Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolasjon, transfection og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter.
Abstract
Ex vivo kultur av voksne pattedyr kardiomyocytter (CMs) presenterer det mest relevante eksperimentelle systemet for in vitro studiet av hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differensierte celler med minimal proliferativ kapasitet. Den post-mitotiske tilstanden til voksne CMs begrenser ikke bare kardiomyocyte celle syklus progresjon, men begrenser også den effektive kulturen av CMs. Videre er den langsiktige kulturen i voksne CMs nødvendig for mange studier, for eksempel CM spredning og analyse av genuttrykk.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyrene som skal brukes til kardiomyocyteisolering. Mens den langsiktige kulturen av rotte CMs er mulig, er voksne mus CMs utsatt for døden og kan ikke dyrkes mer enn fem dager under normale forhold. Derfor er det et kritisk behov for å optimalisere celleisolasjonen og den langsiktige kulturprotokollen for voksne murine CMs. Med denne modifiserte protokollen er det mulig å isolere og kultur både voksne mus- og rotte-CMs i mer enn 20 dager. Videre er siRNA transfection effektiviteten av isolert CM betydelig økt sammenlignet med tidligere rapporter. For voksen mus CM isolasjon benyttes Langendorff perfusjonsmetoden med en optimal enzymløsning og tilstrekkelig tid for fullstendig ekstracellulær matrisedissosiasjon. For å oppnå rene ventrikulære CMs, ble begge atria dissekert og forkastet før de fortsatte med disassociation og plating. Cellene ble spredt på en lamininbelagt plate, noe som tillot effektiv og rask feste. CMs fikk lov til å bosette seg for 4-6 h før siRNA transfection. Kulturmedier ble oppdatert hver 24 timer i 20 dager, og deretter ble CMs fikset og farget for hjertespesifikke markører som Troponin og markører for cellesyklus som KI67.
Introduction
Hjertesykdommer er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Nesten alle typer hjerteskader resulterer i et betydelig tap av voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyrhjerter er ikke i stand til å reparere hjerteskaden på grunn av den senescent naturen til den voksne CM1. Dermed resulterer enhver fornærmelse mot det voksne pattedyrhjertet i et permanent tap av CMs, noe som fører til redusert hjertefunksjon og hjertesvikt. I motsetning til voksne pattedyr, kan små dyr som sebrafisk og newt hjerter regenerere hjerteskaden gjennom eksisterende CM-spredning2,,3,,4. En verdensomspennende innsats pågår for å finne en ny terapeutisk intervensjon for hjerteskade via både proliferative og ikke-proliferative tilnærminger. I de siste tiårene har ulike typer genetiske musemodeller blitt utviklet for å studere hjerteskade og reparasjon. Men ved hjelp av in vivo dyremodeller fortsetter å være en dyr tilnærming med den ekstra kompleksiteten for å tyde en celle-autonom mekanisme fra sekundære effekter. Dessuten er in vivo-systemer utfordrende å analysere CM-spesifikke effekter av en farmakologisk intervensjon som induserer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Videre er den langsiktige kulturen av voksne CMs nødvendig for å utføre CM spredningsanalyser. CM spredningsanalyser krever minst 4-5 dager for celler som skal induseres i cellesyklusen og for å få nøyaktige data etter det. I tillegg er studier som benytter isolerte CMs for elektrofysiologiske studier, legemiddelscreening, toksisitetsstudier og Ca++ homeostasestudier alle behov for et forbedret kultursystem5,,6,,7. Videre viser nyere studier kardiobeskyttende betydning av cytokiner utskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For å undersøke den terapeutiske rollen og molekylære mekanismen til disse kardiokinene under hjertereparasjon og regenerering, er det nødvendig med en langvarig kultur.
Voksen rotte CMs er robust nok for encellede isolasjon og langsiktig kultur i et in vitro system10,11,12. Imidlertid er voksne mus CMs av stor interesse for in vitro-analyser, på grunn av tilgjengeligheten av en rekke genmodifiserte musemodeller, noe som gjør det mulig å designe og utføre ulike innovative analyser som ikke er mulige med rotte CM13. I motsetning til voksen rotte CM isolasjon, er det ganske utfordrende å få en encellede suspensjon fra voksne musehjerter, og den langsiktige kulturen av voksne mus CMs i kultur er enda mer utfordrende.
Voksen CM isolasjon fra mus og rotte hjerter ved hjelp av en Langendorff system har tidligere blitt etablert for å studere CMfunksjon 5,14,15. Her har vi beskrevet i detalj protokollene for voksen CM-isolasjon fra både rotter og mus, samt en modifisert langsiktig kultur, transinfeksjon og CM-spredning av isolerte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter bør utføres i samsvar med retningslinjene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr publisert av U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokollene som vises i videoen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Forberedelse før hjerteutvinning fra voksne mus (og rotter)
- Forbered den tilsvarende perfusjonen, enzymet og stoppløsningene, i henhold til oppskriftene gitt i henholdsvis tabell 1 og tabell 2, for henholdsvis rotte- og museisolering. Filtrer løsningene gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne kontaminering eller uløste partikler.
- Rengjør og steriliser de kirurgiske instrumentene ved å slikke dem i 70% alkohol i 15 min, og vask deretter med dobbelt destillert vann. La verktøyene lufttørke på et rent papirhåndkle.
- Forvarm vannbadet til 37 ºC. Kontroller vannstanden i vannbadet for å sikre en uavbrutt sirkulasjon av varmt vann gjennom perfusjonsapparatet under prosedyren.
- Rengjør perfusjonsapparatet ved å løpe med 70 % alkohol i 5 min. Gjenta.
MERK: Øk strømningshastigheten, noe som bidrar til å rengjøre slangen. - Etter alkoholstrømmengjennom, rengjør restene av alkohol ved å kjøre dobbelt destillert vann i 10 minutter.
- Sett opp 3 mellomstore engangspolystyren veie retter for å rense hjertet etter eksisjon. Fyll oppvasken med 20 ml myocytebuffer.
- Tilsett 2-3 dråper heparin til hver tallerken ved hjelp av Pasteur pipette og bland godt ved å pipetter flere ganger.
- Ta en 10 ml sprøyte med en stump kanyle kanyle.
MERK: En stump nålekanyle kan tilberedes ved å kutte spissen på en ren, steril nål. En 21 G kanyle og 14 G kanyle ble brukt til å lage kanylen for henholdsvis mus og rotte. - Fyll sprøyten med perfusjonsbuffer (tabell 1). Fjern eventuelle luftbobler fra sprøyten og legg den i tredje rett i vinklet stilling. Fest den med tape.
MERK: For rotter ble løsning A (tabell 2) brukt i stedet for myocyttperfusjonsbuffer. - Forbered en løs knute med en kirurgisk sutur og plasser den rundt nålen.
- Injiser musen med heparin (100 USP enheter/mus) ved intraperitoneal injeksjon, 20 min før anestesi injeksjon.
- Sirkuler myocyttperfusjonsbufferen (tabell 1) gjennom perfusjonsapparatet. Reduser strømningshastigheten til 3 ml/min.
MERK: For rotter ble løsning A (tabell 2) brukt i stedet for myocyttperfusjonsbuffer. - Etter 5 min erstatter du perfusjonsbufferen med enzymoppløsningen (tabell 1). Metter enzymløsningen med oksygen under prosessen. Bruk en strømningshastighet på 3 ml/min.
MERK: For rotte CM isolasjon, bruk oppløsning E (tabell 2) i stedet. - Bedøve musen ved intraperitoneal injeksjon av anestesi. Bruk riktig dose anestesi, anbefalt av IACUC, for terminalkirurgi.
- Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi ved mangel på respons på en tåklem. Deretter legger du musen på den kirurgiske plattformen.
2. Ekstraksjon av hjerte fra voksne mus (og rotter)
- Steriliser huden ved å tørke med 70% alkohol.
- Åpne forsiktig brystet.
- Avgiftsdirektoratet hjertet. Unngå ikke-hjerte vev under eksisjon.
- Sett hjertet på den første parabolen, fylt med perfusjonsbuffer (tabell 1).
MERK: Bruk oppløsning A for rotte (tabell 2). - Fjern blodet fra hjertet ved å klemme forsiktig.
- Overfør hjertet til den andre parabolen.
- Rengjør blodet fra hjertet og fjern ikke-hjertevev. Deretter overfører du hjertet til den tredje parabolen.
- Trim av lunger og annet omkringliggende vev og kanylere via stigende aorta. Denne prosedyren bør utføres så raskt som mulig (<5 min) for å forbedre CM-kvalitet og kvantitet.
3. Fordøyelsen av hjertet
- Fordøyelsen av musehjertet
MERK: Alle løsninger/buffere som sirkulerer gjennom musehjertet, skal oksygeneres gjennom hele prosedyren.- Fjern kanylen forsiktig fra sprøyten og koble den til Langendorff-perfusjonsapparatet.
- Unngå luftbobler som går inn i hjertet, noe som kan påvirke gjennomstrømningen av enzymoppløsningen og fordøyelsen.
- Flytt vannjakken opp for å gi et homogent miljø til hjertet. La enzymoppløsningen strømme gjennom hjertet med en hastighet på 2-3 ml/min.
MERK: Hastigheten på pasningsløsningen er kritisk og har en betydelig innvirkning på utfallet av CM-kvantitet og kvalitet. - La enzymløsningen strømme gjennom hjertet i 2 min.
- Ved 2 min, tilsett 40 μL av 100 μM CaCl2 løsning til enzymoppløsningen og bland. La enzymløsningen passere gjennom hjertet i ytterligere 10-15 min.
MERK: Når strømmen blir jevn, blir hjertet brunaktig og mykt, noe som indikerer jevn fordeling av kollagenaseenzymet og riktig fordøyelse av hjertet.
- Fordøyelsen av rottehjertet
MERK: Alle løsninger/buffere som sirkulerer gjennom rottehjertet, skal oksygeneres gjennom hele prosedyren.- Fjern kanylen forsiktig fra sprøyten og koble den til Langendorff-perfusjonsapparatet.
- Unngå luftbobler som går inn i hjertet, noe som kan påvirke gjennomstrømningen av enzymoppløsningen og fordøyelsen.
- Flytt vannjakken opp for å gi et homogent miljø til hjertet.
- Start oppløsning A med en hastighet på 2-3 ml/min i 3-5 min for å fjerne blod fra hjertet.
MERK: Hastigheten på pasningsløsningen er kritisk og har en betydelig innvirkning på utfallet av CM-kvalitet. - Når blodet er fjernet fra hjertet, bytte fra løsning A til løsning E (Tabell 2). Titrer oppløsning E med CaCl2 som angitt nedenfor for en endelig konsentrasjon på 0,1 mM i oppløsning:
- Etter 10 min perfusjon, tilsett 12,5 μL på 0,1 M CaCl2.
- Etter 15 min perfusjon, tilsett 25 μL på 0,1 M CaCl2.
- La enzymløsningen passere gjennom hjertet i ytterligere 30-40 min, til strømmen blir rask og hjertet er smidig.
4. Utarbeidelse av CM encellede suspensjon
- Utarbeidelse av CM encellede suspensjon (mus)
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Flytt den til en 60 mm petriskål fylt med 5 ml enzymløsning og overfør fatet til en biosikkerhetshette.
MERK: Sørg for tilstrekkelig hjertefordøyelse før du fjerner hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Fordøyelsestiden avhenger av enzymaktiviteten, oppløsningsstrømmen og hjertets størrelse. - Utfør ytterligere mekanisk disaggregation i en biosikkerhetshette for å sikre sterilitet og unngå kontaminering.
- Fjern forsiktig atria (1/4th av basal hjertedelen) og ekstra fettvev.
- Hakke hjertet med tang i fine biter.
- Ta en steril Pasteur pipette og kutt spissen i en 45º vinkel.
- Bruk denne Pasteur pipetten til å dispensere hjertevevet i en encellede suspensjon ved mild pipettering. Optimal fordøyelse gir en suspensjon av encellede kardiomyocytter.
MERK: Fjern den smale, nederste delen av overføringsrøret for å redusere CM-skader på grunn av mekanisk svie. - Deretter legger du til 5 ml stoppløsning for å stoppe enzymaktiviteten, noe som unngår muligheten for overbesværelse.
- Ta en frisk 50 ml konisk og plasser en steril 100 μm cellesil på den.
- Pass kardiomyocytt suspensjon gjennom cellesilen for å fjerne vevsbiten. Vask petriskålen og silen med en annen 5 ml stoppløsning (tabell 1) for å samle eventuelle kardiomyocytter som forblir festet til silen.
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Flytt den til en 60 mm petriskål fylt med 5 ml enzymløsning og overfør fatet til en biosikkerhetshette.
- Fremstilling av CM encellede suspensjon (rotte)
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Flytt hjertet til en 100 mm petriskål fylt med 5 ml oppløsning A og flytt fatet til en biosikkerhetshette.
MERK: Sørg for tilstrekkelig hjertefordøyelse før du fjerner hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Fordøyelsestiden avhenger av enzymaktiviteten, oppløsningsstrømmen og størrelsen på hjertet. - Utfør ytterligere mekanisk disaggregation i en biosikkerhetshette for å sikre sterilitet og unngå kontaminering.
- Fjern forsiktig atria (1/4th av basal hjertedelen) og ekstra fettvev.
- Hakke hjertet med tang i fine biter.
- Ta en steril Pasteur pipette og kutt spissen i en 45º vinkel.
- Bruk denne Pasteur pipetten til å dispensere hjertevevet i encellede suspensjon ved mild pipettering. Optimal fordøyelse gir en suspensjon av encellede kardiomyocytter.
MERK: Fjern den smale, nederste delen av overføringsrøret for å redusere CM-skader på grunn av mekanisk svie. - Tilsett 5 ml oppløsning B (tabell 2) i CM-suspensjonen og før oppløsningen gjennom en 100 μm cellesil for å fjerne eventuelle gjenværende biter av fett eller annet ikke-fordøyd vev.
- Samle filtrat i et friskt 50 ml konisk hetteglass.
- Bruk ytterligere 5 ml oppløsning B til å vaske petriskålen og eventuell gjenværende CM gjennom cellesilen.
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusjonssystemet. Flytt hjertet til en 100 mm petriskål fylt med 5 ml oppløsning A og flytt fatet til en biosikkerhetshette.
5. Fjerning av ikke-minibanker
- Fjerning av ikke-CMs fra voksen encellede suspensjon (mus)
- Sentrifuger cellefjæringen ved 20 x g i 3 min.
- Kast de overnaturante og gjenoppusse cellene i 10 ml stoppoppløsning (tabell 1).
MERK: Hvis du øker konsentrasjonen av BSA i stoppløsningen, vil viskositeten øke viskositeten og redusere sedimenteringshastigheten til ikke-CMs. - Resuspend CMs ved mild inversjon av røret 3-5 ganger.
- Ved 3 min intervaller, tilsett 10 μL av 100 μM CaCl2 løsning og bland. Gjenta tre ganger.
- Etter fjerde tillegg sentrifuger kardiomyocytt suspensjon på 20 x g i 3 min.
- Kast det overnaturlige.
- Resuspend CMs i forvarmede (37 ºC), voksen mus CM plating media (Tabell 3).
- Fjerning av ikke-CMs fra voksen encellede suspensjoner (rotte)
- Pelletceller ved 20 x g i 3 min ved 25 ºC.
- Kast de overnaturante og gjenoppusst cellene i 25 ml oppløsning B (tabell 2).
- Bland cellene ved mild inversjon og legg den i et rørstativ slik at CM kan bosette seg under tyngdekraften.
- Kast forsiktig overnatanten.
- Resuspend cellene i frisk 25 ml oppløsning B og titrer den til 1,0 mM CaCl2 ved trinnvis tilsetning av 50 μL, 75 μL og 100 μL på 0,1 M CaCl2 ved 3-5 min intervaller.
MERK: En høyere konsentrasjon av BSA i løsning B kan brukes på dette trinnet. Å øke konsentrasjonen av BSA i løsning B øker viskositeten og reduserer dermed sedimenteringshastigheten til ikke-CMs. - Pelletceller ved 20 x g i 3 min ved 25 ºC, aspirerer det overnaturante, og legg til ønsket volum av voksne rottecellekulturmedier (Tabell 4).
- Frø-CMs på en lamininbelagt plate.
MERK: Pre-plating av CMs på en ikke-belagt kulturplate kan brukes til å minimere forurensning av ikke-CM-celler.
6. Voksen CM plating
- Pre-plating
- Resuspend cardiomyocytes i kulturmedier.
- Pre-plate cellene i en 60 mm eller 100 mm tallerken for mus eller rotte CM, henholdsvis.
- Inkuber cMs for 2 timer i en inkubator supplert med 5% CO2 ved 37 ºC.
- Under inkubasjonen før platen, belegge cellekulturplatene med laminin (10 μg/ml i PBS) for langsiktig CM-kultur.
- Etter 2 timer pre-plating, samle CMs i en 50 ml konisk hetteglass.
- Samle cellene fra parabolen og re-plate dem inn i en laminin belagt 24 godt kultur plate for transfection eksperimenter.
- Kulturceller i en inkubator ved 37 ºC supplert med 5 % med CO2. 4-6 timer er tilstrekkelig til å holde seg til kardiomyocytter med overflaten, og dermed kan transfection utføres 6 timer etter plating.
MERK: Platingmediet som inneholder FBS brukes ofte og viser bedre kompatibilitet med spredningsstudier. Et serumfritt medium kan imidlertid brukes til eksperimenter der sekretoriske faktorer analyseres.
7. Transinfeksjon
- Inkuber cMs til celle kulturplater belagt med laminin i 4-6 timer.
- Fire timer etter CM-såing på lamininbelagt plate, transfect celler med siRNAs (50 nM) av interesse ved hjelp av en transfection reagens (f.eks Lipofectamine RNAiMAX) i henhold til produsentens protokoll.
- Endre medier 24 timer etter transfeksjon og hver 24.
- Etter 20 dager, fikse celler med 4% PFA i PBS for nedstrøms applikasjoner, inkludert immunocytochemistry for hjertespesifikke markører som Troponin for å sikre levende kardiomyocytter ble vellykket dyrket langsiktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nåværende modifiserte protokollen muliggjør effektiv isolasjon og kultur av rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolasjon ble totalt 3 voksne (12 uker gamle) hann Fischer 344 rotter brukt i prosedyren. Figur 1 viser kirurgisk apparat og isolasjonsoppsett som kreves i prosedyren; hver del er merket og beskrevet i figurlegenden. Kollagnase type 2 ble brukt til fordøyelsen, noe som gir en høy mengde høykvalitets CMs fra vellykket isolasjon (Figur 2A). Tjuefire timer etter isolasjon ble disse cellene transfisert med cellesyklus som induserte spesifikke siRNAs mot Rb1 og Meis2,mens cel-miR-67 ble brukt som transfection kontroll iforsøket 11. CMs ble opprettholdt i kultur i enten syv dager (Figur 2B) eller opptil tjue dager (Figur 2C) for å observere de morfologiske endringene. For å score for cellesyklusaktivitet ble CMs fikset på dag 7 og farget for hjertespesifikk markør Troponin-I, mitotisk markør KI67, og kjernen ble visualisert gjennom DAPI (figur 2D-F). En signifikant økning i KI67 positive kardiomyocytter ble observert ved behandling med siRb1+siMeis2 sammenlignet med kontroll11. Videre ble rottekardiomyocytter slått (kontraktil funksjon) i kultur på dag syv post-plating, som er et kjennetegn på sunne kardiomyocytter11.
For CM-isolasjon hos mus ble totalt 3 hann- og 3 hunn voksen (12 uker gammel) C57BL/6 mus brukt i prosedyren. I likhet med rottestudien ble kollagase type 2 brukt til å fordøye kollagen og den ekstracellulære matrisen til det voksne mushjertet. Voksne mus CM er relativt skjøre for isolasjon og kultur in vitro; Dermed bruker denne protokollen blebbistatin for å forbedre levedyktigheten til den voksne musen CM. Vellykket isolasjon gir > 70-80% sunn stang form CMs, som kan dyrkes i opptil 20 dager (Figur 3A-C) og opprettholde sin hjerte Troponin-I farging og kontraktilitet (Figur 3C). I separate eksperimenter, fire timer etter isolasjon, ble mus-CMs transifisert med en cellesyklus som induserer siRNA-cocktail som beskrevet for rotte CM. Kort sagt ble mus CM samtidig transfisert med de spesifikke siRNAs mot Rb1 og Meis2, og kontroll (cel-miR-67). Etter transfeksjons-CMs var gjenstand for tidsforløpsavbildning i 10 dager som viste de morfologiske endringene (figur 4) som etterfølges av en spredningsanalyse (figur 5). På dag 10 ble immunfluoreserende farging for Troponin-I, KI67 og DAPI utført som tidligere beskrevet. En signifikant økning i KI67 positive kardiomyocytter ble observert ved behandling med siRb1+siMeis2 sammenlignet med kontroll (figur 5A-C).
Den nåværende protokollen viser at voksne rotter og mus CMs kan dyrkes langsiktig in vitro i opptil 20 dager og potensielt lenger. Etter 20 dager opprettholder CMs sin Troponin-I farging samt kontraktilitet hvis hemmerne fjernes fra media.
| Myocyte buffersammensetning, pH 7.4 (Klargjør og kan lagres ved 4 °C) | |||
| Reagent | Konsentrasjon, mM | Molekylær wt. | For 1 Liter |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| KCl (andre | 4.7 | 74.5513 | 350,3911 mg |
| MgSO4 (andre personer) | 1.2 | 120.366 | 144,4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81,6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| Perfusjonsbuffer, pH 7.4 (Klargjør frisk for hver isolasjon) | |||
| Konsentrasjon, mM | Molekylær wt. | Nødvendig beløp | |
| Myocyte buffer | 250 ml | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| 2,3-butanedione monoksimin | 10 | 101.105 | 252,775 mg |
| NaHCO3 Fersk | 1.6 | 84.007 | 33.6028 mg |
| Taurin Frisk | 30 | 125.15 | 938,625 mg |
| Glukose Fersk | 20 | 180.156 | 900,775 mg |
| Enzymløsning | |||
| Lager Conc. | Arbeider Conc. | Nødvendig | |
| Myocyte buffer | 50 ml | 50 ml | |
| Kollagenase type 2 | 330 E/mg | 620 E/ml | 93 mg |
| Protease XIV | >3,5 U/mg | 0.104 U/ml | 1,48 mg |
| DNase Jeg klasse 2 | 0,015 mg/ml | ||
| Stopp buffer A | |||
| Lager Conc. | Arbeider Conc. | Nødvendig | |
| Myocyte buffer | 30 ml | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 Leilighet | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Stopp buffer B | |||
| Lager Conc. | Arbeider Conc. | Nødvendig | |
| Myocyte buffer | 30 ml | ||
| Bsa | 5.00% | 1.5 g | |
| CaCl2 Leilighet | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tabell 1: Løsninger som kreves for voksen mus kardiomyocyte isolasjon.
| 10x KHB lagerløsning (Totalt volum = 1L) |
Reagent | Molaritet (mM) | Beløp (g) |
| Nacl | 1180 | 68.9 g | |
| KCl (andre | 48 | 3.5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 (andre personer) | 12.5 | 1.4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2.1 g | |
| Juster pH til 7,4 med 4 M NaOH (~20 ml), oppbevares ved 4 °C | |||
| KHB Løsning, 500 ml | Reagent | Beløpet | |
| 10x KHB | 50 ml | ||
| Glukose | 0.99 g | ||
| Taurine | 0.31 g | ||
| Legg H2O for å bringe volum til 500 ml, og pH skal være ~ 7,35 | |||
| Løsning A | Reagent | Beløpet | |
| KHB-løsning | 500 ml (10 mM) | ||
| BDM (andre) | 0,5 g | ||
| Oksygenat med 100 % O2 og varm til 37 °C | |||
| Løsning B, 50 ml | Reagent | Beløpet | |
| Løsning A | 50 ml | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Løsning E, 50ml | Reagent | Beløpet | |
| Løsning A | 50 ml | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Kollagenase type II (263 enheter/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Type I-S) | 10 mg | ||
| 0.1 M CaCl2 lager | 12,5 μL | ||
| Bland godt | |||
| CaCl2 Lager, 0.1M | Reagent | Beløpet | |
| CaCl2 Leilighet | 7,35 g | ||
| H2O | 500 ml | ||
| Oppbevares ved 4 °C | |||
Tabell 2: Løsninger som kreves for voksen rotte kardiomyocyte isolasjon.
| Plating media sammensetning, pH 7.4 | |||
| Konsentrasjon i arbeid | Molekylært Wt. | Nødvendig beløp | |
| Kulturmedier uten Blebbistatin | 50 ml | ||
| BDM (andre) | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| FBS Inn | 5% | 2.5 g | |
| Kulturmediesammensetning, pH 7.4 | |||
| Reagent | Konsentrasjon i arbeid | Molekylært Wt. | Nødvendig beløp |
| Dmem | 1. | 250 ml | |
| Insulin | 1 μg/ml | 0,25 mg | |
| Transferrin Innfør | 0,55 μg/ml | 0,138 mg | |
| Selen | 0,5 ng/ml | 0,125 μg | |
| Penicillin (U/ml)-streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595,753 mg |
| * FBS | 10% | 25 ml | |
| *BSA (andre | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1,8271 mg |
| * Bruk en av dem, i henhold til det eksperimentelle kravet. # Aliquot kultur media å forberede plating media før du legger Blebbistatin. MERK: Forbered 200 ml kulturmedier. MERK: Klargjør 50 ml plating media. |
|||
Tabell 3: Mediesammensetning for voksen mus kardiomyocyte plating og kultur.
| Kulturmediesammensetning, pH 7.4 | ||
| Reagent | Konsentrasjon i arbeid | Nødvendig beløp |
| Dmem | 1x (andre) | 250 ml |
| Penicillin (U/ml)-streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml |
| * FBS | 10% | 25 ml |
Tabell 4: Mediesammensetning for voksen rotte kardiomyocyte plating og kultur.
Figur 1: Prosedyreoppsett og utstyr. (I) Skjematisk representasjon av perfusjonen. (II) Kirurgiske instrumenter og kanylerylen. (III) Hjerteperfusjonsenhet: A) Varmejakke. B) Dobbel vegg vannjakke fartøy. C) Sirkulerende oppvarmet vanninntak. D) Sirkulerende oppvarmet vannuttak. E) Hjerteperfusjonsløsning. F) Sirkulerende pumpe G) Perfusjonsløsningsrør. H) Oksygentilførselsrør. I) Sirkulerende vannbad. J) Kanylerylen med hjertet, festet til perfusjonsutløpsporten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Voksen rotte CM isolasjon, transfection, og langsiktig kultur. A) Voksen rotte CM, umiddelbart etter isolasjon. B) Voksen rotte CM på dag 7 etter isolasjon. C) Voksen rotte CM på dag 20. D-F) KI67 positiv rotte CM på dag 7 etter siRb1 +siMeis2 transfection. Troponin-I = grønn; DAPI = blå; KI67 = rød. Alle eksperimentene ble utført i duplikat og gjentatt minst tre ganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Voksen mus CM isolasjon og langsiktig kultur. A) Voksne mus CM, umiddelbart etter isolasjon. B) Voksne mus CM på dag 7 etter isolasjon. C) Voksne mus CM farget med cardiac troponin-I = grønn på dag 20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Voksen mus CM de-differensiering. Voksne mus CM viser morfologiske endringer under langsiktig kultur (dag 0 til dag 10) i DMEM-HG media, supplert med 10% FBS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Voksen mus CM transfection og spredning. A-C) KI67 positiv mus CM på dag 10 etter siRb1 + siMeis2 transfection. Troponin-I = grønn; DAPI = blå; KI67 = rød. D) Bar graf viser en betydelig økning i KI67 positiv voksen mus CMs i siRNA-cocktail transfected gruppe versus kontroll. Resultatene presenteres som ±SEM; * = p-verdi ≤ 0,05. p-verdi ≤0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble utført i triplicate (n = 3 Mann,3 Kvinne). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er et kritisk behov for å etablere en protokoll for voksen kardiomyocyte isolasjon og langsiktig kultur for å utføre cellespesifikke mekanistiske studier. Det er bare noen få rapporter som diskuterer voksne CM isolasjonsprotokoller, og enda færre av dem brukes til langsiktig kultur av voksne mus CM15,16,17. Det er vist at den voksne rotte CM har en høyere toleranse for in vitro kultur enn de voksne musene CM10,11,12. I denne rapporten etablerer vi en protokoll for voksen rotte og mus CM isolasjon, siRNA transfection, langsiktig kultur og nedstrøms analyse av indusert spredning, med minimale modifikasjoner i de regelmessig brukte protokollene.
Tilgjengelige protokoller for voksen CM-isolasjon er basert på bruk av to kjente enzymer, collagenase og liberase, for den ekstracellulære matrisen (ECM)fordøyelsen 18,,19. Collagenase er et vanlig enzym i de voksne CM-isolasjonsprotokollene. Kollagen fordøyer kollagenfibrene i ECM, noe som resulterer i dissosiasjon av hjertevevet i encellede CM. På samme måte fordøyer liberase ECM. Liberase er det rensede alternativet for kollagennase, som viser høyere aktivitet og dermed krever høyere presisjon under CM-isolasjon for å oppnå vellykket isolasjon i forhold til kollagenase. Videre, i prosedyren, la vi merke til at CM isolert med liberase ikke overlever i den langsiktige kulturen. Cm isolert med kollagenase forbedrer imidlertid levetiden til CM under kulturforholdene.
I tillegg brukte vi en bestemt myosin II-hemmer kalt blebbistatin i kulturmediene for den langsiktige kulturen av voksen mus CM20,21. Tidligere har 2,3-butanedione monoximine (BDM) blitt brukt til den voksne CM-kulturen. BDM er en ATPase-hemmer som hemmer kontraktilfunksjonen gjennom en dårlig definert mekanisme som inkluderer hemming av ATPase og nedsatt Ca++ overgang22. Sammenlignet med BDM er blebbistatin en spesifikk hemmer av myosin II og viser mer signifikant hemming av kontraktil funksjon ved lavere konsentrasjoner enn BDM. En pre-plating av den voksne musen CM i en kultur media, supplert med 10 mM BDM og påfølgende kulturer av CM i 25 μM blebbistatin-supplert og lav serum media forbedrer overlevelse og stang form struktur av CM i langsiktig kultur. Imidlertid er en direkte plating av den voksne musen CM i media, supplert med 25 μM blebbistatin og 10% FBS bedre for proliferative studier. I likhet med den voksne rotte CM, som viser en stor grad av de-differensiering i in vitro-kulturen, observerte vi også de-differensiering i den voksne musen CM til en viss grad (figur 5). Morfologiske endringer er det nødvendige trinnet for spredning. Dermed, å gi et miljø til voksen CM som letter deres de-differensiering er en kritisk faktor å vurdere i slike studier. Selv om det på dette tidspunktet ikke er klart hvilke av de nøyaktige trinnene eller komponentene som brukes i denne protokollen er ansvarlig for den forbedrede levetiden til voksne CMs, tror vi at det er en kombinasjonseffekt av reagensene som brukes, modifikasjonene som er gjort i isolasjonsprosedyren, og kanskje viktigst av alt de trente hendene.
I likhet med de tidligere rapportene som viser den virale transduksjonen av den voksne CM i blebbistatin-supplert media, observerte vi også en effektiv transinfeksjon av disse cellene med siRNAs. Vi brukte spesifikke siRNAs mot to senescence-assosierte gener, Rb1 og Meis2,for å indusere CM-spredningen. For rotte CM utførte vi KI67-analyse for å vurdere spredningen på dag syv etter transinfeksjon; Spredningen i musen voksen CM ble imidlertid analysert på dag ti etter transfection. En artsspesifikk biologisk variasjon kan være en mulig årsak til den observerte tidsforskjellen i den induserte cellesyklusen re-entry av voksen rotte og mus CM.
Samlet sett gir protokollen beskrevet her en forbedret, pålitelig og komparativ prosedyre for å isolere voksen rotte og mus CM, og lynde kultur dem som per eksperimentelt behov. Videre tillater denne protokollen en langsiktig kultur av den voksne CM, som gir et in vitro-system for å utføre ulike langsiktige analyser som spredning, paracrinefaktor, stressrespons, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Institutt for patologi og laboratoriemedisin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et stipend fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak støttes av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes av American Heart Association postdoktorstipend (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey støttes av et NIH T32-stipend (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J.
