1 com os ICLs TFO dirigidos em um contexto celular usando ensaios cromatina imunoprecipitação. Além disso, descreve-se ensaios de super-enrolamento de ADN para avaliar a alteração de arquitectura específica do ADN danificado por medição da quantidade de voltas superhelical introduzidas no plasmídeo psoraleno-reticulada por HMGB1. Estas técnicas podem ser usadas para estudar os papéis de outras proteínas envolvidas no processamento e reparação de ICLs TFO-dirigida ou outro dano do DNA alvo em qualquer linha celular de interesse.
Introduction
Triplex-formando oligonucleotídeos (TFO) DNA ligam duplex de uma forma específica de sequência por meio de ligação de Hoogsteen-hidrogênio para formar estruturas 1-5 triple-helicoidais. Tecnologia triplex foi utilizado para interrogar uma variedade de mecanismos biomoleculares, tais como a transcrição, reparação de danos do ADN, e o gene de segmentação (revisto em referências 6-8). TFO têm sido amplamente utilizados para induzir dano local específico em plasmídeos repórter 9,10. O nosso laboratório e outros já anteriormente utilizado um TFO, AG30, presa a uma molécula de psoraleno para induzir reticulações intercadeias de ADN específicas do local (ICLs) no gene supF no plasmídeo pSupFG1 5,10-12. ICLs são altamente citotóxica como estas lesões covalente reticular as duas cadeias de ADN e, se deixada sem conserto, pode bloquear a transcrição de genes e impedem a maquinaria de replicação do DNA 13,14. Devido ao seu potencial citotóxico, agentes indutores de ICL foram usados como drogas quimioterapêuticas no tratamentode câncer e outras doenças 15. No entanto, o processamento e reparação de ICLs nas células humanas não é bem compreendido. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processamento de ICLs em células humanas pode ajudar a melhorar a eficácia dos regimes quimioterapêuticos baseados em ICL. ICLs-induzidas TFO e seus intermediários reparação têm o potencial de causar distorções estruturais importantes para a hélice do ADN. Tais distorções são alvos prováveis para proteínas de arquitectura, que se ligam ao ADN distorcido com maior afinidade do que a B-forma canónica de ADN duplex 16-20. Aqui, estudou-se a associação de uma proteína de arquitectura altamente abundante, HMGB1 com ICLs em células humanas por meio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios em plasmídeos de psoraleno-reticulado e identificado um papel para HMGB1 na modulação da topologia do ADN plasmídeo psoraleno-reticulado em humanos Os lisados celulares de cancro.
HMGB1 é altamente abundante e ubiquamente expresso não-Hisproteína arquitectónico tom que se liga ao DNA danificado e substratos de DNA, alternativamente, estruturados com maior afinidade do que o DNA-forma canónica B 17-20. HMGB1 está envolvido em vários processos metabólicos de ADN, tais como a transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN 16,21-23. Demonstrámos previamente que se liga a HMGB1 ICLs TFO-dirigida in vitro com alta afinidade 20. Além disso, demonstrámos que a falta de HMGB1 aumentou o processamento mutagénico de ICLs TFO-HMGB1 dirigidos e identificado como uma reparação de excisão de nucleótidos (ILM) de co-factor de 23,24. Recentemente, verificou-se que está associado com HMGB1 ICLs TFO-dirigidas em células humanas e o seu recrutamento de tais lesões é dependente da proteína NER, XPA 16. Superenrolamento negativo do ADN tem mostrado promover a remoção eficiente das lesões do ADN por NER 25, e verificou-se que a HMGB1 induz superenrolamento negativo preferencialmente em TFO dirigidos Plas-ICL contendomeados substratos (em relação a substratos não danificado, plasmídeos) 16, proporcionando uma melhor compreensão do papel potencial (s) de HMGB1 como um co-factor NER. O processamento de ICLs não é totalmente compreendido, em células humanas; Assim, as técnicas e ensaios desenvolvidos com base em ferramentas moleculares aqui descritos podem levar à identificação de proteínas adicionais envolvidos na reparação de ICL, que por sua vez podem servir como alvos farmacológicos que podem ser exploradas para melhorar a eficácia dos regimes de quimioterapia do cancro.
Aqui, uma abordagem eficaz para avaliar a eficiência de formação de TFO-dirigida ICL em DNA de plasmídeo por electroforese em gel desnaturante de agarose foi discutido. Além disso, utilizando os plasmídeos que contêm os ICLs TFO-dirigidas, técnicas para determinar a associação de HMGB1 com os plasmídeos de ICL-danificados num contexto celular utilizando ensaios ChIP modificados foram descritos. Além disso, um método fácil para estudar as modificações introduzidas por Th topológicose HMGB1 proteína de arquitectura, especificamente sobre substratos plasmídeo ICL-danificadas em lisados de células humanas foi determinada realizando ensaios de super-enrolamento através de electroforese em gel de agarose bidimensional. As técnicas descritas podem ser usadas para ajudar a compreender o envolvimento da reparação do ADN e proteínas de arquitectura no tratamento de danos no ADN alvo em plasmídeos em células humanas.
Descrevemos protocolos pormenorizados para a formação de ICLs psoraleno específicas do local dirigidas no TFO-DNA do plasmídeo e subsequente ChIP plasmídeo super-enrolamento e ensaios para identificar proteínas que se associam com as lesões, e proteínas que alteram a topologia do ADN, respectivamente. Estes ensaios podem ser modificados para realizar com outros agentes prejudiciais de ADN, TFO, substratos de plasmídeos, e as linhas de células de mamífero de interesse. Na verdade, temos mostrado que há pelo menos um potencial de afinidade única e alta local TFO de ligação dentro de cada gene anotada no genoma humano 26. Comocada vez, para maior clareza, que estas técnicas descritas para a utilização específica de um TFO psoraleno-conjugado (pAG30) num plasmídeo repórter-mutação específica (pSupFG1) em células humanas U2OS que temos utilizado em Mukherjee & Vasquez, 2016 16.
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Protocol
1. Preparação de ICLs TFO-dirigidas no plasmídeo Substratos
- Incubar quantidades equimolares de pSupFG1 10,11 plasmídeo de DNA (DNA de plasmídeo de 5 ug é um bom ponto de partida) com psoraleno-AG30 conjugado TFO em 8 mL de tampão de ligação triplex [50% de glicerol, Tris 10 mM (pH 7,6), 10 mM de MgCl 2] e dH 2 o para um volume final de 40 ul num tubo de âmbar. Misture bem, pipetando para cima e para baixo. Incubar a reacção a 37 ° C banho de água durante 12 h.
- Aquecer a lâmpada UVA para garantir a saída de potência total. Coloque a reação triplex em filme de parafina, e coloque o filme de parafina no gelo sob a (nM 365) lâmpada UVA. Colocar um filtro de Mylar entre a lâmpada e a reação.
- UVA irradiar para uma dose total de 1,8 J / cm 2. Armazenar as amostras a 4 ° C para posterior utilização.
Cuidado: Usar óculos de protecção adequado e roupas com irradiação UVA. - Linearizar 200 ng do plasmídeo preparado acima com a restriction enzima Eco R1 em um volume total de 20 ul usando tampão fornecido pelo fabricante de 10x. Calor desnaturar a enzima durante 20 min a 65 ° C. Rodar as amostras durante 10 min a 10000 xg e armazenar a 4 ° C.
- Prepare 50x tampão alcalino [1,5 M de NaOH, 50 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)]. Adicionar 0,5 mg de agarose com 50 ml de dH 2 O. Ebulição para dissolver a agarose e colocá-lo em um banho de água a 50 ° C.
- Depois de a temperatura da agarose é dissolvido até 50 ° C, adicionar 1 ml de tampão 50x alcalina, e misturá-lo em seguida, verter o gel em placa de gel. Permitir que o tempo para o gel solidificar à temperatura ambiente antes de usar.
- Adicionar 4 ul de EDTA 0,5 M para os 20 ul de amostra de ADN linearizado e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar tampão de carregamento de gel alcalino 6x (NaOH a 300 mM, EDTA 6 mM, 18% (w / v) de polissacárido de elevado peso molecular, 0,06% de verde de bromocresol em dH2O) para as amostras e para uma escada de DNA de 1 kb.
NOTA: É importante usar tampão de carregamento de gel alcalino 6x, por favor veja a discussão. - amostras carregar no gel na câmara fria e executado durante a noite em tampão alcalino 1x (12-16 h) em 3,2 volts por cm. Depois de as amostras terem entrado no gel, colocar uma placa de vidro no topo do gel para evitar que ele flutua.
- Neutraliza-se a amostras embebendo o gel em tampão de neutralização [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 1,5 M, acetato de sódio 3 M (pH 5,2)] durante 45 minutos à temperatura ambiente.
- Corar o gel para o ADN com 4 ul de 1% de brometo de etídio (EtBr) em 50 ml de água durante 1 h à temperatura ambiente. Destain com água durante 15 min. Visualizar o DNA utilizando um sistema de imagem.
Cuidado: EtBr é um potente agente mutagénico e pode ser absorvida através da pele. Evitar o contacto directo com EtBr.
2. Transfecção e imunoprecipitação de TFO dirigidos ICL-contendo plasmídeos em células humanas
- Placa de 400.000 células de mamífero (por exemplo, S U2OScélulas steosarcoma) por milímetro prato 60 em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) sem antibióticos 24 h antes da transfecção. Incubar as células durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Antes da transfecção, o meio de crescimento quente e salino tamponado com fosfato (PBS) a 37 ° C num banho de água. Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente.
- Incubar 30 ul de reagente de transfecção com 500 ul de meio de crescimento 1x (mix 1) e 2 ug de TFO dirigidos ICL contendo plasmídeos em 500 ul de 1x meio de crescimento (mistura 2), em separado 14 mL de tubos de fundo redondo durante 10 min a temperatura do quarto.
- Adicionar mix 1 para misturar 2, misture bem por pipetagem cima e para baixo. Incubar durante 25-30 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as células duas vezes com PBS quente. Adicionar a mistura de transfecção de uma forma gota a gota, distribuindo uniformemente por toda a placa de células. Adicionar 1 ml de meio de crescimento para a placa e levar o volume final de 2 ml. misture nósll. Colocar as placas de cultura na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4 horas.
- Substituir os meios de comunicação com os meios 3 mL de crescimento suplementado com 10% de FBS, e incubar ainda mais durante 16 horas. Não use antibióticos.
- Tratar as células com 80 uL de 37% de formaldeído por placa fresca para uma concentração final de aproximadamente 1% e incubar durante 10 min à temperatura ambiente na ausência de luz.
Atenção: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. exposição ao formaldeído pode causar danos à pele, olhos e trato respiratório. - Extingue-se a reticulação de formaldeído por adição de 300 ul de glicina arrefecida (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) por placa e incubar durante 5 min. Remover os meios e lava-se duas vezes com PBS arrefecido, e em seguida, recolher as células por raspagem em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) em PBS num tubo de microcentrífuga. Manter as amostras em gelo em todos os momentos.
- Prepare os sedimentos celulares por centrifugação a 4 ° C durante 5 minutos, umat 13.400 xg utilizando uma mesa refrigerada centrífuga. Pipete para fora o sobrenadante e colocar o agregado de células em gelo.
- Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) de tampão A (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min. Misture ocasionalmente invertendo o tubo. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima).
- Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) Tampão B (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min, com mistura ocasional por inversão. células por centrifugação como anteriormente (veja o passo 2.9 acima).
- Ressuspender as células de novo em 200 ul de tampão B. refrigeradas Adicionar 2 mL de Micrococo nuclease (MNase) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Misture reacção, ocasionalmente, sacudindo o tubo. Parar a reacção de MNase colocando o tubo em gelo e adicionando EDTA 40 mM. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima).
- Ressuspender as células em 100 immunopr cromatina ul 1xecipitation tampão (ChIP) tampão (fornecidos em kits disponíveis comercialmente), suplementado com um cocktail inibidor de protease.
- Colocar as células ressuspensas em um tubo de microcentrífuga de parede fina. Sonicar as amostras por flutuante-los no banho sonicador de água durante 20 segundos seguido por 20 segundos de incubação sobre gelo. Repita os passos sonicação 9 vezes para gerar ~ 800-1200 fragmentos pb.
- A 20 ul das amostras sonicadas adicionar 3 mL de NaCl 5 M e 1 ul de ARNase A: misturar bem por agitação em vórtex e incubar a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, adiciona-se 2 ul de proteinase K e incubar durante 2 horas a 65 ° C. Purifica-se as amostras utilizando um kit de purificação de PCR. Executar amostras em 1% de gel de agarose e visualização com EtBr.
NOTA: A intensidade máxima do DNA resultante deve ser igual ou abaixo de 1.000 pb.
- A 20 ul das amostras sonicadas adicionar 3 mL de NaCl 5 M e 1 ul de ARNase A: misturar bem por agitação em vórtex e incubar a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, adiciona-se 2 ul de proteinase K e incubar durante 2 horas a 65 ° C. Purifica-se as amostras utilizando um kit de purificação de PCR. Executar amostras em 1% de gel de agarose e visualização com EtBr.
- Em três tubos separados, adicionar 30 ul de lisado num tubo siliconizado pré-refrigerada e, em seguida, adicionar 70 ul de tampão 1x ChIP gelada com inibidores da protease adicionada. Adicione 1 μg de anti-imunoglobulina G (IgG), anti-histona H3 (como um controlo positivo), ou anticorpos anti-HMGB1 para os respectivos tubos. Incubar durante a noite em uma sala fria com rotação contínua.
- grânulos Ressuspenda proteína G homogeneamente na sala fria. Adicione 4 mL de esferas de proteína G por tubo e incubar por mais 2-4 horas na sala fria com rotação.
- Usando uma cremalheira magnética, sedimentar as pérolas e remover o sobrenadante. Adicionar 200 ul de tampão 1x ChIP misturado com cocktail de inibidores de protease para o sedimento e lava-se durante 5 min na câmara fria com rotação. Repita duas vezes lavar.
- Execute uma lavagem adicional com elevado teor de sal tampão 1x chip (contendo NaCl 70 mM).
- Ressuspender as peletes com tampão de eluição de 160 ul (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar a 37 ° C com rotação durante 30 min.
- Sedimentar as pérolas e recolher o sobrenadante num tubo fresco. Adicionar 6 ul de NaCl 5 M e 2 ul de proteinase K, e incubar durante a noite a 65° C.
- Purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de produto de PCR e elui-se o ADN utilizando 50 uL de dH 2 O.
- Executar PCR 16 reações que utilizam conjuntos de primers para a região (s) de interesse, e resolver os produtos em um gel de agarose a 1% corado com EtBr.
3. supercoiling Ensaio e 2-dimensional Agarose Gel Eletroforese
- Preparar DNA de tampão de síntese de reparação (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; KCl 70 mM; mM de MgCl 7,4 2; DTT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 ^ M de dNTP, 3,4% de glicerol e 18 albumina de soro ug bovina) . Armazenar a -80 ° C. Thaw no gelo e antes da utilização adicionar fosfato 40 mM e 2,5 g de creatina fosfoquinase.
- Prepare 10x tampão supercoiling [Tris 500 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, MgCl 25 mM 2, EDTA 1 mM], e armazenar a temperatura ambiente.
- Linearizar 300 ng de ADN de plasmídeo super-enrolado pSupFG1 utilizando completamente um ul Vaccinia topoisomerase I (5-15 U / ul) com 1xtampão de super-enrolamento numa reacção de 10 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 1 h.
- Descongelar extrato livre de células HeLa 24 no gelo. Para os plasmídeos completamente relaxado, adicionar 25 ul extrato livre de células HeLa e tampão de síntese de reparação do ADN. Misture bem. Adicionar 1 ml adicionais de Vaccinia topoisomerase I à mistura, e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
- Terminar as reacções através da adição de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1% de concentração final) e proteinase K (0,25 mg / ml de concentração final). Incubar a 65 ° C durante 2 h.
- Transmitir um gel de agarose a 1% com 1x Tris Borato EDTA tampão (TBE). Adicionar ADN corante de carga e carregar as reacções directamente no gel, pelo menos, 4 pistas separadas. Executar o gel durante 8-10 h a 2 V / cm em TBE 1x (dimensão 1) à temperatura ambiente para resolver os topoisomers.
NOTA: Prepara-se uma solução de reserva 5x TBE em 1 L de dH2O, adicionando 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico e 20 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0). - Prepare 2 L de 1xTBE com 3 ug / ml de cloroquina-fosfato. Embeber o gel em 200 ml desta solução durante 20 min. Cubra a bandeja de gel com papel alumínio.
- Para o gel à electroforese na segunda dimensão, transformar o gel de 90 ° no sentido horário e executá-lo por 4-6 h a 2 V / cm em cloroquina contendo 1 x TBE para resolver os supercoils positivos e negativos.
- Manchar o gel com EtBr por 1 hora em uma cadeira de balanço. Destain o gel com dH 2 O durante 15 min e subsequentemente visualizar a distribuição térmica dos topoisomers usando um gerador de imagens.
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Representative Results
Formação do ICL TFO-dirigida é crítico para os ensaios de plasmídeo baseado, que são utilizados para interrogar as funções das proteínas de arquitectura do processamento de ICL, em células humanas. Electroforese em gel desnaturante de agarose é uma maneira fácil para determinar a eficiência da formação de ICL TFO-dirigida. Os plasmídeos que albergam ICLs TFO dirigidos migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose (Figura 1A, pista 3) quando comparados com os plasmídeos de controlo não-reticulados (Figura 1A, pista 2). Quantificação densitométrica das bandas nas pistas 2 e 3 (Figura 1A) revela aproximadamente 70% da população de plasmídeo migra através do gel com mobilidade retardada (identificado por uma seta preta), indicando-TFO dirigido formação ICL sobre esses plasmídeos.
Os ensaios de imunoprecipitação de cromatina realizados em extratos de U2OS humana células transfected com o plasmídeo de controlo (P) ou plasmídeos contendo ICLs TFO-dirigidos (P-ICL) mostra o enriquecimento de HMGB1 na região P-ICL em comparação com a região de controlo (P), quando imunoprecipitados com um anticorpo anti-HMGB1 (Figura 2 , painel de topo, as pistas 2 e 3). Estes resultados indicam que associados de HMGB1 com os ICLs em células humanas. Quando HMGB1 foi empobrecido a partir das células por meio do tratamento de siARN, o enriquecimento específico P-ICL-foi diminuída (Figura 2, painel superior, pistas 4 e 5), conforme esperado. Quando as mesmas amostras foram imunoprecipitados utilizando um anticorpo anti-IgG como controlo da especificidade do anticorpo, sem amplificação de PCR foi detectado, como esperado (Figura 2, painel superior, as pistas 6-10). Lanes 10-14 (painel superior) na Figura 2 foram amostras de entrada utilizados para a normalização. O painel superior mostra a amplificação por PCR pelos iniciadores perto do local de ICL TFO-dirigida e o painel inferior mostra a amplificação PCR de iniciadores quando distais ao TFO-dirigidasite de ICL foram utilizados.
HMGB1 é uma proteína de arquitectura, que se liga a ADN distorcido com afinidade mais elevada do que se liga ao ADN não danificado. Os ensaios de ADN super-enrolamento resolvidos através de electroforese em gel de agarose bidimensional demonstrar modificação arquitectura dos plasmídeos contendo ICL-TFO-dirigidos (P-ICl), em comparação com os plasmídeos controlo (P) por HMGB1 em extractos de células HeLa (Figura 3). A modificação arquitetônica induzida por HMGB1 preferencialmente em substratos P-ICL contendo é detectado como aumento supercoiling negativo. plasmídeos super-enrolados migrar mais rápido através de géis de agarose em relação aos plasmídeos lineares ou relaxado. A distribuição dos topoisomers indica mais super-enrolamento dos P-ICLs comparação com P na presença de HMBG1 (Figura 3). DNA negativamente supercoiled é executado como arco canhoto na segunda dimensão na presença de cloroquina. O supercoiling induzida por HMGB1 na P-ICLparece consistir principalmente de topoisomers que formam um arco com a mão esquerda (~ 14 foram identificados topoisomers no ICL TFO-dirigida contendo plasmídeos em comparação com ~ 7 topoisomers a partir do plasmídeo de controlo), indicando a formação de supercoils negativos. No seu conjunto, estes dados sugerem que os plasmídeos com ICLs TFO-dirigida pode ser utilizada como uma ferramenta para o estudo da associação de elevada afinidade da proteína HMGB1 arquitectónico com lesões do ADN, em células humanas por meio de ensaios de imunoprecipitação de cromatina. Além disso, as modificações arquitectónicos específicos dos substratos da P-ICL por HMGB1 também pode ser estudado utilizando ensaios de super-enrolamento e géis de agarose bidimensionais.
Figura 1: Ensaio de electroforese em gel de agarose alcalina para quantificar TFO-dirigida eficiência formação ICL sobre a pSupFG1 plasmídeo (A) Pista escada de DNA de 1, 1 kb;. pista 2, PLasmid pSupFG1 (P) utilizado como um controlo; e faixa 3, TFO-dirigida ICL contendo pSupFG1 (P-ICL). Os plasmídeos que albergam ICLs migram mais lentamente no gel como demonstrado na pista 3 (indicado pela seta preta sobre o lado direito do gel). (B) quantificação densitométrica das bandas na pista 2 e pista 3 indicam que aproximadamente 70% dos plasmídeos são reticulados. Este valor foi modificado a partir de referência 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o enriquecimento ChIP ensaio demonstra de HMGB1 no TFO-dirigida ICL região contendo o plasmídeo de ligações cruzadas (A). A amplificação por PCR dos fragmentos imunoprecipitadas foram resolved num gel de agarose a 1% utilizando um conjunto de iniciadores proximal perto do local TFO-dirigida ICL (B; P1 e P2, painel superior) e um segundo conjunto de iniciadores utilizados como controlo da especificidade, que eram ainda mais (aproximadamente 2000 pb) a partir de o ICL dirigida ao local (B; P3 e P4, painel inferior). As pistas 2 e 3 indicam o enriquecimento de HMGB1 perto do ICL TFO-dirigida (pista 3) em relação ao ADN danificado (pista 2). Lanes 4 e 5 são controles especificidade do anticorpo utilizando um anticorpo IgG. Lanes 6 e 7 são as amostras de entrada. Pista 8 um controlo negativo para a reacção de PCR e não contém nenhuma matriz de ADN. P, pSupFG1 plasmídeo. P-ICL, TFO-dirigida ICL contendo pSupFG1 plasmídeo. Este valor foi modificado a partir de referência 16. (B) Um diagrama esquemático do plasmídeo pSupFG1 que mostra os locais de primers para P1 e P2, bem como P3 e P4. Por favor clique aqui para ver uma vers maioresion desta figura.
Figura 3: 2D electroforese em gel de agarose que mostra a formação de supercoils negativos em TFO dirigidos plasmídeos ICL-contendo, facilitada por HMGB1 O gel de agarose a 1 x TBE revela a distribuição térmica dos topoisomers gerados pelo plasmídeo sozinho (P) ou o psoraleno-reticulado. plasmídeo (P-ICL). A mobilidade das espécies super-enrolados é mais rápido em comparação com os plasmídeos relaxado. Cada banda representa um topoisomer que difere da banda inferior ou superior por uma ou mais menos superhelical sua vez, respectivamente. O arco com a mão esquerda representa supercoiled negativa (-ve) espécies eo arco destro representa supercoiled positivamente (+ ve) espécies. O psoraleno ICL contendo população plasmídeo (P-ICL) contém mais espécies do que os plasmídeos de controle (P) supercoiled. R, plasmídeos relaxado; S, plasmídeos super-enrolados; 1D,a primeira dimensão de electroforese em gel; 2D, a segunda dimensão de electroforese em gel. Este valor foi modificado a partir de 16 anos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A formação eficiente de ICLs TFO-dirigida é dependente de dois factores fundamentais: Em primeiro lugar, os componentes do tampão adequado (por exemplo, MgCl 2) e o tempo de incubação do TFO com o seu substrato de ADN alvo (dependente da afinidade de ligação do TFO ao seu alvo duplex, e as concentrações utilizadas); e segundo, a irradiação a dose apropriada de radiação UVA (365 nm) para formar reticulações de psoraleno eficientemente. formação de triplex ideal pode ser conseguido através da utilização de HPLC ou gel TFO purificadas. As impurezas que contaminam o TFO pode conduzir a produtos com ligações cruzadas não desejadas, o que pode complicar ainda mais o resultado experimental. Para aumentar a estabilidade do TFO covalentemente ligado a um 5'-psoraleno HMT, os TFO deve ser armazenado em alíquotas a -80 ° C, tal como múltiplos de congelação descongelação do TFO pode resultar na degradação dos oligonucleótidos. Após a formação do triplex para segmentar o psoraleno a um sítio específico (por exemplo, 5'-TA-3 'e 5'-AT-3' são a prépsoraleno rido reticulação sites), a formação de ICL psoraleno requer irradiação com UVA. Uma dose de 1,8 J / cm2 UVA é suficiente para a formação óptima do ICLs em plasmídeos in vitro. O tempo de exposição deve ser determinado usando um fotómetro. Dependendo da fonte de luz UVA, além de emissores de UV a 365 nm, a luz pode também emitem comprimentos de onda mais curtos, o que pode levar à formação de lesões do ADN involuntária em toda a espinha dorsal do ADN. Porque os TFO dirigidos plasmídeos ICL contendo serão utilizados para estudos relacionados com a reparação do ADN de um ICL em um local específico, tais fotoprodutos não intencionais podem confundir os resultados dos estudos de reparo do DNA. Por conseguinte, um filtro de Mylar deve ser utilizado para evitar a exposição das amostras a comprimentos de onda mais curtos. ICL formação bem sucedida depende também da estabilidade da estrutura do triplex durante a irradiação UVA. O tempo de irradiação com UV necessário depende da potência da fonte de UVA. No nosso caso, 20-30 minutos é necessária para gerar the desejada dose de UVA. Durante este tempo, o calor gerado pela luz pode causar a perda de água por evaporação a partir das amostras. Tal perda de água pode alterar a concentração de tampão e pode causar destabilização das estruturas triplex. Colocar as reacções em gelo durante a irradiação UVA vai ajudar a evitar a evaporação das amostras.
A fim de determinar a eficiência da formação de reticulação psoraleno sobre os substratos de plasmídeo, as amostras foram resolvidas em géis de 1% de agarose alcalinos (Figura 1). A maioria dos protocolos de electroforese em gel alcalino sugerem um 2x alcalina corante de carregamento de gel, embora alguns protocolos sugerem que corante de carga alcalina não é necessária, como a condição de tampão de desnaturação do gel seja suficiente para desnaturar as amostras. Enquanto um corante 2x funciona bem com amostras de DNA concentrados, este protocolo requer o carregamento de um volume de amostra grande. Portanto, usar um corante de carregamento de gel alcalino 6x. Para assegurar desnaturação adequada do psoraleno reticulado plsubstratos asmid, incubar as amostras em tampão de carregamento de 10 min à temperatura ambiente. Além disso, pode formar Mg2 + Mg (OH) 2 sob condições alcalinas, que aprisiona o ADN e que pode causar a precipitar. O tampão de reacção de formação de triplex contém Mg 2+, e por isso é importante para incubar as amostras com EDTA para garantir que o Mg 2+ é quelado antes da adição do corante de carga alcalina para as amostras. Após electroforese, é importante para neutralizar o gel, como EtBr não se intercalam com o DNA sob condições alcalinas.
Uma abordagem alternativa para avaliar a eficiência da formação de reticulação TFO-dirigida é a utilização de electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, mas esta técnica é mais trabalhoso, e requer a digestão de restrição dos plasmídeos, seguido de rotulagem isótopo radioactivo dos fragmentos. Esta abordagem actual demonstra um método relativamente simples, mas eficaz para determine a eficiência da formação de ICL-TFO dirigido em substratos de plasmídeo. No entanto, esta técnica pode ser aplicada para avaliar a formação de ICLs por outros agentes de reticulação formador bem.
resultado positivo do ensaio plasmídeo ChIP depende de um número de factores. Os passos críticos dentro das sugestões de protocolo e de resolução de problemas são discutidos aqui. passos críticos envolvidos neste ensaio, incluem reticulação de formaldeído, a digestão de nuclease microcócica, sonicação, lavagens de amostra, e a reversão das ligações cruzadas de proteína-ADN nas amostras de formaldeído. Por reticulação de ADN-proteína eficaz, é importante o uso de formaldeído fresco. garrafas de estoque de 37% de formaldeído não deve ser usado por mais de seis meses após a abertura, como a exposição à luz e oxigênio degrada formaldeído. Portanto, é também benéfico para efectuar a reticulação, sem formaldeído luz no capuz de cultura de células. Outro passo importante é nuclease Micrococo (MNase) digestioN das amostras. MNase digestão não só cliva o ADN genómico em fragmentos menores, mas também remove todos os plasmídeos remanescentes que não foram entregues nas células durante o método de transfecção, o que pode reduzir drasticamente o fundo. O tempo de incubação de MNase digestão deve ser determinada empiricamente. Mais digestão pode resultar em perda de amostra, enquanto que períodos de incubação mais curtos podem levar à remoção ineficiente de DNA indesejado. Excelentes resultados podem ser observados após 10 min de incubação à temperatura ambiente com mistura ocasional das reacções por inversão dos tubos. Para imunoprecipitação eficiente, o DNA deve ser fragmentado com tamanhos entre 800-1200 pb. Tal fragmentação de ADN pode ser conseguido por sonicação completa das amostras. sonicação eficiente de amostras pode ser conseguida pelo re-suspender as pelotas em tubos de PCR de paredes finas e subsequentemente colocá-las num banho de água sonicador. pulsos sónicos são mais eficazes em comparação com sonicação contínua. em additião, é importante colocar as amostras em gelo entre os pulsos para impedir a degradação da proteína, e também é importante para completar o tampão 1x chip com inibidores de protease, como proteínas estáveis são necessários para o reconhecimento do anticorpo e subsequentes passos de precipitação. No entanto, durante o processo de imunoprecipitação, devido à natureza hidrofóbica das esferas magnéticas, DNA não-específico vai ser puxada para baixo. Para reduzir os sinais a partir de tais modelos não-específicas, a lavagem rigorosa é absolutamente necessário. Por último, a reversão adequada das ligações cruzadas de proteína-ADN das amostras é necessário para a amplificação de PCR dos modelos de imunoprecipitadas. Para obter resultados óptimos, as amostras devem ser incubadas durante pelo menos 12 h com SDS e proteinase K. Há benefícios da utilização de um ensaio baseado em plasmídeo ChIP sobre ensaios ChIP genómicos. Por exemplo, danos no ADN alvo pode ser facilmente conseguida utilizando um substrato de ADN de plasmídeo e um TFO, em comparação com a formação da lesão TFO-alvo num locus genómico. a ummontagem do substrato pode também ser controlada para modular a intensidade dos sinais quando se usa um plasmídeo danificado TFO-alvo. Além disso, tais substratos podem ser utilizados em qualquer linha de células de escolha e testados quanto à associação com várias proteínas candidatas, alargando assim o âmbito de estudos de processamento e de reparação de ICLs.
O ensaio de super-enrolamento é baseado na diferença entre a forma linear e ADN de plasmídeo super-enrolado. plasmídeos de ADN super-enrolado são mais compactos e mais rápido migram através da matriz de gel em comparação com os plasmídeos relaxado. Os passos críticos dentro das sugestões de protocolo e de resolução de problemas são discutidos aqui. Porque as proteínas arquitectónicas facilitar modificações topológicas em substratos de DNA danificadas, medidos através da indução de supercoiling dos plasmídeos relaxado, é fundamental para relaxar completamente os plasmídeos com a topoisomerase I. É necessário examinar a extensão de relaxamento DNA causado por topoisomerase I através de gel de agarose electroforese.O MgCl2 presente no tampão de super-enrolamento ao longo do tempo podem precipitar, e a presença de MgCl2 afecta a distribuição térmica dos supercoils positivos e negativos, facilitando a formação de supercoils positivos. Por conseguinte, é benéfico adicionar MgCl2 separadamente à mistura ou preparar tampão fresco cada vez. Para separar os topoisomers das populações de plasmídeo, é importante efectuar a electroforese em gel a uma tensão muito baixa (~ 2 V / cm), de modo que a migração do ADN é predominantemente com base na estrutura / forma das moléculas. Se o relaxamento dos plasmídeos por topoisomerase I não está completa, então o tempo de incubação e / ou a quantidade de enzima utilizada deve ser aumentada. relaxamento completo deve ser assegurada antes de passar para a etapa de DNA supercoiling posterior porque o uso do ensaio supercoiling com plasmídeos incompleta relaxado pode levar a erros de interpretação dos dados e os resultados podem ser difíceis de replicar. Uma vez complete relaxamento foi alcançado, o ensaio de super-enrolamento é relativamente fácil de realizar. Um componente importante do presente ensaio é o uso de um tampão de síntese de reparação do ADN. O fosfato de creatina fosfoquinase e são obrigados a ser adicionado à mistura de cada vez para gerar ATP. Após a etapa de super-enrolamento, é importante remover as proteínas a partir de DNA de plasmídeo por incubação com SDS e proteinase K. SDS auxilia na distinção entre as proteínas a partir do ADN e proteinase K degrada a proteína, o que deixa o ADN intacto com vários níveis de superenrolamento . Se a proteína não é completamente removido, a distribuição térmica dos topoisomers não será claramente visível. O ADN não pode ser purificado por extracção com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e precipitada com etanol, porque este método (e outros) pode cortar a ADN, resultando na perda de super-enrolamento. Outro passo importante é a adição de cloroquina para a memória intermédia. A cloroquina é um agente de intercalação e desenrola o ADN. sobreintercalação, ele relaxa o ADN super-enrolado negativamente super-enrolamento e introduz positivos para ADN relaxado que facilita a separação dos topoisomers contendo uma elevada densidade de super-enrolamento. Assim supercoils positivos e negativos podem ser diferenciadas. Esta é, em geral uma experiência fácil e é altamente reprodutível quando todos os pontos acima são considerados.
No entanto, se não super-enrolamento é óbvio, em seguida, é necessário determinar a actividade da proteína de interesse. O ensaio supercoiling 2D foi usado para estudar modificações topológicas é facilitado pelas proteínas arquitectónicos 27. Este ensaio tem sido usado aqui no contexto de ADN de processamento de danos ICLs TFO-dirigidas em células humanas. HMGB1 liga-se a ICLs TFO-dirigidas com elevada afinidade e especificidade, tal como anteriormente demonstrado através de gel in vitro ensaios electroforéticos mobilidade-de deslocamento 20 e em células humanas utilizando o ensaio descrito plasmídeo ChIP dentro 16. Aqui, ucantar o ensaio de superenrolamento 2D foi demonstrado que ao se ligar aos ICLs TFO-dirigidas em HeLa extractos livres de células, auxilia HMGB1 na formação de super-enrolamento negativo sobre os substratos (Figura 3), que pode ser um passo importante na reparação de da lesão, por super-enrolamento negativo é conhecida por facilitar a remoção de lesões do ADN através da via de NER 25. Existem muitas proteínas de arquitectura que têm sido implicados no processamento de danos no ADN que poderiam ser estudados utilizando este ensaio. Esta abordagem está limitado a estudos in vitro, no entanto, é um ensaio simples e útil para interrogar a relação estrutura-função das proteínas de arquitectura no contexto da reparação de danos do ADN. No entanto, o protocolo de chip pode ser facilmente modificado para estudar as interacções ADN-proteína, no contexto do genoma, ao avaliar os efeitos sobre a super-enrolamento do ADN por interacções tais pode revelar-se bastante difícil. Nós e outros grupos têm, na verdade pEstudos baseados em triplex erformed 1), através de transfecção estável de DNA do plasmídeo no genoma fevereiro 28-30) por alvo um local genómico 31-33 e 3) através da incorporação do TFO modificado com psoraleno (e radiação UVA) para as células após a transfecção do plasmídeo 10.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório de Vasquez para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de / Instituto de Saúde Nacional do Câncer [CA097175, CA093279 a KMV]; ea Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas [RP101501]. O financiamento para taxa de acesso aberto: Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer [CA093279 a KMV].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
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