Summary
Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.
Abstract
Murine colitis modellen zijn hulpmiddelen die uitgebreid worden gebruikt in studies gericht op het begrijpen van de pathobiologie van inflammatoire darmaandoeningen. Er moeten echter nog robuuste normen worden vastgesteld voor objectieve en reproduceerbare kwantificering van de ernst van de ziekte. De meeste colitis-analysemethoden zijn gebaseerd op beperkte histologische scoring van kleine darmsegmenten, wat leidt tot gedeeltelijke of bevooroordeelde analyses. Hier combineren we beeldverwerving met hoge resolutie en longitudinale analyse van de hele dikke darm om darmletsel en ulceratie te kwantificeren in het door dextrannatriumsulfaat (DSS) geïnduceerde model van muriene colitis. Dit protocol maakt het mogelijk om objectieve en reproduceerbare resultaten te genereren zonder uitgebreide gebruikerstraining. Hier bieden we uitgebreide details over monstervoorbereiding en beeldanalyse aan de hand van voorbeelden van gegevens van DSS-geïnduceerde colitis. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere modellen muriene colitis die significante ontsteking hebben geassocieerd met mucosale letsel. We tonen aan dat de fractie ontstoken/gewond en geërodeerd/gezwollen slijmvlies ten opzichte van de volledige lengte van de dikke darm nauw parallel loopt met klinische bevindingen zoals gewichtsverlies te midden van DSS-geïnduceerde ziekteprogressie. Dit histologische protocol biedt een betrouwbare tijd en kosteneffectieve hulp om analyses van ziekteactiviteit op een onbevooroordete manier te standaardiseren in DSS-colitis-experimenten.
Introduction
De gastro-intestinale epitheelbarrière speelt een cruciale rol bij het scheiden van luminale antigenen en pathogenen van onderliggende weefselcompartimenten1. Epitheliaal letsel en mucosale wonden gezien in pathologische aandoeningen zoals inflammatoire darmziekte (IBD), ischemie of chirurgisch letsel worden geassocieerd met klinische symptomen zoals diarree, gewichtsverlies, bloed in de ontlasting en buikpijn. Als reactie op letsel migreren en verspreiden epitheelcellen zich om mucosale barrièredefecten opnieuw te epithelialiseren en te herstellen. Oplossing van ontsteking en restitutie van mucosale integriteit zijn cruciaal voor het herstellen van intestinale mucosale homeostase en functie2,3,4.
Verschillende diermodellen zijn gebruikt om de onderliggende moleculaire mechanismen te bestuderen die verband houden met de schade aan de intestinale epitheelbarrière. Gevestigde en gemakkelijk toepasbare modellen van chemisch geïnduceerde colitis worden veel gebruikt, met name in studies met betrekking tot ontstekingsletsel zoals IBD. Een gemeenschappelijk, reproduceerbaar en betrouwbaar murine colitis model maakt gebruik van dextran natriumsulfaat (DSS) gemedieerde darmletsel en ontsteking. De ernst van de ziekte varieert afhankelijk van de muisstam, dosis DSS, de duur van de toediening van DSS en het molecuulgewicht van DSS5,6,7.
Intestinale mucosale schade tijdens DSS-colitis wordt meestal geëvalueerd met behulp van de Disease Activity Index (DAI), een samengestelde score die wordt bepaald door gewichtsverlies, fecaal bloedgehalte en ontlastingsconsistentie. Het fecale bloedgehalte kan microscopisch (gedetecteerd met behulp van een guaiaczuurtest in de ontlasting) of macroscopisch zijn; fecale consistentie wordt geclassificeerd als hard, zacht of vloeibaar (d.w.z. diarree)5,8. Het scoren van deze klinische parameters kan subjectief zijn en kan variëren afhankelijk van de ervaring en bias van de gebruiker, hoewel de gegevens over het algemeen betrouwbare informatie bieden en dus veel worden gebruikt door IBD-onderzoekers. Daarentegen is er geen algemeen aanvaarde methode voor histologische evaluatie van mucosale schade. Meestal worden geselecteerde delen van de dikke darm geïnspecteerd door een getrainde patholoog en gescoord op basis van verschillende parameters, waaronder crypteletsel en leukocyteninfiltratie9,10,11. Omdat het aantal onderzochte parameters en de hoeveelheid geanalyseerd weefsel echter aanzienlijk varieert tussen individuele rapporten, is de vergelijkbaarheid van veel gepubliceerde studies beperkt. Om de bias van waarnemers te verminderen en de concordantie tussen studies te verbeteren, moet een ideaal histologisch scoreprotocol: 1) de volledige lengte van de dikke darm omvatten, omdat darmslijmvliesontsteking meestal variabel is en skip-laesies gebruikelijk zijn, 2) analyse beperken tot specifieke sleutel en gemakkelijk interpreteerbare parameters om subjectiviteit te verminderen, 3) snelle, consistente verwerking van grote aantallen monsters vergemakkelijken en 4) breed beschikbare en betaalbare tools gebruiken voor het verzamelen, analyseren en presenteren van gegevens.
Hier beschrijven we een techniek om de hele dikke darm of lange segmenten van de dunne darm te verwerken in een "Swiss roll" -configuratie, samen met het gebruik van een gratis computerondersteund scoresysteem om darmslijmvliesontsteking en schade als gevolg van DSS-geïnduceerde colitis te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Committee on the Use and Care of Animals van de Universiteit van Michigan.
1. Weefseloogst
- Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie, in overeenstemming met goedgekeurde protocollen. Voor alle dierproeven is goedkeuring verkregen door een gecertificeerde beoordelingscommissie in overeenstemming met de nationale en institutionele richtlijnen voor de behandeling van dieren.
- Plaats de muis op een ontleedkussen in een liggende positie. Immobiliseer de uiteinden van de muis met naalden van 20 G x 1 1/2 inch G.
- Maak met een tang en schaar een kleine incisie op de buikhuid en trek deze naar de zijkant om het buikvlies bloot te leggen.
- Open de buikholte met een middellijnincisie in het buikvlies van het schaambeen naar de zijkanten van de buik.
- Verwijder voorzichtig weefsels en organen totdat de dikke darm wordt gevisualiseerd. Snijd het bekkenbeen aan beide zijden van de dikke darm om het orgaan volledig te visualiseren, dat zich uitstrekt van de anus naar het cecum.
- Verwijder voorzichtig vet, kleine aderen en slagaders die aan de dikke darm zijn bevestigd, terwijl u het orgaan voorzichtig ontleedt, snijd gewoon proximaal naar de anus en gewoon distaal naar het cecum.
OPMERKING: De ontlede dikke darm moet op kamertemperatuur blijven tijdens het voltooien van de Zwitserse rolprocedure. - Spoel de dikke darm voorzichtig door met 1x PBS, met behulp van een flexibele plastic galnaald die door de anus wordt ingebracht om fecale inhoud te verwijderen.
- Plaats de dikke darm in een rechte lijn en open in de lengterichting langs de mesenterische slagader. Bisect de dikke darm in de lengterichting van het distale naar het proximale uiteinde (figuur 1A). De ene helft van het weefsel kan worden gebruikt voor histologische analyse, terwijl de andere kan worden verwerkt voor westerse vlek, PCR of gerold in een tweede Zwitserse rol voor verse bevroren immunofluorescentiemicroscopie12.
2. Bereiding van Zwitserse broodjes
- Knip extra weefsel uit de proximale dikke darm met behulp van een scheermesje totdat ongeveer dezelfde breedte over de lengte van de hele dikke darm is verkregen.
- Lijn de dikke darm uit om het lumen naar boven te laten zien en maak het weefsel volledig plat met behulp van een flexibele galnaald. Voeg indien nodig meer PBS toe om het weefsel vochtig te houden tijdens de procedure.
- Verwijder het teveel aan PBS met een papieren doekje. Voeg met een spuit en gavage naald 10% neutrale gebufferde formalineoplossing toe over het weefsel gedurende 2-3 minuten om het weefsel te fixeren en af te vlakken.
- Gebruik rechte tangen om het uiteinde van de distale dikke darm te grijpen en draai de dikke darm in concentrische cirkels van het distale naar proximale uiteinde (Figuur 1B).
OPMERKING: Het is mogelijk om de binnenkant van de Zwitserse rol terug te duwen tijdens het rollen met behulp van de wesvinger om ervoor te zorgen dat het weefsel zich in de rol bevindt. - Steek een naald van 27 G om de dikke darm in het midden vast te pinnen om de Zwitserse rolvorm vast te houden (figuur 1C).
- Plaats de Zwitserse rol met de naald in een insluitcassette in een histologische monstercontainer.
OPMERKING: Weefsel moet vóór de fixatie parallel ten opzichte van de cassette worden georiënteerd (figuur 1D). - Bevestig het weefsel in 10% neutrale gebufferde formalineoplossing 's nachts bij 4 °C13.
- Was het weefsel na een nachtfixatie 3x met PBS.
- Voeg 70% ethanol toe aan het weefsel voorafgaand aan het inbeddingsproces van paraffine. Verwijder de naald van de Zwitserse rol voordat u verder gaat. Weefsel kan bij kamertemperatuur in ethanol worden bewaard tot inbedding van paraffine13.
- Plaats monsters in de weefselprocessor, sluit in paraffine in en bereid 4 secties van μm voor, gemonteerd op positief geladen microscopieglaasjes (figuur 1E). Dit kan een optioneel stoppunt zijn.
OPMERKING: Een goede weefseloriëntatie is van cruciaal belang om secties te bereiken die geschikt zijn voor beeldanalyse. Parallelle Zwitserse rolinsluiting in de paraffinecassette zal resulteren in volledige secties die geschikt zijn voor beeldanalyse (Figuur 1F-1H). Schuine secties moeten worden vermeden om onvolledige secties te voorkomen (figuur 1I-1K). Zie de sectie Discussie voor meer informatie. - Vleksecties met hematoxyline en eosine (H&E)13.
3. Digitaal scannen en analyseren
OPMERKING: Selecteer voor een nauwkeurige evaluatie van mucosale veranderingen alleen secties die ten minste 90% van de totale lengte van de dikke darm bevatten.
- Bevlekte secties scannen met behulp van een diascanner of imager (zie Tabel met materialen). Geproduceerde beelden hebben een resolutie van 0,25 micron per pixel nodig met 40x objectief en 40x vergroting.
- Installeer en download een geschikte software voor digitale analyse van gescande dia's (zie Tabel met materialen).
- Scanafbeeldingen openen in de beeldverwerkingssoftware (afbeelding 2A). Controleer of de hele dubbele punt zichtbaar is en of er geen ontbrekende gebieden van het monster zijn.
- Activeer de gereedschappen labelafbeelding en schaalbalk om gescande dia's correct te identificeren door op Afbeelding labelen (afbeelding 2A)te klikken.
- Open het gereedschap Annotaties door op Annotaties(Figuur 2A) te klikken en maak 3 verschillende lagen door op Nieuwe laag (figuur 2B) te klikken om de totale lengte van de Zwitserse rol, ontsteking / letsel en erosie / ulceratie te kwantificeren. Kies een andere kleur voor elke laag door op Laagkleur (afbeelding 2B)te klikken.
- Meet de lengte van elke laag/categorie door op het gereedschap Pen (figuur 2A) te klikken, met behulp van het muscularis-slijmvlies als referentie:
- Bekijk de afbeelding met een zoom van 400 μm (of meer) om een adequate visualisatie van het muscularis-slijmvlies te vergemakkelijken.
OPMERKING: De vergroting kan eenvoudig worden geregeld met behulp van het scrollwiel van de muis en moet zo nodig worden aangepast terwijl u over de sectie beweegt om alle lijnen te tekenen. - Klik op het gereedschap Pen om een lijn te tekenen na het muscularis-slijmvlies (figuur 2A). Verplaats de aanwijzer indien nodig om het aangrenzende gebied te visualiseren voor analyse.
OPMERKING: Telkens wanneer de pen wordt gestopt, wordt een klein nieuw laaggebied gegenereerd. Het kan worden gevisualiseerd en bewerkt met het tabblad Laaggebieden (selecteer het gewenste segment en klik op Laag verwijderen in geval van fouten of correcties, figuur 2B).
- Bekijk de afbeelding met een zoom van 400 μm (of meer) om een adequate visualisatie van het muscularis-slijmvlies te vergemakkelijken.
- Zodra alle lagen (figuur 2C) zijn gedefinieerd, exporteert u de gegevens met behulp van de knop Raster exporteren naar tekstbestand in de opties voor laaggebieden ( figuur2B).
OPMERKING: Sla bestanden vaak op tijdens het maken van de lagen om ervoor te zorgen dat gegevens correct worden opgeslagen. - Open de tekstbestanden en kopieer de gegevens met een spreadsheetsoftware. Totaal alle segmenten uit elke regio en bereken het percentage letsel en ulceratie met betrekking tot de totale lengte.
- Om de Histologische Colitis Score (HCS) te berekenen en de ernst van de ziekte te evalueren, moet u drie hoofdkenmerken overwegen zoals hieronder beschreven.
- Controleer op gezond darmslijmvlies dat wordt gekenmerkt door georganiseerde epitheelcellen in de crypt-luminale as, lamina propria met weinig immuuncellen en subjacent muscularis mucosa dat het slijmvlies en submucosa met elkaar in contact brengt (Figuur 3A).
- Controleer op ontsteking/letsel dat wordt gekenmerkt door epitheliale crypten die verzwakt zijn of gedeeltelijk ontbrekende epitheelcellen en mucosale ontsteking met neutrofiele infiltratie in crypten (Figuur 3B).
- Controleer op de aanwezigheid van erosie/ulceratie die wordt gekenmerkt door gebieden zonder oppervlakte-epitheel of gebieden die volledig ontbreken aan epitheliale crypten met of zonder geassocieerde leukocyten (Figuur 3C).
- Bereken HCS van gewonde en gezwollen gebieden uitgedrukt als een percentage van de totale lengte in de volgende formule:
OPMERKING: HCS combineert het percentage ontsteking/letsel en erosie/ulceratie en voegt een factor twee toe aan de laatste, op basis van een redelijke veronderstelling dat volledig verlies van het epitheel resulteert in maximaal verlies van barrière-integriteit en dus ergere ziekte. HCS vertegenwoordigt consequent de morfologische veranderingen veroorzaakt door DSS geïnduceerde experimentele colitis. Interessant is dat we geen duidelijke correlatie hebben gezien tussen het aantal colonische lymfoïde aggregaten of follikels en de ernst van de klinische ziekte bij DSS-colitis en daarom hebben we de kwantificering niet in deze analyse opgenomen. - Maak een momentopname van de representatieve afbeeldingen (klik op Momentopname, Figuur 2A) en sla op. Voeg indien nodig schaalbalken toe door te klikken op Schaalbalk weergeven/verbergen (afbeelding 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de betrouwbaarheid van deze Histologische Colitis Score Analyse te illustreren in de context van mucosale schade na DSS uitdaging en daaropvolgend herstel van colitis, hebben we 2,5% DSS toegediend in het drinkwater van acht 10 weken oude mannelijke C57BL6 wilde type muizen gedurende 5 dagen gevolgd door een herstelperiode met regelmatig water gedurende 5 dagen. Er was geen verandering in lichaamsgewicht tijdens de acute toediening van DSS, van dag 0 tot 5 (figuur 4A). Het lichaamsgewicht nam drastisch af na dag 5, toen muizen regelmatig kraanwater begonnen te drinken. Bloed en zachte ontlasting verschenen na 3 dagen DSS-toediening en gingen de daaropvolgende 3 dagen op water door tot dag 8 van het experiment (figuur 4B). Uit deze waarnemingen bleek dat de meest schadelijke effecten van blootstelling aan DSS werden waargenomen tijdens de herstelperiode tussen dag 5 en 8. De meting van de lengte van de dikke darm op dag 10 bevestigde een significante verkorting aan het einde van het experiment (figuur 4C). Colons werden geoogst op dag 0, 2, 5, 7, 8 en 10 om paraffine Zwitserse broodjes te maken. Weefsel werd gekleurd met H&E en high-definition scans (Figuur 4D) werden geanalyseerd om de Histologische Colitis Score (Figuur 4E) en het percentage letsel en ulceratie (Figuur 4F) te berekenen.
Figuur 4D toont een normale cryptearchitectuur bij onbehandelde C576BL6 muizen, oppervlakkig aan het muscularis mucosa en ondersteund door de lamina propria (dag 0, pijl). Na 2 dagen DSS-toediening werd immuuncelwerving waargenomen (dag 2, pijl). Op dag 5 verschenen epitheelcellen beschadigd en was er een infiltratie van neutrofielen in het epitheel (cryptitis) geassocieerd met epitheliale verwonding (dag 5, pijl). Vanaf dag 5 tot 8 werden gebieden van epitheelverlies met ontsteking en ulceratie opgemerkt (dag 7 en 8, pijlen). Dit laatste wordt vaak waargenomen als de muizen regelmatig kraanwater drinken tijdens de herstelfase. Ten slotte beginnen epitheelcellen gezwollen gebieden te regenereren en opnieuw te bevolken, waardoor het darmslijmvlies op dag 10 langzaam wordt hersteld (pijl).
HCS weerspiegelt nauw de eenvoudige beoordeling van het percentage ontsteking/letsel en erosie/ulceratie, en beide tonen kwantitatief aan dat er aanzienlijke schade is aan de dikke darm van muizen tijdens het herstel van DSS op dag 5 tot 10, wat correleert met epitheliale erosies en leukocyteninfiltratie zoals weergegeven in figuur 4D. Gegevens verstrekt door HCS maken onderscheid tussen de ernst van de ziekte met betrekking tot ontsteking geassocieerd met epitheliaal letsel versus erosie / ulceratie.
Deze observaties tonen aan dat het in dit protocol voorgestelde systematische scoresysteem van HCS een betrouwbaar instrument is om mucosale schade te kwantificeren.
Figuur 1: Monstervoorbereiding is cruciaal voor nauwkeurige gegevensanalyse. (A) Distale dikke darm volledig verlengd en geopend langs de mesenterische slagader. (B) Zwitsers walsproces. (C) Naaldinbrengen om zwitserse rolvorm (D) paraffine insluitcassette vast te houden. Paraffineblok. (F) Zwitserse rol parallelle oriëntatie om gedeeltelijke secties te voorkomen. (G) Complete Zwitserse rol, schaalbalk: 2 mm. (H) Ideale doorsnede van colonische crypten, schaalbalk: 80 μm. (I) Schuine Zwitserse rolrichting. (J) Onvolledige Zwitserse rol, schaalbalk: 2mm. (K) Schuine sectie van colonische crypten, schaalbalk: 80 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve evaluatie van mucosale schade. (A) Basisgereedschapsbalk met snapshot, zoomschuifregelaar, toon/verberg schaalbalk/assen/raster, labelafbeelding, annotaties en pengereedschapfuncties, onder andere. (B) Annotaties menu met laagkleur, nieuwe laag, verwijderlaag, toon/verberg laag, verwijder gebied en exporteer raster naar tekstbestandknoppen. (C) Overzicht van de totale lengte, gewonde en gezwollen lagen, schaalbalk: 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van het darmslijmvlies van muizen bevlekt met hematoxyline & eosine na acute DSS-experimentele colitis gevolgd door herstel. (A) Gezonde darmcellen georganiseerd in colonische crypten omgeven door lamina propria en gescheiden van de submucosa door het muscularis-slijmvlies, schaalbalk: 200 μm. (B) Acute mucosale ontsteking of letsel met infiltratie van neutrofielen in het slijmvlies en crypte-epitheel, geassocieerd met crypte epitheliale vervorming/verlies en epitheliale demping, schaalbalk: 200 μm. (C) Gezwollen of geërodeerde gebieden met volledig epitheelverlies en bijbehorende ontsteking., schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie te bekijken.
Figuur 4: Histologische Colitis Score en percentage letsel en ulceratie correleert met lichaamsgewicht en ontlastingsindex tijdens DSS experimentele colitis: (A) Lichaamsgewicht en (B) ontlastingsindexen worden dagelijks geëvalueerd bij wilde muizen behandeld met 2,5% DSS gedurende 5 dagen (rode lijn), gevolgd door 5 dagen herstel op water (zwarte lijn). De gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten met ten minste 4 muizen per groep en worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Significantie wordt bepaald door tweerichtingsvergelijking tussen ANOVA en Sidak, *p<0.033, **p<0.002 en ***p<0.001. (C) De lengte van de dikke darm van muizen werd gemeten op dag 10. De gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten met ten minste 3 muizen per groep en worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. De significantie wordt bepaald door de t-test van de student met twee staarten, ***p<0.001. (D) Hematoxyline en eosine (H&E)-bevlekte weefselsecties van het darmslijmvlies werden geanalyseerd om te berekenen, schaalbalken: 60 μm. (E) Histologische Colitis Score (HCS) en percentage letsel/ulceratie ten opzichte van de lengte van de dikke darm. De gegevens zijn representatief voor twee experimenten met 2 muizen per groep en worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Significantie wordt bepaald door eenrichtingsvergelijking tussen ANOVA en Tukey, *p<0,033, **p<0,002 en ***p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons Histologisch Colitis Score systeem is een betrouwbaar hulpmiddel om weefselontsteking en schade in de darm te kwantificeren. Deze benadering biedt een beter begrip van de histopathologische toestand van het hele orgaan zonder de bias van het selecteren van kleine gebieden of onvolledige secties. Een van de kritieke stappen om dit protocol met succes uit te voeren, is een goede voorbereiding van Zwitserse rollen die analyse van ten minste 90% van de lengte van de dikke darm mogelijk maken; parallelle oriëntatie tijdens paraffinebedding en doorsneden om rechte en uniforme weefselsecties met longitudinale weergaven van epitheliale crypten te garanderen; oefenen en trainen onder begeleiding van een ervaren patholoog om te bevestigen dat cursisten de verschillen identificeren tussen acute ontsteking, epitheliaal letsel en erosie / ulceratie; en toegang tot een digitale scanner met hoge resolutie.
Kleine aanpassingen en probleemoplossing zijn nodig om de Zwitserse rol op de juiste manier te oriënteren tijdens het insluiten van paraffine en tijdens het doorsnijden om ervoor te zorgen dat het weefsel parallel is georiënteerd ten opzichte van de paraffinecassette en het mes (figuur 1E-F). Als u zich aan deze ruimtelijke oriëntatie houdt, vermindert u het aantal onvolledige secties. Als de dikke darm perfect op zichzelf is gerold, bevinden de beste secties, waaronder het grootste deel van de weefsellengte, zich in het midden van de Zwitserse rol(figuur 1F). Het verzamelen van verschillende secties verhoogt de kans op het verkrijgen van goed georiënteerde secties waar de volledige lengte van de crypten zichtbaar is aanzienlijk (Figuur 1G-H). Vermijd het doorsnijden van schuine Zwitserse rollen (Figuur 1I-J), gekenmerkt door cirkelvormige crypten of cryptedonuts (Figuur 1K). Vaak wordt visualisatie van de secties verzameld onder de microscoop sterk aanbevolen om een goede techniek te garanderen. Een goede sectie legt de hele lengte van de dikke darm vast.
Elk instrument dat het mogelijk maakt om de volledige lengte van de Zwitserse rol vast te leggen en de resolutie biedt die nodig is om het weefsel te vergroten om de cryptearchitectuur te visualiseren, is voldoende voor evaluatie van de HCS. Sommige microscopen maken de overlapping van kleine beelden mogelijk en reconstrueren hele weefselsecties. De resolutie van deze beelden kan echter slecht zijn na toenemende vergroting om het weefsel te scoren. Bovendien is de overlapping van secties mogelijk niet perfect, waardoor gebieden van weefsel achterblijven die niet goed gedefinieerd zijn en onmogelijk nauwkeurig kunnen scoren.
Een van de voordelen van het hier voorgestelde scoreprotocol is de classificatie van het weefsel in slechts twee categorieën ontsteking / letsel of erosie / ulceratie. Dit vereenvoudigt en versnelt de classificatie van weefselschade, terwijl de reproduceerbaarheid toeneemt. De software die voor de analyse wordt gebruikt, is toegankelijk, gratis en gemakkelijk te gebruiken. HCS weerspiegelt nauwkeurig mucosale schade, omdat het het mogelijk maakt om gezwollen gebieden over de hele lengte van de dikke darm te kwantificeren en op de juiste manier meer gewicht biedt aan deze pathologie dan ontstoken, niet-gezwollen gebieden. Dit wordt duidelijk weerspiegeld wanneer de HCS-gegevens worden vergeleken met het percentage letsel/ulceratie (figuur 4E-F). Het scoren van elk monster duurt ongeveer 40 minuten. Met de juiste training, toegang tot gescande dia's, een computer en de software kunnen de meeste onderzoekers de analyse uitvoeren. Het is echter altijd raadzaam om scoreresultaten te bevestigen met een patholoog om nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te garanderen. Beoordeling van darmontsteking kan worden uitgevoerd met elke software die een hoge resolutie vergroting van dia's en lengtemetingen mogelijk maakt; voor de eenvoud hebben we ons echter in dit protocol gericht op de software die wordt vermeld in de tabel met materialen.
We hebben dit scoresysteem gebruikt om met succes ziekte te analyseren in verschillende DSS-colitis-experimenten. Kelm et al.14 onderzochten bijvoorbeeld het belang van glycosylatie van CD44v6, een belangrijke regulator van epitheliale migratie en proliferatie, met behulp van een nieuw antilichaam (GM35). Ze toonden verminderde ziekteactiviteitsindexscore en verbeterde HSC bij muizen die werden uitgedaagd met acute DSS na targeting van sialyl lewis A glycanen op epitheliale CD44v6, wat het belang bevestigt van post translationele modificatie van CD44-varianten voor herstel na DSS geïnduceerd letsel14. In een ander voorbeeld gebruikten Reed et al.15 een chronisch DSS-model om mucosale letsel en reparatie bij muizen te bestuderen met een epitheliale specifieke deletie van CD47, een transmembrane-eiwit dat belangrijk is voor ontstekings- en reparatieprocessen. Colonscans werden geanalyseerd en gescoord om het percentage letsel en ulceratie te berekenen zoals hierboven beschreven, wat een duidelijk verminderde mucosale reparatie aantoont bij muizen zonder epitheliale CD4715. Het chronische colitismodel in dit rapport gebruikte cyclische toediening van DSS om letsel en herstel in de loop van de tijd te analyseren.
Aanvullende publicaties van onze groep en anderen hebben de voordelen van dit scoresysteem en de correlatie met klinische symptomen6,16,17aangetoond . Dit protocol beschrijft in detail hoe u Zwitserse rollen kunt bereiden en scoren, met behulp van gratis en gemakkelijk toegankelijke software. De eenvoud van de hier voorgestelde score is gebaseerd op het gebruik van slechts twee categorieën (ontsteking/letsel of erosie/ulceratie) in gescande dia's om het scoringsproces te vergemakkelijken en de reproduceerbaarheid te vergroten. Belangrijk is dat het hier beschreven scoresysteem ook correleert met klinische parameters van darmontsteking. Concluderend, de Histologische Colitis Score is een hulpmiddel dat kan worden gebruikt om DSS-colitis kwantitatief te scoren en kan worden toegepast op andere colitismodellen die verband houden met ontsteking en epitheliale verwonding / verlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen steun van NIH-financiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 en de University of Michigan Pathology Slide Scanning Services erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
