Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Published: August 19, 2020 doi: 10.3791/61640
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 4, 1, 1
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

Summary

כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

Abstract

השמנת יתר היא בעיה גדולה ברחבי העולם בריאות הציבור שמגביר את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, ומחלות כבד. השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסה של רקמת שומן (AT) בשל היפרפלזיה אדפוציט ו/או היסטרופיה, מה שמוביל לשיפוץ עמוק של המבנה התלת מימדי שלה. אכן, היכולת המקסימאלית של AT להתרחב במהלך השמנת יתר היא חיונית להתפתחות של פתולוגיות הקשורות להשמנת יתר. הרחבת AT זה היא מנגנון הוםוסטטי חשוב כדי לאפשר הסתגלות לעודף צריכת אנרגיה ולהימנע שפיכת שומנים מזיקים לאיברים מטבוליים אחרים, כגון שריר וכבד. לכן, הבנת השיפוץ המבני שמוביל לכישלון של הרחבת AT היא שאלה בסיסית עם ישימות קלינית גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים שיטת ניקוי פשוטה ומהירה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפולוגיה של רקמת שומן לבנה של עכבר ואדם לבן על ידי הדמיית פלורסנט. שיטת ניקוי AT ממוטבת זו מבוצעת בקלות בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת במכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ פלורסנט. יתר על כן, תרכובות כימיות בשימוש זמינים. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת לפתור את מבנה 3D AT על ידי הכתמת סמנים שונים כדי לדמיין באופן ספציפי את adipocytes, רשתות עצביות וסקולריות, ואת התפלגות תאי החיסון המולדת ואדפטיבית.

Introduction

השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסת רקמת שומן והפכה לבעיה גדולה ברחבי העולם לבריאות הציבור, בהתחשב בכך שאנשים עם השמנת יתר יש סיכון מוגבר לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, מחלות כבד וכמה סוגי סרטן.

פונקציה פיזיולוגית בסיסית של רקמת שומן היא לווסת גלוקוז כל הגוף הומאוסטאזיסשומנים 1,,2. במהלך תקופת ההאכלה, adipocytes (כלומר, התאים העיקריים של רקמת שומן) לאחסן את עודף הגלוקוז והשומנים המסופקים על ידי ארוחה לתוך טריגליצרידים. במהלך הצום, adipocytes לשבור את הטריגליצרידים לתוך חומצות שומן לא esterified גליצרול כדי לקיים את הביקוש האנרגיה של הגוף. במהלך התפתחות השמנת יתר, רקמת שומן להרחיב על ידי הגדלת הגודל (היסטרופיה) ו / או את המספר (היפרפלזיה) של adipocytes1,כדי להגדיל את קיבולת האחסון שלהם. כאשר ההתפשטות של רקמת שומן מגיע לגבול שלה, משתנה מאוד קבוע בקרב חולים, שומנים הנותרים מצטברים לתוך איברים מטבוליים אחרים כולל שרירים וכבד3, 4,המוביל לכשל התפקודישלהם וייזום סיבוכים אירוביים הקשורים להשמנת יתר1,,5. לכן, זיהוי המנגנונים השולטים בהרחבת רקמת שומן הוא אתגר קליני מרכזי.

השינויים המורפולוגיים המתועדים בתוך רקמות שומן במהלך השמנת יתר קשורים לתפקוד הפתולוגי שלה. מספר הליכי כתמים שימשו לתיאור ארגון הרקמות של רקמת השומן, כולל actin6, סמני כלידם 7, סמנים שומנים-טיפות8, וסמניםספציפיים תא חיסוני9,,10. עם זאת, בגלל הקוטר העצום של adipocytes (50 כדי 200 μm)11, זה חיוני לנתח חלק גדול של הרקמה כולה בשלושה ממדים על מנת לנתח במדויק את השינויים המבניים הדרמטיים AT שנצפו במהלך השמנת יתר. עם זאת, מכיוון שהאור אינו חודר רקמה אטומה, הדמיה ב3D בתוך דגימות רקמה גדולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ אינה אפשרית. שיטות של ניקוי רקמות כדי להפוך אותם שקופים דווחו בספרות(לסקירה, ראה 12)המאפשר אחד לנקות רקמות ולבצע מעמיק, מיקרוסקופ פלואורסק של רקמות שלם. שיטות אלה מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להעריך את הארגון הסלולרי 3D ברקמה בריאה וחלויה. לכל אחת מהשיטות המתוארות יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש לבחור בקפידה בהתאם לרקמות הנחקרות (לסקירה,ראה 13). ואכן, גישות מסוימות דורשות תקופת דגירה ארוכה ו/או שימוש בחומרים או תרכובותיקרים, רעילים או קשים להשגה של 14, 15,,15,16,,17,,18,,19. תוך ניצול של אחת התרכובות הראשונות ששימשו לפני מאה שנה על ידי ורנר Spalteholzכדי לנקות רקמות 20, הקמנו פרוטוקול ידידותי למשתמש ולא יקר כי הוא מותאם היטב עבור ניקוי של כל העכבר ומחסני רקמת שומן אנושי בכל מעבדה עם ציוד טיפוסי כולל מכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה נבדק ומאומת עבור כל מחסני רקמת השומן של העכבר והאדם הלבן. רקמות שומן אדם ועכבר נאספו בהתאם לחוקים האירופיים ואושרו על ידי ועדות אתיות צרפתיות ושוודיות.

1. קיבעון של רקמת השומן לבן של העכבר והאדם

  1. לטבול את העכבר שנקטפו או רקמות שומן לבן אנושי לפחות 10 מ"ל של PBS המכיל 4% paraformaldehyde (PFA) בצינור פלסטיק 15 מ"ל.
  2. לנער את צינור הפלסטיק בטמפרטורת החדר על צלחת מתגלגלת במשך 1 שעה.
  3. להשאיר את צינור הפלסטיק ב 4 מעלות צלזיוס על לוח מתגלגל בן לילה, כדי להשלים את קיבעון.
    הערה: פרוטוקול זה מותאם דגימות רקמת שומן גדולה, כגון רפידות שומן אפידימליות שלמות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטה נורמלית (≈250 מ"ג - ≈0.6 ס"מ3). עבור דגימות גדולות יותר כמו רפידות שומן אפידימליות שהתקבלו מעכברים האכילו דיאטת שומן גבוהה (≈1.5 גרם - ≈4ס"מ 3)או דגימות רקמת שומן אנושית, למרות פרוטוקול ניקוי צריך לעבוד בצורה מושלמת עבור המדגם כולו (על ידי שינוי קנה מידה של PFA ותערובות נוגדנים), באופן כללי, אנו חותכים חתיכות רקמות סביב 1 גרם (≈2.5 ס"מ3)כדי לשמור את הדגימות הנותרות או עבור כתמים נוספים או יישומים. עבור PFA (שלב 1.1.) אנו ממליצים להשתמש בערך 10 פעמים את נפח הרקמה. עבור תערובות נוגדנים (שלבים 3.1. ו 3.4.), להגביר את עוצמת הקול כדי לטבול לחלוטין את הרקמה, ולהשתמש צינור פלסטיק 15 מ"ל (ראה טבלת חומרים)אם הרקמה גדולה מדי עבור microtube פלסטיק 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).

2. חירבול ורוויה של רקמת שומן לבנה ואנושית

  1. לשטוף את רקמת שומן לבן קבוע ב 10 מ"ל של PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של PFA.
  2. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.3% גלצין (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית במשך 1 h ב 100 מהפכות לדקה (סל"ד) כדי להרוות את שאר קבוצות אלדהיד חינם.
  3. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה במשך 2 שעות ב 100 סל"ד.
  4. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ו 20% DMSO (ראה טבלת חומרים)ולנער את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לילה.
  5. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.1% Tween-20 (ראה טבלת חומרים), 0.1% Triton X-100, 0.1% deoxycholate (ראה טבלת חומרים)ו 20% DMSO ולנער את הצינור ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד לפחות 24 שעות.
  6. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100 ולנער את הצינור בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 1 שעה.
  7. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו-3% BSA (ראה טבלת חומרים)ונענעו את הצינור ב-37°C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב-100 סל"ד למשך 12 שעות, כדי לרוויה את כל האתרים שאינם קשורים באופן ספציפי לנוגדנים.
    הערה: בשלב 2.7, BSA ניתן להחליף על ידי סרום דם של המין של הנוגדן המשני בשימוש.

3. הליך התכתמות עבור רקמת שומן לבנה ואנושית

  1. להעביר את הרקמה במיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים העיקריים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection אבל ריכוז נוגדנים אופטימלי צריך להיות מוערך עבור כל נוגדן). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).
  2. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור מוגן מפני אור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.
  3. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלול מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.
  4. להעביר את הרקמה למיקרו-tube פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 300 μL של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA ואת הנוגדנים המשניים (10x מרוכז יותר מאשר עבור הכתמת cryosection). הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום ולנער את הצינור ב 37 ° C בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד במשך יומיים לפחות (ראה את הפתק בשלב 1.1 וצעד 3.7.1).
  5. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 5 שעות. בצע שלב זה פעמיים.
  6. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS בתוספת 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, ו 3% BSA ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 ° C ב שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד ללילה אחד עד יומיים.
  7. לשטוף את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
    הערה: עבור תיוג של מבנים ספציפיים כגון גרעין או actin, להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילידול (DAPI או שווה ערך) ו / או פלואורסצנט מסומן-פאלואידין יש להוסיף בשלב 3.1. כאשר משתמשים רק במנוגים ראשוניים המסומנים בפלורסנט, או בשלב 3.4. כאשר משתמשים בנבדנים משניים.
    הערה: עבור הליך הכתמים, נוגדנים ראשוניים כבר הוסתרו עם fluorochromes (כמו אלה המשמשים עבור ציטומטריה זרימה) ניתן להשתמש ואנחנו ממליצים על זה לרווחת זמן וספנות. אכן, גם אם נוגדנים ראשוניים העכבר ניתן להשתמש ואחריו נוגדנים משניים נגד עכבר, כפי שהראינו את זה כאן, לעתים קרובות הבחנו כתמים לא ספציפיים של כלי דם בשל מחזור אימונוגלובולין. לכן, כדי למנוע בעיה זו, נוגדנים ראשוניים שכבר מסומנים מומלצים מאוד וכאן אנו מספקים ראיות לכך הנוגדנים המשמשים ציתום זרימה תואמים להליך שלנו. עם זאת, במקרה הספציפי של אנטיגן המתבטא ברמות נמוכות, צעד ההגדלה אות באמצעות נוגדנים משניים הוא חובה; כאשר הנוגדן העיקרי הזמין היחיד נעשה בעכבר, זיגוג לב של העכברים עם PBS לפחות 5 דקות בהקרבה יכול להסיר חלק גדול של אימונוגלובולין במחזור ולכן הכתמים הלא ספציפיים.

4. ניקוי הליך עבור עכבר ורקמות שומן לבן אנושי

  1. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 50% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  2. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 70% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  3. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 95% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  4. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד עבור 2 שעות.
  5. לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 100% אתנול ולנער את הצינור, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולית ב 100 סל"ד לילה.
  6. לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מ"ל עם פקק פלסטיק (ראה שולחן של חומרים) המכיל 5 מ"ל של מתיל סלצילאט (ראה טבלת חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ולנער את מיכל הזכוכית, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר בשייקר מסלולי ב 100 סל"ד לפחות 2 שעות.
    הערה: ניתן להאיץ באופן משמעותי את הליך ההנקה (במידת הצורך) על-ידי הימנעות מהצעדים 4.3. ו 4.5., למרות איכות ניקוי הסופי יהיה מופחת במקצת.

5.3D הדמיה קונפוקל של רקמת שומן לבנה פינה

  1. מעבירים את הרקמה לתא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית (ראה שולחן חומרים)מתחת למכסה המנוע הכימי ומלא את התא במטיל סליצילאט טרי.
    הערה: כדי לאבטח את הרקמה במקום, ובכך למנוע ממנה לצוף או לנוע הצידה בתא, יש למרוח מספר כיסויי זכוכית עגולים של 18 מ"מ (ראה טבלת חומרים)על גבי הרקמה בעת הרכבתה לתא.
  2. מניחים את תא ההדמיה על מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך.
  3. תמונה הרקמה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה (למשל, 4x המטרה) כדי ליצור כמה ס"מ3 מפות 3D של רקמת שומן כולה או של דגימת הרקמה האנושית.
  4. בחר מספר אזורים לדגימת הרקמה בהגדלה גבוהה יותר. בדרך כלל, השתמש ביעד אוויר למרחקים ארוכים של פי 20 המספק יחס טוב בין רזולוציה לעומק. אנו רוכשים תמונות פסיפס גדולות עם z-stacks בין 600 ו 2000 μm עומק.
    הערה: השתמש במטרה למרחקים ארוכים כדי לתמונה עמוקה יותר לתוך הרקמה.

6. הפקת תוצאות כמותיות מתמונות רקמת השומן 3D

הערה: ניתן לבצע את פילוח המבנים השונים ואת החילוץ הבא של המידע הכמותי מערימת התמונה תלת-מיו שנעצר בנקודה 5 באמצעות כל אחת מאפשרויות התוכנה הקיימות רבות לניתוח תמונות, מסחריות או חופשיות. בנקודות הבאות, אנו מתארים אסטרטגיה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחלץ מידע כמותי מתמונות רקמת שומן 3D באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים).

  1. המר את ערימות תלת-מית-אל לתבנית התוכנה למרחב זיכרון פנוי.
  2. תמקטע את התאים.
    1. פתח את מודול התא של התוכנה.
    2. שנה את ההגדרה זיהוי תאים לכתמים קרום פלזמה.
    3. בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש כדי לפרט את פריפריה התא (פאלואידים אשר תוויות אקטין קליפתי או סמני קרום פלזמה כגון F4/80 עבור מקרופאג,TCR-β עבור תאי T, או אשכול של חלבוני תקליטור בידול ספציפיים עבור תת סוגים של תאים חיסוניים).
    4. הגדר את הסף וספק טווח של גודל תא צפוי (כלומר, 1 עד 200 μm לזיהוי תאים).
    5. הפעל את פילוח. אמצעי אחסון המתאים לערימת z ייווצר כאשר התאים המחולקים מקודדים בצבע בצבע שונה עבור כל אחד מהתאים השכנים.
    6. החל מסננים סטטיסטיים (גודל, מעוגל, מעגליות וכו') בכרטיסיה סטטיסטיקה כדי לא לכלול חפצי פילוח ו/או כדי למקד את התאים המחולקים לתא העניין בהתבסס על גודלם (כלומר, 20-200 μm עבור adipocytes; 5-25 μm עבור מקרופאגים; 1-3 μm עבור לימפוציטים).
    7. חלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.
  3. רכיבים תאיים פלח (גרעינים, שלל, וכו ') או כלי כמבנה.
    הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.
    1. פתח את מודול Surface של התוכנה.
    2. בחר את ערוץ הפלורסנט של הסמן המשמש לסימון ספציפי של הרכיב התת-תאי כדי לשחזר אותו ב- 3D.
    3. הגדר את הסף ולספק טווח של גודל הקוטר הצפוי של המבנה (כלומר, 0.5-5 μm עבור גרעין; 0-100 μm עבור כלי; וכו ').
    4. הפעל את פילוח. ייווצר אמצעי אחסון עם המבנה התאי המקטע. ניתן לחלץ מדידות ונתונים כמותיים (אמצעי אחסון, מספר, גודל, קוטר וכו') מהלשונית סטטיסטיקה.
  4. חלק את כלי הדם כרצף צינורי.
    הערה: למרות פילוח נימה הוא מאוד שימושי ללמוד את הקישוריות של כלי, אנו משתמשים פילוח מודול פני השטח כדי לחלץ נתונים על הגודל, נפח וקוטרים של כלי. אכן, הכימות של הגדלים של כלי אבד בעת שימוש במודול נכי.
    1. פתח את מודול הנינים של התוכנה.
    2. בחר את ערוץ הפלורסנט המתאים להכתמת כלי הדם.
    3. הגדר את הסף עבור עוצמת הפלואורסץ ובחר את המספר המתאים של צמתים מחוברים צפויים.
    4. הפעל את פילוח. ייווצקו ב-3D תסנים המייצגים את רשת כלי השיט. ניתן לחלץ מדידות מלשונית הסטטיסטיקה, המאפשרת להשיג נתונים כמותיים כולל אורך כלי שיט, מספר הסתעפות כלי שיט וכו'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך המתואר כאן ומסוכם איור 1, הצלחנו להכתים ולטהר אופטית את רקמת השומן האנושית והעכבר הלבנה כפי שהוצגה בדמות 2A ו-איור 2B, בהתאמה. הרקמה הנוקתה הועברה לתא ההדמיה המתכתי כדי לבצע הדמיה קונפוקאלית(איור 3א). ההבהרה שיפרה באופן דרסטי את עומק תמונות הרקמה שיכולנו לרכוש(איור 3B ואיור 3C). ניתן לרכוש את כל רקמת השומן ב-3D בהגדלה נמוכה באמצעות יעד 4x (ראה סרט משלים 1),כדי ליצור מפת תלת-מימדית, המאפשרת לבחור את האזורים השונים שיש לרכוש בהגדלה גבוהה באמצעות יעד של 20x (איור 3D). תמונות ההגדלה הגבוהות נרכשות בתלת-מי-די בעומק של 2מ"מ (איור 3E).

הליך זה מאפשר תיוג של סמני תא כלליים רבים, כולל גרעין באמצעות DAPI וactin באמצעות פאלואידים תיוג פלורסנט. כתם ספציפי של טיפות שומנים וadipocytes ניתן להשיג באמצעות נוגדן perilipin (ראה טבלת חומרים; איור 4א) ונוגדן אנטי-גלוט4 (ראה טבלת חומרים; איור 4B) בהתאמה. ניתן לזהות כלי דם באמצעות נוגדן CD31 (ראה טבלת חומרים; איור 4C) או על ידי הזרקה תוך-וודית של לקטין-DyLight649 זמן קצר לפני הקרבת העכבר (ראה טבלת חומרים; איור 4D. ניתן לדמיין מקרופאגים ותאי T באמצעות הנוגדן נגד CD301-PhycoErythrin (ראה טבלת חומרים; איור 4D) ונוגדן ה-Bleu β-TCR-Pacific (ראה טבלת חומרים; איור 4E. ניתן לזהות את רשת העצבים ההיקפית באמצעות נוגדן הידרוקסילאז אנטי טירוסין (TH) (ראה טבלת חומרים; איור 4F-G. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר ניקוי של רקמת שומן אפידידלית העכבר(איור 4A-B,E),רקמת שומן תת עורית העכבר(איור 4D,G),רקמת שומן חום העכבר(איור 4F),ורקמות שומן אנושי(איור 4C). באמצעות שילוב של תיוג אלה ותוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי למקטע סמנים אלה, אנו יכולים לקבוע בתוך רקמת שומן i) adipocytes אומר גודל וגודל התפלגות(איור 5A-B)ו- ii) צפיפות רשת כלי דם(איור 5C).

Figure 1
איור 1: סיכום הליך ההבהרה לרקמות שומן לבנות. עכבר או רקמות שומן לבנות אנושיות קבועות, חבולות, רוויות, מוכתמות ומנוקות. לאחר מכן, התמונות נרכשות בתלת-מיוד וניתחו באמצעות תוכנה מסחרית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תצלומים של רקמת שומן לבנה. (א)תצלום של רקמת שומן abdominopelvic לבנה אנושית לפני ואחרי הליך ניקוי. (ב)צילום של רקמת שומן לבנה אפידימלית העכבר לפני ואחרי הליך ניקוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עומק הדמיה משופר עם ניקוי רקמת שומן. (א)הרכבה של תא הדמיה מתכתי מצויד בתחתית זכוכית. (ב)תמונות מסדרת Z של רקמת שומן לבנה אפידימלית עכבר מוכתמת פאלואידין-Alexa488 (ירוק) לפני ואחרי ניקוי. (C) הקרנת XZ התואמת את הקווים המנוקדים הלבנים על-פני לוח B z-stack. (D)Z-הקרנה של 0.4 ס"מ z-stack של רקמת שומן לבנה תת עורית עכבר מוכתם עבור actin באמצעות פאלואידין-Alexa488 ונרכשה בהגדלה נמוכה עם יעד 4x. התמונות הקטנות מימין נרכשו במיקום הרקמה שנבחר באמצעות מטרה של פי 20. (ה) תצוגה צדדית של עיבוד נפח 3D של z-stack תמונה מרקמות שומן לבן עכבר פינה מוכתם פאלואידין-Alexa488 נרכש באופן דומה 20x תמונות מ (D). עומק ההדמיה תלת-ממדית שהושג על ידי הליך ההגדלה הגבוה שלנו מדגים כאן ומודגש בקו תחתון על ידי קידוד צבע z-עומק (כחול כהה עבור z = 0 מ"מ לאדום כהה עבור z = 2 מ"מ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: עכבר ורקמות שומן לבנות אנושיות מוכתמים עבור מספר סמנים. (A)תמונת מטוס יחיד של רקמת שומן לבנה אפידימלית עכבר מוכתמת טיפות שומנים באמצעות נוגדן anti-perilipin1 ונוגדן אנטי-עכבר-alexa647-conjugateed. (ב)תמונת מטוס יחיד פסיפס של רקמת שומן לבנה אפידימלית עכבר מוכתמת עבור גרעין וadipocytes באמצעות DAPI, נוגדן anti-Glut4 ונוגדן נגד עכבר-alexa647-conjugated. (ג)Z-הקרנה של 600 μm z-stack של רקמת שומן abdominopelvic לבן אנושי מוכתם עבור כלי באמצעות CD31-alexa647-conjugated נוגדן. (D)Z-הקרנה של 600 μm z-stack של רקמת שומן לבנה תת עורית עכבר מוכתם עבור כלי מקרופאגים באמצעות לקטן-DyLight649 זריקות תוך ורידי ונוגדן אנטי CD301-alexa555. הימנית התחתונה היא תמונה מוגדלת של התיבה הלבנה המנוקדת. (ה)תמונת מטוס יחיד של רקמת שומן לבנה אפידימלית עכבר מוכתם עבור actin ותאי T באמצעות פאלואידין-Alexa488 ו אנטי TCRβ-פסיפיק כחול-conjugated. הימנית התחתונה היא תמונה מוגדלת של התיבה הלבנה המנוקדת. (F)Z-הקרנה של 50 μm z-stack של רקמת שומן חום עכבר מוכתם עבור גרעין רשת עצבית באמצעות DAPI, נוגדן אנטי TH ונוגדן אנטי ארנב-alexa647-conjugateed. (G)Z-הקרנה של 600 μm z-stack של רקמת שומן לבנה תת עורית עכבר מוכתם עבור גרעין רשת עצבית באמצעות DAPI, נוגדן אנטי TH ונוגדן אנטי ארנב-alexa647-התרועע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח תמונות תלת-מית-מידס באמצעות תוכנה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים). (א)עיבוד נפח תלת-ממדי של adipocytes אנושי מחולק 3D על ידי תוכנה מסחרית זמינה. לכל adipocyte יש צבע שונה ל-adipocytes הסמוכים ליצירת קשר. כלי שיט מיוצגים באדום. (ב)כימות והפצה של adipocytes מעיבוד אמצעי האחסון 3D של לוח A, המכיל כ 20,000 adipocytes. (ג)עיבוד נפח תלת-ממדי של כלי דם המקטעים ב- 3D באמצעות תוכנה מסחרית זמינה ומיוצגים באדום או בצהוב עבור כלי הדם הגדולים וקטנים, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט משלים 1: עיבוד נפח 3D של כל רקמת שומן לבן תת עורי המוצג איור 3D. התיבה הלבנה מייצגת קוביה של 2ס"מ 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השינויים המתרחשים בתוך רקמת השומן במהלך ההתקדמות הפתולוגית, כגון זה של השמנת יתר, הוא בסיסי להבנת המנגנונים מאחורי הפתולוגיה. מחקרים חלוציים שחשפו מנגנונים כאלה ברקמת שומן התבססו על גישות גלובליות כגון פרוטאומיקה רקמת שומןשלמה 21, ציתוםזרימה 22,23, ותעתיק24,25. בנוסף, נעשו מאמצים לחקור את השינויים המבניים המתרחשים ברקמת שומן באמצעות ניתוחים היסטולוגיים26,27,28,29. עם זאת, הניתוח של 5-10 μm אדיפוז רקמה מקטעים, בגלל הגודל המוגבל של הסעיף, מגביל את היכולת להעריך תכונות מבניות חשובות. ראשית, רק כמה גרעיני adipocyte ניתנים לזיהוי לכל מקטע מאז כל סעיף מייצג רק חלק קטן של adipocytes (1/10th). שנית, הגודל של adipocytes מוערך מקטעי רקמת שומן אינו מדויק כי רוב adipocytes נחתכים מתחת או מאחורי קו המשווה שלהם, המוביל המדידה מוטה (תחת)של גודלם הממוצע. שלישית, כלי הדם ורצף סיבי העצב הולכים לאיבוד במהלך ניתוח פיזי. רביעית, התפלגות כל תת-סוגי תאים חיסוניים בתוך הרקמה קשה לביסוס מכיוון שהנקודות הציון התלת מימדיות אובדות. בהקשר זה, המתודולוגיה שאנו מציעים כאן מאפשרת לכל מעבדה סטנדרטית למצוא רקמת שומן אנושית ועכברית לבנה תלת מימדים, באופן פשוט וזול.

לשיטה זו יש כמה מגבלות. ראשית, הזמן הנדרש להכנת הרקמה (קיבעון, חחלוב, כתמים, ניקוי) הוא ארוך (יותר משבוע). זה יהיה קשה להפחית כי רוב הזמן הזה נדרש להכתים את הרקמה. חדירת נוגדנים בתוך דגימות רקמה כה גדולות דורשת זמני דגירה ארוכים. הפחתת זמן הדגירה תגביר את הסיכון לחדירה נוגדנית לא הומוגנית, מה שיוביל להכתמת חפצים. לכן, החלון האפשרי היחיד כדי להרוויח זמן ולקצר את ההליך הוא הזמן המוקדש כדי לנקות את הרקמה, אשר לוקח סביב יום אחד כאשר נדרשות תוצאות אופטימליות, אבל זה יכול להיות מופחת לחצי יום ללא ירידה דרמטית באיכות. המגבלה השנייה היא ההתכווצות הסבירה של הרקמה. אכן, בכל פרוטוקול המתייבש רקמות באמצעות ממיסים, סביר להניח כי הרקמות להתכווץ עקב הסרת מים. הערכת התכווצות זו היא תמיד מאתגרת, וזה כמעט בלתי אפשרי כאן כי קצה הרקמה הופך שקוף כאשר שומנים מתחילים להיחלץ במהלך תהליך ההתייבשות. לפיכך, הערכות גודל של הרקמות פינה צריך להתפרש בזהירות. עם זאת, השוואת שינויים בגדלים adipocyte או אורך כלי בין רקמות נגזר עכבר עם גנוטיפים שונים ו / או הוגש לתנאים סביבתיים שונים להישאראינפורמטיבי 11. המגבלה האחרונה קשורה לנפח הגדול של רקמת שומן העכבר כולו או של דגימה כירורגית רקמת שומן אנושית גדולה. אכן, למרות הפרוטוקול מותאם באופן מושלם כדי לנקות דגימות גדולות אלה, הדמיה איבר שלם הוא מאתגר עם מיקרוסקופ confocal. האסטרטגיה להתגבר על בעיה זו ולנצל את מלוא הפוטנציאל של הליך ניקוי איברים כולו, היא לרכוש מפת הגדלה נמוכה 3D של האיבר כולו באמצעות יעד 4x, ולבחור אזורים ספציפיים מפוזרים באופן אקראי בתוך הרקמה שבו תמונות 3D הגדלה גבוהה יותר באמצעות יעד למרחקים ארוכים 20x ניתן לרכוש. ההתקנה "הגדלה גבוהה" מאפשרת הדמיה של נפח הרקמה של כ 45מ"מ 3 (4.7 x 4.7 x 2 מ"מ). למרות שנפח זה מוגבל בהשוואה לנפח האיבר כולו (0.5 עד יותר מ-4ס"מ 3), חזרהעל הרכישות במספר עמדות בתוך הרקמה מאפשרת לנו לקבל דגימה טובה של הרקמה ברזולוציה תאית תת-תאית. שים לב כי הדמיה רקמות גדולות תיצור כמות משמעותית של נתוני הדמיה שיהיה צורך לאחסן.

ההליך יש הבדלים משמעותיים בהשוואה לשיטות שתוארו בעבר כדי לנקות רקמתשומן 14,30. קודם כל, בניגוד ל-AdipoClear, שמשתמשת במתנול, דיכלורומטאןודיבזילתר 14, השיטה המוצגת כאן משתמשת באתנול להתייבשות ומתיל סליצילאט לניקוח. לכן, ההליך הוא בטוח יותר כי הוא מנצל ממיסים סלילה רעילים פחות המשמשים לעתים קרובות על ידי תעשיות מזון / עיבוד משקאות (אתנול ומתילסיילאט), בהשוואה רעילות גבוהה של דיכלורומטן, מתנול ו dibenzylether. יתר על כן, הכנת הרקמה על פי הפרוטוקול היא יומיים מהר יותר מאשר פרוטוקול AdipoClear14. לאחרונה, שיטה אחרת הוצעה על ידי לי ועמיתיו כדי לנקות חתיכות רקמת שומן על ידי לטבול אותם לתוך גליצטרול30. פרוטוקול זה הוא פשוט מאוד אפילו בהשוואה להליך זה, ואיכות התמונות טובה גם בהגדלה גבוהה. עם זאת, פרוטוקול ניקוי זה פועל ביעילות רק בעת שימוש 2 מ"מ3 חתיכות רקמת שומן. החלקה של הרקמה לתוך דגימות זעירות אלה לפני הליך ההבהרה מונעת אחד מהדמיה נפחי רקמה גדול מ 2מ"מ 3 אפילו בהגדלה נמוכה. ההליך המוצג כאן מאפשר מיפוי של כל הרקמה ב3D בהגדלה נמוכה ורכישה של ערימות 3D של תמונות סביב 45מ"מ 3 במספר עמדות ידועות בתוך כל רקמת שומן פינה בהגדלה גבוהה.

הליך זה עשוי להיות מספר יישומים עתידיים. כמו בכל שיטה, ניתן לפשט את ההליך המתואר כאן ו/או למטב אותו עוד יותר. התקדמות מעניינת להליך יכולה לבוא משילוב של תהליך ההבהרה, תיארנו, עם גישות הדמיה נוספות. לדוגמה, תכונות הדמיה ספציפיות, כגון טומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT), מיקרוסקופית פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF), מיקרוסקופית תאורה של תוכנית סלקטיבית (SPIM) או מיקרוסקופית דלדול פליטה מגורה (STED) תואמות עקרונית את ההליך, אם כי הדבר יגביל את הישימות שלה למעבדות המצוידות במערכות אלה. לחלופין, באמצעות מטרה עם אינדקס צמצם מספרי גבוה ומערכת רכישה כי הוא מסוגל לרכוש מאות תמונות לשנייה, אשר נמצא במעבדות רבות, אחד יכול לבצע ניתוחים סופר רזולוציה באמצעות תנודות רדיאליות רזולוציה סופר (SRRF) ניתוח תמונה לאחר עיבוד freeware31. מעניין, fluorochromes קלאסי מותאמים לניתוח SRRF, אשר יאפשר ניתוחים סופר רזולוציה 3D של רקמות שומן לבן אדם ועכבר שלם.

שלבים קריטיים רבים בפרוטוקול קשורים לעיבוד הרקמות לפני ניקוי עצמו. קודם כל, ובזכות ניתוחים היסטולוגיים קלאסיים, צעד קיבעון הוא בסיסי. במקרה של קיבעון חלש, תכונות מבניות אינן נשמרות, בעוד קיבעון מורחב מוביל להצלבה וחסימה של אתרי אנטיגן ספציפיים וכתוצאה מכך כתמים חיסוניים לא הומוגניים. צעד רגיש נוסף הוא הכתמת הרקמה, המציגה מספר נקודות קריטיות שאנו מתארים להלן. ראשית, הנוגדנים צריכים להיות מאומתים על ידי בדיקתם על מקטעי cryostat כדי לאשר כי הם פונקציונליים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי שלהם. הריכוז הסופי המשמש להליך ניקוי הוא פי עשרה מהריכוז האופטימלי עבור מקטעים cryostat. שנית, זמן הדגירה הוא גם קריטי בגלל גודל הרקמה. זמן דגירה קצר מדי יפיק חיסון חלש או לא הומוגני (למשל, כתם נכון בפריפריה של הרקמה אך ללא כתמים פנימיים). באופן דומה, שלבי כביסה קצרים מדי ימנעו הסרת נוגדנים שאינם קשורים באופן ספציפי מהרקמה המובילה לכתמים לא ספציפיים. למיטב ידיעתנו, דגירה מורחבת של הרקמה עם נוגדנים אינה פוגעת בכתמים. לכן, אנו ממליצים בחום על דגירה ארוכה ותקופות כביסה. שלישית, הבחירה בפלואורוכרום חייבת להיות מותאמת לאות העניין. בדגימות רקמות באופן כללי, ובמיוחד רקמת שומן לבנה, פלואורסץ אוטומטי זניח ניתן לזיהוי ב 488 צפון צפון ו 555 צפון צפון. עבור חלבונים מבוטאים מאוד זה לא בעיה הכתמים יפעלו היטב בערוצים אלה. עם זאת, עבור חלבונים עם ביטוי נמוך אנו ממליצים בחום על השימוש פלוארוכרום אדום רחוק. עבור ניקוי, אין צעדים קריטיים מאז המתודולוגיה היא פשוטה מאוד. זכור כי מתיל salicylate אינו תואם עם חומרים פלסטיים, ולכן אנו ממליצים בקבוקי זכוכית עבור מדרגות סליקה תא מתכתי מצויד בתחתית זכוכית כדי לבצע את ההדמיה. חלופות להליך הרכבה זה קיימות באמצעות i) מגלשת זכוכית רגילה, שרף שיניים וכיסוי זכוכית (כדי ליצור תא זכוכית קטן), או ii) צלחת פטרי זכוכית (עבור תקינות מיקרוסקופ זקוף).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד 'אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות עבור ה-Labex SIGNALIFE העתידי (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) באמצעות האקדמיה 2 "מתחמי Systèmes" והאקדמיה 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), ואת תוכנית החוקר הצעיר לג'יי.ג'יי (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M במימון קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-מריטיים ו-Région PACA, אשר נתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופ וההדמיה IBISA Côte d'Azur (MICA). אנו מודים למריון דוסוט על העזרה הטכנית בהכנת רקמות. אנו מודים לאבי קאטריס, הנראות המדעית הבינלאומית של UCA, על קריאת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtubes Eppendorff tubes - Dutscher 33528
15 mL plastic tubes Falcon tubes - Dutscher 352096
18 mm round glass coverslip Mariendfeld 0117580
20 mL glass bottle Wheaton 986546
anti-mouse-alexa647-conjugated antibody Jackson ImmunoResearch 715-605-150 Dilution: 1/100
anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Dilution: 1/100
BSA Sigma-aldrich A6003
CD301-PE antibody Biolegend BLE145703 Dilution: 1/100
CD31 antibody AbCam ab215912 Dilution: 1/50
Commercial 3D analysis software - IMARIS Oxford instrument with Cell module
Confocal microscope - Nikon A1R Nikon
Dapi ThermoFisher D1306 Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000
Deoxycholate Sigma-aldrich D6750
DMSO Sigma-aldrich D8418
Glut4 antibody Santa Cruz sc-53566 Dilution: 1/50
Glycine Sigma-aldrich G7126
Lectin-DyLight649 Vector Lab DL-1178-1 Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice
Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber Thermofisher A7816
Methyl salicylate Sigma-aldrich M6752
Perilipin antibody Progen 651156 Dilution: 1/50
Phalloidin-alexa488 ThermoFisher A12379 Dilution: 1/100
TCR-β-PB antibody Biolegend BLE109225 Dilution: 1/100
TH antibody AbCam ab112 Dilution: 1/50
Triton X100 Sigma-aldrich X100
Tween-20 Sigma-aldrich P416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 162 רקמת שומן ניקוי מיקרוסקופיה קלה רקמה שלמה תלת-מימדית השמנת יתר מורפולוגיה
חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gilleron, J., Meziat, C., Sulen, A., … More

Gilleron, J., Meziat, C., Sulen, A., Ivanov, S., Jager, J., Estève, D., Muller, C., Tanti, J. F., Cormont, M. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. J. Vis. Exp. (162), e61640, doi:10.3791/61640 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter