Summary
ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。
Abstract
Organotypic スライス培養は脳障害のモデル化に広く使用されており、薬物の神経保護および治療の可能性を評価するための優れたプラットフォームと考えられています。オルガノシピックスライスは、組織を植え付けて作製し、複雑な多細胞ex vivo環境を表します。彼らは、脳細胞の3次元サイトアーキテクチャと局所環境を維持し、ニューロンの接続性およびニューロングリア相互相互作用を維持する。海馬のorganotypicはてんかん発生の基本的なメカニズムを探求するのに適していると考えられているが、てんかんの臨床研究および動物モデルは、骨膜および内皮質で構成される鼻皮質が発作発生に関連する役割を果たすことを示唆している。
ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。完全な成長培地を灌流下のCA3領域からの自発的な活動の記録は、生理学的温度で、薬理学的操作がない場合、これらのスライスが培養中の経時に進化するてんかんのような事象を描写することを示した。細胞死の増加は、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイを介して、およびグリオシス、蛍光結合免疫体化学で評価され、また観察された。実験的アプローチは、てんかん発生のダイナミクスと進行を研究し、この脳病理の潜在的な治療標的をスクリーニングするためのプラットフォームとしての鼻皮質海馬組織学スライス培養の価値を強調する。
Introduction
てんかんは、世界で最も流行している神経疾患の1つであり、脳内の同期および過剰な神経活動の周期的かつ予測不可能な発生によって特徴付けられる。様々な抗てんかん薬(AED)が利用可能であるにもかかわらず、てんかん患者の3分の1は治療1 に難治性であり、発作および認知機能低下を経験し続けている。さらに、利用可能なAEDは、神経活動に対する比較的一般化された行動による認知を妨げる。てんかん発生は、複数および不均一なてんかん原発性傷害、数ヶ月から数十年続く長い潜伏期間、および最初の自発的発作後の抗けいれん治療の誤解を招く影響のために、ヒトでは研究が困難である。
てんかんの治療のための潜在的な治療薬の同定は、てんかんの動物モデルのために可能になった:1)遺伝的モデルは、発作が自発的に、または感覚刺激に応答して起こる遺伝的に素因のある動物を使用する。2)電気刺激誘発発作のモデル;3)ピロカルピン(ムスカリン受容体アゴニスト)、カイナテ(カイナテバ受容体アゴニスト)または4-アミノピリジン(カリウムチャネルブロッカー)を使用する発作誘導の薬理学的モデル。.これらのモデルは、行動変化の理解に不可欠であり、てんかんの根底にある分子および細胞メカニズムも重要であり、多くのAEDs 2の発見に至った。
Ex vivo製剤は、てんかん発生および分新形成の根底にあるメカニズムを探求するための強力なツールでもあります。急性海馬スライスは、6〜12時間の期間にわたって生きている細胞の電気生理学的研究を可能にし、そして数日または数週間にわたって培養器に保存することができる組織学的海馬スライスは、てんかん活動3の研究で広く使用されてきた。
Organotypic脳スライスは、植えられた組織から調製され、脳の生理学的3次元モデルを表す。これらのスライスは、関心領域の細胞アーキテクチャを保持し、すべての脳細胞とその細胞間コミュニケーション4を含む。 この領域は複数の神経変性状態における神経喪失の影響を受けるため、長期の組織性の培養に最も使用される領域は海馬である。彼らは広く脳障害をモデル化するために使用されており、薬物の神経保護および治療の可能性を評価するための優れたツールとして考えられています5,6.てんかん発生、脳卒中およびAβ誘発毒性のモデルは、海馬のorganotypicスライス7、8、9、10に記載された。パーキンソン病は腹側中皮系および線条体、ならびに皮質体体系梁線条体-実質的なニグラ、オルガノティクススライス11で探索された。オルガノシス小脳スライス培養は、軸索筋髄および小脳機能の多くの側面を模倣し、多発性硬化症12における新規治療戦略を調査するための広範なモデルである。
しかしながら、てんかんの臨床研究および動物モデルは、鼻根皮質が、近膜および内皮質によって構成され、発作発生13において役割を果たしていることを示唆している。このように、鼻皮質海馬組織のスライスにおけるてんかん発生のモデルが確立された14.徐々に制御された血清の剥奪の下で、鼻皮質海馬の組織ノティピックスライスは、常に血清含有培地に保持される類似のスライスとは異なり、進化するてんかんのような出来事を描写する。
てんかんでは、中枢神経系の多くの急性および慢性疾患と同様に、神経中心の視力は、疾患の発症および進行の根底にあるメカニズムを解明することができない。臨床的および実験的証拠は、てんかんプロセスに寄与する主要なプレーヤーの1つとして、ミクログリアとアストロサイトが関連する役割を果たす脳の炎症を指しています。てんかんの動物モデルにおける薬理学的実験は、抗てんかん作用は、炎症促進経路を標的とすることによって達成できることを示唆し、そして今日の神経炎症はてんかん15の治療アプローチの開発のための新しい選択肢とみなされている。
ここでは、鼻皮質海馬組織性スライス培養の調製と、それらから自発的なてんかん活動を記録するための詳細を十分に説明する。我々は、このシステムがてんかんのいくつかの神経炎症態様を模倣し、この病理におけるグリア細胞および神経炎症の役割を探求するのに適していることを強調する。さらに、てんかんに対する潜在的な治療アプローチのスクリーニングのための使いやすいプラットフォームを表す。
Protocol
ポルトガルの法律と欧州連合(EU)のガイドライン(2010/63/EU)は、科学的目的のための動物の保護に関するすべての手続きで尊重されました。ここに記載されているすべての方法は、iMMの制度的動物福祉機関(ORBEA-iMM)と国家権限(DGAV – ディレソン・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア)によって承認されました。
1. 鼻皮質海馬スライスの調製
注:鼻皮質海馬スライスの調製は、P6-7スプレイグドーリーラットを使用しています。
- 培養のセットアップと培地の準備
- 培養前日に、必要な培地を用意し、4°Cにします。
- 解剖培地を準備する:25 mMのグルコースをゲイのバランス塩溶液(GBSS)に入れます。
- 培養培地を調製する:50%オプティ-MEM、25%HBSS、25%ホースセラム(HS)、25 mMグルコース、30 μg/mLゲンタマイシン。
- メンテナンス培地を準備する:ニューロバサル-A(NBA)、2%B27、1 mM L-グルタミン、30 μg/mLゲンタマイシン、HS(15%、10%、5%および0%)。
- 脳の収穫
- 培養を始める直前に、P1000ピペットを用いて6ウェルプレートのウェルに1.1mLの培養液を加え、37°Cに置きます。
- すべての機器(解剖顕微鏡、ティッシュチョッパー、解剖ランプ、解剖ツール、電極、プレート、インサート、フィルターペーパー)を生物学的安全キャビネットの中に入れ、UV光下で15分間殺菌します。
- スライスの厚さを350μmに調整します。
- 冷蔵庫から GBSS を引き出します。6つのペトリ皿に5mLのGBSSを加えます。動物1匹につきペトリ料理が6個必要です。
- ネズミの子犬を安楽死させる。動物の脳幹の基部に鋭利なはさみを使用して切断を行う。
- 動物の頭部を冷たいGBSSで3回洗い、安全キャビネットの中に持ち込みます。
- 組織の分離とスライスの準備
- 鋭い鉗子を眼窩にしっかりと挿入して頭を保持します。
- 薄いはさみを使用して、脊椎の前部から前頭葉に向かって始まる正中線に沿って皮膚/頭皮をカットし、脇に置きます。
- 頭蓋骨と脳横裂き(脳と小脳の間の空間)に沿って同じ方法でカットします。湾曲した長い鉗子で、それを離して動かします。
- へらで嗅球を捨てます。頭から脳を取り除き、後頭部を上に向けた氷冷GBSSに入れる(図1A)。
- 細かい鉗子を小脳に挿入し、ヘラが各半球を非常に慎重に開いて中線に沿って行く(図1B)。
- 短い曲線鉗子では、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆う余分な組織を慎重に取り除く。次に、スパチュラで、各海馬の下に切り取ります(図1C)。
- 1つの半球を拾い上げ、海馬を上に向けてろ紙の上に置きます。もう一方の半球で手順を繰り返し、最初の半球と平行にフィルタペーパーに配置します。フィルターペーパーをティッシュチョッパーの上に置き、半球を刃に垂直にして、半球を350μmのスライスで切った(図1D)。
- スライスしたティッシュを冷たいGBSSのペトリ皿に入れる(図1E)。
- 丸い先端電極を使用してスライスを慎重に分離します(図1F)。構造的に無傷の鼻皮質と海馬を持つスライスのみを保管してください。DGとCA領域は、完全に定義されるべきであり、また、内膜および内膜皮質(図1G)である。
- 各スライスを挿入物(図1H-I)に、ヘラと丸い先端電極を付けて置きます。P20ピペットを使用して各スライスの周囲に余分な解剖媒体を取り除く(図1J)。4つの鼻皮質海馬スライスは、単一のインサートで培養することができる(図1K)。
- 文化のメンテナンス
- 1 日おきにメディアを変更します。
- 37°Cで温めます。
- インキュベーターからプレートを取ります。プラスチック製のエッジを鉗子で保持して、各インサートを拾います(図1L)。
- フリーハンドを使用して、ウェルから培地を吸引します。インサートをウェルに戻し、P1000ピペットを加えた新鮮な温めた媒体を1mL加えます(図1M)。すべての挿入に対して繰り返します。膜と媒体の間に気泡が閉じ込められないようにしてください。
注:てんかん様スライスは、培地中の血清の徐々に制御された剥奪を受ける。9日間インビトロ(DIV)から、スライスはHS14なしでNBAで維持されています。
図1:鼻皮質海馬組織のスライスの調製のための詳細な手順。(A) 頭から脳を取り出し、後ろ面を上にして氷冷GBSSに入れる。(B)鉗子を小脳に挿入する。正中線を通して脳を開き、海馬の上に余分な組織を取り除きます.(C) 矢印で示されるように、海馬の下にヘラを切り取った。(D)両方の海馬を上下に向けて両面に置き、フィルターペーパーにかけ、ティッシュチョッパーの上に350μmのスライスを切る。(E) スライスした海馬を氷冷GBSSに入れる。(F)丸いガラス電極の助けを借りてスライスを分離します。(G)無傷の鼻皮質と海馬を描写するスライスのみを選択します。(H, I)丸い先端ガラス電極の助けを借りて、各スライスをスパチュラに押し込み、挿入物の上に置きます。(J) スライスを囲む GBSS を削除します。(K) 挿入ごとに 4 つのスライスを配置します。(L)培地を交換するには、挿入物を持ち上げて、ガラスピペットで培地を吸引する。(M)6ウェルプレートのインサートと壁の間にピペットを配置して、新鮮な培地を追加します。スライスの下に気泡がないことを確認します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 電気生理学的記録
注:電気生理学的記録は、界面型チャンバーの7、14、21 DIVの鼻皮海馬組織性スライスで行われました。録音は、ソフトウェアでデジタル化し、分析、アンプで取得しました。すべての録音はバンドパスをフィルタリングしました(60 Hzの8極のベッセルフィルタと600Hzのガウスフィルタ)。
- セットアップの準備
- 1 mLのB27と250 μLのL-グルタミンで、NBA培地50 mLを調製します。37°Cでウォームアップします。
- 電気生理学の設定を閉回路に設定します。流量が2 mL/minであるかどうかを確認します。
- カーボックス(5%CO2/95%O2)バルブを開き、システム内の水位を確認します。
- 過剰な媒体を排出するために、過剰な媒体とレンズクリーニングペーパーをフレームの下に排出するために、フィルタペーパーをインターフェイス記録チャンバーに入れて、スライスに媒体を供給します。
- 温度コントローラ、アンプ、マイクロマニピュレータをオンにします。
- 録音を開始する前に、インターフェイスチャンバ内の温度を37 °Cで安定させてください。
- 人工脳脊髄液(aCSF:124 mM NaCl、3mM KCl、1.2 mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、10mMグルコース、2 mM CaCl2、1mM MgSO4 にpH 7.4)を用意し、ガラス電極にスポリンジを充填するために使用します。受取電極に入れる。
- 自発的活動の記録
- 温度が安定したら、インキュベーターからプレートを取り出し、非常に鋭い刃で挿入物から1つのスライスを切ります。60mmのプレートに、中滴を入れなさい。インターフェイス記録室にそれを取る。
- 右側に海馬とインターフェイスチャンバーにスライスを配置します。受取電極をCA3ピラミッド型セル層に配置します。
- 連続取得プロトコルに進み、30分間の記録を記録します。
3. PI取り込みアッセイ
注:細胞死は、蛍光色素ヨウ化プロピジウム(PI)の細胞取り込み量をモニタリングすることによって評価した。PIは、細胞膜を損傷した細胞に入り込み、赤色蛍光を発するDNA(吸光度493nm、発光630nm)と相互作用する極性化合物です。PIは生きた細胞に対しては意味をなさないので、集団中の死んだ細胞を検出するために使用される。
- PI インキュベーション
- 培養培地で、PIストックの新鮮な1:10希釈液を調製する。
- PI取り込みアッセイの場合は、インキュベーターからプレートを取り外し、慎重に挿入物を上げます。13 μL の PI を培地に加え、P20 ピペットを使用して、2 μM の最終濃度を得る。 インサートを所定の位置に戻す前に、ゆっくりとプレートを攪拌します。スライスの下に泡がないことを確認します。
- スライスを37°Cインキュベーターに2時間戻します。
- 次のセクションで説明するように、免疫検査プロトコルを進めます。PIは光に敏感なので、プレートをアルミニウムで覆います。
4. 免疫染色化学
注:免疫組織化学では、ニューロン特異的抗体、ならびにミクログリアおよび星状細胞の休息および反応性表現型を識別できる抗体と同様に、神経細胞- 海馬てんかん様のorganotypicsliceにおける神経死および神経膠痛の拡張を評価するために使用された。
- 組織固定
- プレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引します。P1000ピペットで、1 mLのPFAをスライスの下と上に加えて、RTで1時間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)でスライスを固定します。
- PFAを取り出し、PBSを1 mL追加します。また、スライスの下と上にPBSを追加します。
- スライスは、さらに使用するまで、PBSで4°Cに保ちます。乾燥を避けるために、常にパラフィルムをプレートの周りに置きます。
- 免疫染色工程
- 2回、10分ずつ、PBSを1mLで洗います。
- PBSで1%トリトンX100、10%HSおよび10%BSAを含むパーメアビライズ/ブロッキング溶液を調製します。5%BSA溶液を準備します。
- 疎水性ペンで2つの長方形を描きます(図2A)。鋭い刃で、挿入物(図2B)からスライスを切ります。スライドごとに2つのスライス(図2C)を入れ、P200ピペットを使用して各スライスの上部に140 μLのパーメアビライゼーション/ブロッキング溶液を追加します。RTで3時間インキュベートします。
- PBSで5%BSAで働く希釈に一次抗体を希釈します。一次抗体を4°Cで一晩インキュベートする。
- RTで4時間二次抗体とインキュベートする。このステップから、蛍光灯が取り扱われているので、プレートを光から守ります。
- 各スライスの上に50μLのHoechst溶液を置き、RTで20分間インキュベートします。
- インキュベーションの間で洗います。必ず3回、毎回10分間、PBS-Tで洗ってください。
- Hoechstを取り出し、推奨どおりに洗います。
- 各スライスの上部に50μLの取り付け媒体を追加します。ガラスカバースリップで覆い、マニキュアで囲みます(図2D)。
- RTで24時間乾燥させます。
- 共焦点顕微鏡下で免疫染色を可視化します。染色したスライスを-20°Cに保ちます。
図2:免疫検査の測定法に関する具体的な手順(A)疎水性ペンでスライドに2つの正方形を描きます。(B) スライスを含む挿入部分を切り取ります。(C)疎水性ペンで描かれた正方形に各スライスを配置し、パーメアビゼーション/ブロッキングステップを開始します。(D)プロトコルを締結した後、スライスを取り付け媒体に取り付け、ガラスカバースリップで覆い、マニキュアで囲んで仕上げます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
組織の海馬のスライスにおけるてんかんシグナル分析の以前の記述に基づいて、頭蓋間てんかんの排出は、極性の急激な変化と低周波(<2Hz)で起こるバックグラウンド活動と明確に区別される発作性放電として定義されています。10s以上持続し、より高い周波数(≥2 Hz)で発生する発作性放電は、イクタルてんかん活性として特徴付けられる。イクタル イベントが前のイベントの後に 10 s 以内に発生した場合、これら 2 つのイベントは 1 つの ictal イベントと見なされます。
7 DIVの鼻皮質海馬組織性スライス(図3A)は、混合間間およびイクタル様活性を描写している。14 DIV(図3B)では、自発的な活動は、21 DIVで圧倒的なイクタル活動に進化するictal放電によって特徴付け、イクタルイベントは>1分(図3C)続く。
図3:鼻皮質海馬組織の切片の自発的なてんかん活性。代表的な電解発作様事象は、インターフェース型チャンバ内のCA3領域から記録され、後(A)7DIV、(B)14DIV及び(C)21DIV.発作の詳細は下のトレースで示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
PI取り込みアッセイの後に、ニューロンの死を特定することを目的とした神経マーカーNeuNに対する免疫組織化学が続いた。粒状ニューロンおよび錐体ニューロンによるPI取り込みは7つのDIVスライス( 図4Aの矢印)で観察されたが、PI+ ニューロンの数は14 DIV( 図4Bの矢印)で増加し、てんかん発生の進行によるニューロン死の増加を裏付ける。
図4:NeuNおよびPI染色された鼻皮質海馬組織性スライスの代表的な画像。NeuN染色された成熟したニューロンおよびPI陽性細胞の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印は死のニューロンを指す(オレンジ色)。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Iba1の二重染色を、CD68と共に、ミクログリア表現型を評価するために使用した。Iba1はミクログリア/マクロファージマーカーであり、CD68は反応性ミクログリアによって高レベルで発現するリソソームタンパク質であり、ミクログリアを安静にすることによって低レベルで発現する。7 DIVスライスで、 低いCD68発現(図5Aの矢印)を持つミクログリアは、Iba1+/CD68+反応性ミクログリア(図5Aの矢印)よりも豊富であるのに対し、14 DIVでは海馬のすべての領域で、Iba1+/CD68+ブッシー/アモエボイドM1ミクログリア(図5Bの矢印)は低いCDB式(図5Bの矢印)を持つマイクログリアを上回る。14 DIVでは、Iba1+ /CD68+超影響出現の細胞を特定することができます (図 5Bのオープン矢印) これは、ミクログリアの M2 抗炎症表現型の発生を示唆する可能性があります。しかし、この問題はさらなる研究を必要とする。
最近の研究では、異なる発分CNS傷害が少なくとも2種類の反応性アストロサイト、A1およびA2を引き出し、A1アストロサイトは神経毒性16であることが示された。アストロサイトのA1サブタイプは、補体C316、17、18の発現の増加によって特徴付けられる。補体C3は、補体系の活性化において中心的な役割を果たし、さらにiC3b、C3dg及びC3d19に分解されるC3bを生成する。従って、GFAPおよびC3dの二重染色を使用して、アストログリオーシスを評価した。7 DIVではC3dの発現が検出がかろうじて可能である(図6A)、14個のDIVスライスで肥大化GFAP+/C3d+アストロサイトが観察され得る(図6Bの矢印)、A1アストロサイトの進行活性化を示唆する。
結果は、てんかん発生の過程を通じてミクログリアおよびアストロサイトの進行的活性化を示し、てんかん患者およびこの病理の動物モデルに記載された事象を模倣する。
図5:Iba1およびCD68染色された鼻皮質海馬組織のスライスの代表的な画像。Iba1およびCD68染色ミクログリアと、Hoechst染色された核の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印はIba1+/CD68を指し、休息ミクログリア、矢印はIba1+/CD68+ ブッシー/アモエボイドミクログリアを示し、開いた矢印はIba1+/CD68+ 超突出したミクログリアを明らかにする。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:GFAPおよびC3d染色された鼻皮質海馬組織のスライスの代表的な画像。GFAPおよびC3d染色されたアストロサイトと、Hoechst染色された核の画像を、20倍の目的を有する共焦点レーザー顕微鏡上の(A)7DIVおよび(B)14DIVで取得した。破線領域の拡大画像が表示されます。矢印はGFAP+/C3d+ 反応性A1アストロサイト(黄色)を指します。スケールバー、50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
てんかんの動物モデルは、多くのAEDの発見に不可欠であったが、多くの動物を必要とし、それらのほとんどは発作発症の潜伏期のために時間がかかる。海馬急性スライスにおけるてんかん活性の低マグネシウム誘導も文献3で徹底的に改訂されているが、急性スライスは6-12時間の生存率を有し、長期的な変化を評価することは不可能である。Organotypicスライスは、数日から数週間の培養で維持することができ、急性スライスの短い生存時間を克服することができ、および、組織語海馬スライスにおけるてんかん発生のモデルが3、7、8で提案されている。
ここでは、鼻皮質と海馬を含むorganotypicスライスの調製について説明する。これらのスライスは、動物ごとに準備するために15〜20分を要し、動物の犠牲から挿入物へのスライスの配置まで、そして半球当たり6〜8枚のスライスを得ることができます。海馬を露出させるために半球を開くとき、およびスライス後に濾紙から組織を取り除くときには、特別な注意が必要です。海馬の上の過剰な組織はまた、スライス中のスライスの完全性を損なう可能性があります。
鼻皮質海馬組織ノミスティックスライスは、生体内てんかんに似た進化するてんかん様の活動を描いている。文化の1週間後、ほとんどのスライスは、文化の時間と一緒に単にictalのようなイベントに進行する混合間間およびイクタルのような活動を描いています。これまでに、2~3週間のスライスでの経腸放電を記録しました。このシステムでは、てんかん様の活動は、組織ノミの海馬スライスよりも速く発達するように見える。これは、海馬への機能的入力のほとんどを保持する鼻皮質の存在に起因する可能性があります。この問題に完全に対処するために、これらのスライスが培養中に表示するてんかん信号の完全な特徴付け(ictalイベントの数と期間など)を、振幅と周波数とともに現在行われています。
このシステムは、3週間以上培養中に維持することができ、そして、例えば、神経死、ミクログリアおよびアストロサイトの活性化および炎症促進サイトカイン14の産生の増加のようなてんかんの多くの分子相関を模倣し、これらの局面の長期的な特徴付けを可能にする。また、特定の細胞経路を標的とする薬理学的介入を実施し、潜在的な治療標的をテストできる、使いやすいスクリーニングプラットフォームを表します。間違いなく、本明細書に提示されるシステムは、てんかん発生のメカニズムをさらに啓発するのに役立ちます。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、画像取得に関するすべての提案について、インスティトゥート・デ・メディシナ分子ジョアン・ロボ・アンチューンズのバイオイメージングユニットを認めたい。
このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから、助成金契約Nº 952455、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・テクノロジア(FCT)からプロジェクトPTDC/MEDFAR/30933/2017、ファクルダーデ・デ・メディシナ・ダ・ユニバーシダーデ・デ・リスボアから資金を受け取りました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A.
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
