Summary
التهديف المنهجي لالتهاب الأمعاء باستخدام نظام مجاني بمساعدة الكمبيوتر هو أداة قوية لمقارنة التغيرات الهسطولوجية كميا في نماذج التهاب القولون التي تتميز بوجود القرحة والتغيرات الالتهابية. يعزز تقييم نقاط التهاب القولون النسيجي الملاحظات السريرية ويسهل تفسير البيانات.
Abstract
نماذج التهاب القولون مورين هي الأدوات التي تستخدم على نطاق واسع في الدراسات التي تركز على فهم علم الأحياء المرضية للاضطرابات المعوية الالتهابية. ومع ذلك، لا يزال يتعين تحديد معايير قوية للقياس الكمي الموضوعي والتكراري لشدة المرض. تعتمد معظم طرق تحليل التهاب القولون على تسجيل الهسهولوجيا المحدود لقطاعات صغيرة من الأمعاء ، مما يؤدي إلى تحليلات جزئية أو متحيزة. هنا، ونحن الجمع بين الحصول على صورة عالية الدقة والتحليل الطولي للقولون بأكمله لتحديد إصابة الأمعاء والتقرح في كبريتات الصوديوم dextran (DSS) النموذج المستحث من التهاب القولون مورين. يسمح هذا البروتوكول بتوليج نتائج موضوعية وقابلة للاستنساخ دون تدريب مكثف للمستخدم. هنا، نقدم تفاصيل شاملة عن إعداد العينات وتحليل الصور باستخدام أمثلة من البيانات من التهاب القولون المستحث DSS. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع النماذج الأخرى لالتهاب القولون المورين التي لديها التهاب كبير مرتبط بإصابة المخاطية. نحن نثبت أن جزء من الغشاء المخاطي الملتهب / المصاب والمتآكل / المتقرح نسبة إلى الطول الكامل للقولون يوازي بشكل وثيق النتائج السريرية مثل فقدان الوزن وسط تطور المرض الناجم عن DSS. يوفر هذا البروتوكول النسيجي وقتا موثوقا ومساعدة فعالة من حيث التكلفة لتوحيد تحليلات نشاط المرض بطريقة غير متحيزة في تجارب التهاب القولون DSS.
Introduction
الحاجز الظهاري المعدي المعوي يلعب دورا محوريا في فصل المستضدات الإنارة ومسببات الأمراض من مقصورات الأنسجة الكامنة1. ترتبط الإصابات الظهارية والجروح المخاطية التي تظهر في الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) أو نقص التروية أو الإصابة الجراحية بالأعراض السريرية التي تشمل الإسهال وفقدان الوزن والدم في البراز وآلام البطن. استجابة للإصابة، تهاجر الخلايا الظهارية وتتكاثر لإعادة ظهارة وإصلاح عيوب الحاجز المخاطي. حل الالتهاب ورد سلامة المخاطية حاسمة لإعادة تأسيس التوازن المخاطي المعوي ووظيفة2،3،4.
وقد استخدمت نماذج حيوانية مختلفة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة التي ترتبط مع الأضرار التي لحقت الحاجز الظهاري المعوي. تستخدم على نطاق واسع نماذج راسخة وسهلة التطبيق من التهاب القولون المستحث كيميائيا ، لا سيما في الدراسات المتعلقة بالإصابة الالتهابية مثل IBD. نموذج التهاب القولون مورين المشتركة، القابلة للاستنساخ، وموثوق بها توظف كبريتات الصوديوم dextran (DSS) بوساطة إصابة القولون والالتهاب. تختلف شدة المرض اعتمادا على سلالة الماوس وجرعة DSS وطول إدارة DSS والوزن الجزيئي ل DSS5و6و7.
عادة ما يتم تقييم تلف المخاط المعوي أثناء التهاب القولون DSS باستخدام مؤشر نشاط المرض (DAI) ، وهي درجة مركبة يحددها فقدان الوزن ، ومحتوى دم البراز ، واتساق البراز. محتوى الدم البراز يمكن أن تكون مجهرية (الكشف عن استخدام اختبار حمض غواياك البراز) أو العياني; يصنف الاتساق البرازي على أنه صلب أو ناعم أو سائل (أي الإسهال)5،8. يمكن أن يكون تسجيل هذه المعلمات السريرية ذاتيا وقد يختلف اعتمادا على تجربة المستخدم وتحيزه ، على الرغم من أن البيانات توفر بشكل عام معلومات موثوقة وبالتالي يستخدمها باحثو IBD على نطاق واسع. وعلى النقيض من ذلك، لا توجد طريقة مقبولة عموما للتقييم النسيجي للضرر المخاطي. الأكثر شيوعا، يتم فحص مناطق مختارة من القولون من قبل أخصائي أمراض مدرب وسجل على أساس العديد من المعلمات التي عادة ما تشمل إصابة سرداب وتسلل الكريات البيض9،10،11. ومع ذلك، لأن عدد المعلمات التي تم التحقيق فيها وكمية الأنسجة التي تم تحليلها يختلف بشكل كبير بين التقارير الفردية، فإن قابلية مقارنة العديد من الدراسات المنشورة محدودة. للحد من التحيز المراقب وتعزيز التوافق بين الدراسات، وبروتوكول التهديف النسيجي المثالي ينبغي: 1) تشمل طول القولون بأكمله، والتهاب المخاطية المعوية في معظم الأحيان متغير وتخطي الآفات شائعة، 2) الحد من التحليل إلى مفتاح محدد والمعلمات قابلة للتفسير بسهولة للحد من الذاتية، 3) تسهيل المعالجة السريعة والمتسقة لأعداد كبيرة من العينات، و 4) استخدام أدوات متاحة على نطاق واسع وبأسعار معقولة للحصول على البيانات والتحليل والعرض.
هنا نحن نصف تقنية لمعالجة القولون بأكمله أو أجزاء طويلة من الأمعاء الدقيقة في تكوين "لفة السويسرية" جنبا إلى جنب مع استخدام نظام تسجيل مجاني بمساعدة الكمبيوتر لتحليل التهاب المخاطية المعوية والضرر بسبب التهاب القولون الناجم عن DSS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة استخدام الحيوانات ورعايتها في جامعة ميشيغان.
1. حصاد الأنسجة
- القتل الرحيم الفئران بطريقة إنسانية باستخدام التخدير isoflurane تليها خلع عنق الرحم، وفقا للبروتوكولات المعتمدة. وبالنسبة لجميع التجارب على الحيوانات، حصل مجلس مراجعة معتمد على الموافقة وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية لمناولة الحيوانات.
- ضع الماوس على لوحة تشريح في وضعية غير صحيح. شل حركة أطراف الماوس باستخدام إبر G 20 G x 1 1/2 بوصة.
- باستخدام ملقط ومقص، وجعل شق صغير على جلد البطن وسحبه إلى الجانب لفضح الصفاق.
- افتح تجويف البطن مع شق خط الوسط في الصفاق من عظم العانة إلى جانبي البطن.
- إزالة الأنسجة والأعضاء بعناية حتى يتم تصور الأمعاء الغليظة. قطع عظم الحوض على جانبي القولون لتصور كامل للجهاز، وتمتد من فتحة شج نحو cecum.
- إزالة الدهون بلطف، الأوردة الصغيرة والشرايين تعلق على القولون، في حين تشريح بعناية الجهاز، وقطع قريبة فقط إلى فتحة الجج والقاصر فقط إلى الكوم.
ملاحظة: يجب أن تظل القولون تشريح في درجة حرارة الغرفة أثناء إكمال الإجراء لفة السويسرية. - مسح بعناية القولون مع برنامج تلفزيوني 1x، وذلك باستخدام إبرة الغافاج البلاستيك مرنة إدراجها من خلال فتحة الشرج لإزالة محتويات البراز.
- وضع القولون في خط مستقيم، وفتح طوليا على طول الشريان المتوسطي. تقسيم القولون طوليا من البعيدة إلى الطرف القريب (الشكل 1A). نصف الأنسجة يمكن استخدامها للتحليل النسيجي في حين يمكن معالجة الآخر للطخة الغربية, PCR أو تدحرجت في لفة السويسرية الثانية لمجهر المناعة المجمدة الطازجة12.
2. إعداد اللفائف السويسرية
- تقليم الأنسجة الزائدة من القولون القريب باستخدام شفرة حلاقة حتى يتم الحصول على نفس العرض تقريبا على طول القولون كله.
- محاذاة القولون لفضح التجويف التي تواجه المتابعة، وتسطيح الأنسجة تماما باستخدام إبرة الغافاج مرنة. إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني، إذا لزم الأمر، للحفاظ على الأنسجة رطبة طوال العملية.
- إزالة الفائض من برنامج تلفزيوني باستخدام مسح الورق. مع حقنة وإبرة gavage، إضافة 10٪ محايدة العازلة حل الفورماليين على الأنسجة لمدة 2-3 دقيقة لإصلاح وتسطيح الأنسجة.
- استخدام ملقط مستقيم للاستيلاء على نهاية القولون البعيدة وتطور القولون في دوائر متحدة المركز من القاصي إلى نهاية قريبة(الشكل 1B).
ملاحظة: من الممكن أن تدفع إلى الوراء داخل لفة السويسرية في حين المتداول باستخدام السبابة لضمان الأنسجة داخل لفة. - إدراج إبرة 27 G لتثبيت القولون في الوسط لعقد شكل لفة السويسرية(الشكل 1C).
- ضع اللفة السويسرية مع الإبرة في كاسيت تضمين داخل حاوية عينة الأنسجة.
ملاحظة: يجب توجيه الأنسجة بالتوازي مع ما يتعلق بالكاسيت قبل التثبيت(الشكل 1D). - إصلاح الأنسجة في 10٪ محايدة العازلة حل الفورماليين بين عشية وضحاها في 4 °C13.
- بعد التثبيت بين عشية وضحاها، وغسل الأنسجة 3x مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة الإيثانول 70٪ إلى الأنسجة قبل عملية تضمين البارافين. إزالة الإبرة من لفة السويسرية قبل المتابعة. يمكن تخزين الأنسجة في الإيثانول في درجة حرارة الغرفة حتى تضمين البارافين13.
- وضع عينات في معالج الأنسجة، وتضمين في البارافين، وإعداد أقسام 4 ميكرومتر، شنت على الشرائح المجهر مشحونة إيجابيا(الشكل 1E). يمكن أن يكون هذا نقطة توقف اختيارية.
ملاحظة: التوجه السليم للأنسجة أمر بالغ الأهمية لتحقيق المقاطع المناسبة لتحليل الصور. سوف يؤدي تضمين اللفة السويسرية المتوازية في كاسيت البارافين إلى أقسام كاملة تم تخصيصها لتحليل الصور (الشكل 1F- 1H). يجب تجنب المقاطع المائلة لمنع المقاطع غير المكتملة (الشكل 1I-1K). لمزيد من التفاصيل، راجع قسم المناقشة. - أقسام وصمة عار مع الهيماتوكسيلين واليوسين (H &؛ E)13.
3. المسح الضوئي الرقمي والتحليل
ملاحظة: للحصول على تقييم دقيق للتغييرات mucosal حدد المقاطع التي تتضمن 90٪ على الأقل من طول القولون الإجمالي.
- مسح المقاطع الملطخة ضوئيا باستخدام الماسح الضوئي الشريحة أو الصور (انظر جدول المواد). تحتاج الصور المنتجة إلى دقة 0.25 ميكرون لكل بكسل مع هدف 40x وتكبير 40x.
- تثبيت وتنزيل برنامج مناسب للتحليل الرقمي للشرائح الممسوحة ضوئيا (انظر جدول المواد).
- فتح الصور الممسوحة ضوئيا في برنامج معالجة الصور(الشكل 2A). تحقق من أن القولون بأكمله مرئية وأنه لا توجد مناطق مفقودة من العينة.
- تنشيط أدوات شريط الصور والمقياس للتسمية لتحديد الشرائح الممسوحة ضوئيا بشكل صحيح بالنقر فوق صور التسمية (الشكل 2A).
- افتح أداة التعليقات التوضيحية بالنقر فوق الشروح،(الشكل 2A)وإنشاء 3 طبقات مختلفة بالنقر فوق طبقة جديدة (الشكل 2B)لتحديد الطول الإجمالي للفة السويسرية ، والالتهاب / الإصابة ، والتآكل / التقرح. اختر لونا مختلفا لكل طبقة بالنقر فوق لون الطبقة (الشكل 2B).
- قياس طول كل طبقة / فئة من خلال النقر على أداة القلم (الشكل 2A)، وذلك باستخدام الغشاء المخاطي العضلات كمرجع:
- عرض الصورة في 400 ميكرومتر التكبير (أو أكثر) لتسهيل التصور الكافي للغشاء المخاطي العضلات.
ملاحظة: يتم التحكم في التكبير بسهولة باستخدام عجلة التمرير الماوس وسوف تحتاج إلى ضبط حسب الضرورة أثناء التحرك عبر المقطع لرسم كافة الخطوط. - انقر على أداة القلم لرسم خط بعد الغشاء المخاطي العضلات (الشكل 2A). حرك المؤشر حسب الحاجة لتصور المنطقة المجاورة للتحليل.
ملاحظة: في كل مرة يتم إيقاف القلم، سيتم إنشاء منطقة طبقة جديدة صغيرة. يمكن تصور وتحريرها مع علامة التبويب مناطق الطبقة (حدد الجزء المطلوب وانقر فوق حذف الطبقة في حالة حدوث أخطاء أو تصحيحات ، الشكل 2B).
- عرض الصورة في 400 ميكرومتر التكبير (أو أكثر) لتسهيل التصور الكافي للغشاء المخاطي العضلات.
- بمجرد تحديد جميع الطبقات (الشكل 2C) ، قم بتصدير البيانات باستخدام زر تصدير الشبكة إلى ملف نصي داخل خيارات مناطق الطبقة(الشكل 2B).
ملاحظة: حفظ الملفات غالبا أثناء إنشاء الطبقات لضمان تخزين البيانات بشكل صحيح. - افتح الملفات النصية وانسخ البيانات باستخدام برنامج جدول بيانات. مجموع جميع شرائح من كل منطقة وحساب النسبة المئوية للإصابة والتقرح فيما يتعلق بالطول الكلي.
- لحساب نقاط التهاب القولون النسيجي (HCS) وتقييم شدة المرض ، والنظر في ثلاث خصائص رئيسية على النحو المفصل أدناه.
- تحقق من وجود الغشاء المخاطي المعوي السليم الذي يتميز بالخلايا الظهارية المنظمة في المحور المضيء سرداب، بروبريا الصفيحة مع عدد قليل من الخلايا المناعية، والغشاء المخاطي العضلي subjacent الذي واجهات الغشاء المخاطي والغشاء المخاطي(الشكل 3A).
- التحقق من وجود التهاب / إصابة التي تتميز سرداب الظهارية التي هي مخففة أو مفقودة جزئيا الخلايا الظهارية والتهاب المخاطية مع تسلل العدلات إلى سرداب (الشكل 3B).
- التحقق من وجود تآكل / تقرح الذي يتميز مناطق خالية من ظهارة السطح أو المناطق التي تفتقر تماما سرداب الظهارة مع أو بدون الكريات البيض المرتبطة بها (الشكل 3C).
- حساب HCS من المناطق المصابة والمقرحة التي أعرب عنها كنسبة مئوية من الطول الإجمالي في الصيغة التالية:
ملاحظة: يجمع HCS بين النسبة المئوية للالتهاب / الإصابة والتآكل / التقرح إضافة عامل اثنين إلى الأخير ، استنادا إلى افتراض معقول بأن فقدان الظهارة الكامل يؤدي إلى أقصى قدر من فقدان سلامة الحاجز وبالتالي أسوأ مرض. يمثل HCS باستمرار التغيرات المورفولوجية الناجمة عن التهاب القولون التجريبي الناجم عن DSS. ومن المثير للاهتمام، أننا لم نر علاقة واضحة بين أعداد المجاميع اللمفاوية القولونية أو بصيلات وشدة المرض السريري في التهاب القولون DSS، وبالتالي، لم ندرج القياس الكمي في هذا التحليل. - التقاط لقطة من الصور التمثيلية (انقر فوق لقطة، الشكل 2A)، وحفظ. وتشمل أشرطة مقياس إذا لزم الأمر عن طريق النقر على إظهار / إخفاء شريط مقياس ( الشكل2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح موثوقية هذا التحليل نقاط التهاب القولون النسيجي في سياق الضرر المخاطي بعد تحدي DSS والتعافي اللاحق من التهاب القولون ، قمنا بإعطاء 2.5٪ DSS في مياه الشرب لثمانية فئران من النوع البري C57BL6 من الذكور عمرها 10 أسابيع لمدة 5 أيام تليها فترة نقاهة مع الماء العادي لمدة 5 أيام. لم يكن هناك أي تغيير في وزن الجسم أثناء الإدارة الحادة ل DSS ، من اليوم 0 إلى 5(الشكل 4A). انخفض وزن الجسم بشكل كبير بعد اليوم الخامس، عندما بدأت الفئران في شرب مياه الصنبور العادية. ظهر الدم والبراز الناعم بعد 3 أيام من إدارة DSS واستمر لمدة 3 أيام لاحقة على الماء حتى اليوم 8 من التجربة(الشكل 4B). وتشير هذه الملاحظات إلى أن الآثار الأكثر ضررا للتعرض ل DSS لوحظت خلال فترة النقاهة بين اليومين 5 و8. أكد قياس طول القولون في اليوم 10 تقصير كبير في نهاية التجربة(الشكل 4C). تم حصاد الكولون في الأيام 0 و 2 و 5 و 7 و 8 و 10 لصنع لفائف البارافين السويسرية. كانت ملطخة الأنسجة مع H &؛ E و بمسح عالي الوضوح (الشكل 4D) تم تحليلها لحساب نقاط التهاب القولون النسيجي (الشكل 4E) ونسبة الإصابة والتقرح (الشكل 4F).
الشكل 4D يظهر العمارة سرداب العادي في الفئران C576BL6 غير المعالجة، سطحية إلى الغشاء المخاطي muscularis وبدعم من بروبريا الصفيحة (اليوم 0، السهم). بعد يومين من إدارة DSS ، لوحظ تجنيد الخلايا المناعية (اليوم 2 ، السهم). في اليوم الخامس، ظهرت خلايا ظهارية متضررة، وكان هناك تسلل من العدلات عبر الظهارة (التهاب سرداب) المرتبطة بالإصابة الظهارية (اليوم الخامس، السهم). من اليوم 5 إلى 8 ، لوحظت مناطق فقدان الظهارية مع الالتهاب والتقرح (اليوم 7 و 8 ، السهام). ويلاحظ عادة هذا الأخير كما الفئران شرب مياه الصنبور العادية خلال مرحلة الانتعاش. وأخيرا، تبدأ الخلايا الظهارية في تجديد وإعادة إسكان المناطق المتقرحة، واستعادة الغشاء المخاطي القولوني ببطء في اليوم العاشر (السهم).
يعكس HCS عن كثب التقييم البسيط للنسبة المئوية للالتهاب / الإصابة والتآكل / التقرح ، وكلاهما يثبت كميا أن هناك ضررا كبيرا على القولون من الفئران أثناء التعافي من DSS في اليوم 5 إلى 10 ، والذي يرتبط بالتآكل الظهاري وتسلل الكريات البيض الموضح في الشكل 4D. البيانات التي قدمتها HCS يميز بين شدة المرض فيما يتعلق بالالتهاب المرتبط بالإصابة الظهارية مقابل التآكل / التقرح.
وتبين هذه الملاحظات أن نظام التسجيل المنهجي لمركبات الكربون الهيدروفلورية المقترح في هذا البروتوكول يشكل أداة موثوقة لقياس الأضرار المخاطية.
الشكل 1: إعداد العينة أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات الدقيقة. (أ) القولون البعيدة ممتدة بالكامل وفتحت على طول الشريان السينتيري. (ب) عملية المتداول السويسرية. (C) إبرة الإدراج لعقد شكل لفة السويسرية (D) البارافين تضمين كاسيت. (ه) كتلة البارافين. (F) السويسرية لفة اتجاه مواز لتجنب المقاطع الجزئية. (G) لفة السويسرية كاملة، شريط مقياس: 2 مم. (H) القسم المثالي من سرداب القولون، شريط مقياس: 80 ميكرومتر. (I) اتجاه لفة السويسرية مائل. (J) لفة السويسرية غير مكتملة، شريط مقياس: 2mm. (K) المقطع المائل من سرداب القولون، شريط مقياس: 80 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التقييم الكمي للضرر mucosal. (أ) شريط الأدوات الأساسية مع لقطة ، شريط التمرير التكبير ، وتظهر / إخفاء شريط مقياس / محاور / الشبكة ، وصور التسمية ، والتعليقات التوضيحية ، وميزات أداة القلم ، من بين أمور أخرى. (ب) قائمة التعليقات التوضيحية عرض لون طبقة، طبقة جديدة، طبقة حذف، تظهر / إخفاء طبقة، حذف المنطقة وتصدير الشبكة إلى أزرار ملف نصي. (ج) نظرة عامة على الطول الإجمالي، والطبقات المصابة والمقرحة، شريط المقياس: 3 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا الغشاء المخاطي المعوي الماوس ملطخة hematoxylin &؛ eosin بعد الحاد DSS التجريبية التهاب القولون تليها الانتعاش. أ)الخلايا المعوية السليمة المنظمة في سرداب القولون محاطة ببروبريا الصفيحة وفصلها عن الغشاء المخاطي العضلات، شريط مقياس: 200 ميكرومتر. (ب) التهاب المخاط الحاد أو إصابة مع تسلل العدلات إلى الغشاء المخاطي والظهارة سرداب، المرتبطة تشوه الظهارة سرداب / فقدان وتوهين الظهارة، شريط مقياس: 200 ميكرومتر. (C) المناطق متقرحة أو تآكل مع فقدان الظهارية كاملة والتهاب المرتبطة بها., شريط مقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:ترتبط نقاط التهاب القولون النسيجي والنسبة المئوية للإصابة والتقرح بوزن الجسم ومؤشر البراز أثناء التهاب القولون التجريبي DSS: (أ)يتم تقييم وزن الجسم و(ب)مؤشرات البراز يوميا في فئران النوع البري المعالجة ب 2.5٪ DSS لمدة 5 أيام (الخط الأحمر) ، تليها 5 أيام من التعافي على الماء (الخط الأسود). البيانات هي ممثلة تجربتين مستقلتين مع ما لا يقل عن 4 فئران لكل مجموعة ويتم التعبير عنها على أنها متوسط ± SEM. يتم تحديد الأهمية من خلال مقارنة متعددة بين ANOVA وSedak ثنائية الاتجاه ، *p<0.033 ، **p<0.002 ، و ***p<0.001. (ج)تم قياس طول القولون من الفئران في اليوم 10. البيانات هي ممثلة تجربتين مستقلتين مع ما لا يقل عن 3 فئران لكل مجموعة ويتم التعبير عنها على أنها متوسط ± SEM. يتم تحديد الأهمية من خلال اختبار T للطالب ذو الذيلين ، *** p<0.001. (د)تم تحليل أقسام الأنسجة الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوسين (H&E) من الغشاء المخاطي للقولون لحساب، ونطاق القضبان: 60 ميكرومتر(E) نقاط التهاب القولون النسيجي (HCS) والنسبة المئوية للإصابة / التقرح بالنسبة لطول القولون. البيانات هي ممثلة تجربتين مع الفئران 2 لكل مجموعة ويتم التعبير عن متوسط ± SEM. يتم تحديد الأهمية من خلال مقارنة متعددة ANOVA و Tukey في اتجاه واحد، * p<0.033، **p<0.002، و ***p<0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدينا نظام نقاط التهاب القولون النسيجي يشكل أداة موثوق بها لقياس التهاب الأنسجة والضرر في الأمعاء. يوفر هذا النهج فهما أفضل لحالة الأمراض النسيجية للجهاز بأكمله دون تحيز لاختيار مناطق صغيرة أو أقسام غير مكتملة. ومن بين الخطوات الحاسمة لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح الإعداد السليم للقوائم السويسرية التي تسمح بتحليل ما لا يقل عن 90٪ من طول القولون؛ التوجه المتوازي أثناء تضمين البارافين وتقسمه لضمان مقاطع الأنسجة المستقيمة والموحدة ذات الآراء الطولية من السراديب الظهارية؛ الممارسة والتدريب بإشراف من أخصائي علم أمراض متمرس للتأكد من أن المتدربين يحددون الاختلافات بين الالتهاب الحاد والإصابة الظهارية والتآكل / التقرح؛ والوصول إلى ماسح ضوئي رقمي عالي الدقة.
مطلوب تعديلات صغيرة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتوجيه المناسب لفة السويسرية أثناء تضمين البارافين وكذلك أثناء المقطع لضمان أن الأنسجة هو موجهة موازية بالنسبة لكاسيت البارافين وشفرة (الشكل 1E-F). سيؤدي الالتزام بهذا التوجه المكاني إلى تقليل عدد الأقسام غير المكتملة. إذا كان القولون هو تدحرجت تماما على نفسها، فإن أفضل المقاطع بما في ذلك معظم طول الأنسجة تقع بالقرب من منتصف لفة السويسرية(الشكل 1F). جمع عدة أقسام يزيد كثيرا من فرصة الحصول على أقسام موجهة بشكل جيد حيث طول سرداب كامل مرئيا (الشكل 1G-H). تجنب تقسيم القوائم السويسرية المائلة (الشكل 1I-J)، التي تتميز سرداب دائرية الشكل أو دونات سرداب(الشكل 1K). في كثير من الأحيان ينصح بشدة تصور المقاطع التي تم جمعها تحت المجهر لضمان تقنية مناسبة. مقطع جيد يلتقط طول القولون بأكمله.
أي أداة تمكن من التقاط كامل طول لفة السويسرية ويوفر القرار اللازم لتكبير الأنسجة لتصور العمارة سرداب كافية لتقييم HCS. تسمح بعض المجاهر بتداخل الصور الصغيرة وإعادة بناء أقسام الأنسجة بأكملها. ومع ذلك ، قد يكون قرار هذه الصور الفقراء بعد زيادة التكبير لتسجيل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يكون تداخل المقاطع مثاليا ، مما يترك مناطق من الأنسجة غير محددة جيدا ومن المستحيل تسجيلها بدقة.
من بين مزايا بروتوكول التهديف المقترح هنا تصنيف الأنسجة في فئتين فقط الالتهاب / الإصابة أو التآكل / التقرح. وهذا يبسط ويسرع تصنيف تلف الأنسجة، مع زيادة القابلية للاستنساخ. البرنامج المستخدم للتحليل يمكن الوصول إليه ، مجانا ، وسهل الاستخدام. يعكس HCS بدقة الضرر المخاطي ، لأنه يسمح بتحديد المناطق المقرحة على طول القولون ويوفر بشكل مناسب المزيد من الوزن تجاه هذا المرض على المناطق الملتهبة وغير القرحة. وينعكس ذلك بوضوح عند مقارنة بيانات HCS مقابل النسبة المئوية للإصابة / التقرح(الشكل 4E-F). يستغرق تحليل التهديف لكل عينة حوالي 40 دقيقة. مع التدريب المناسب ، والوصول إلى الشرائح الممسوحة ضوئيا ، والكمبيوتر ، والبرامج ، يمكن لمعظم الباحثين إجراء التحليل. ومع ذلك، فمن المستحسن دائما لتأكيد نتائج التسجيل مع أخصائي علم الأمراض لضمان الدقة والتكرار. يمكن إجراء تقييم التهاب الأمعاء مع أي برنامج يسمح بتكبير عالي الدقة للشرائح وقياسات الطول؛ ومع ذلك ، من أجل البساطة ، ركزنا في هذا البروتوكول على البرامج المدرجة في جدول المواد.
لقد تم استخدام هذا النظام التهديف لتحليل المرض بنجاح عبر مختلف التجارب التهاب القولون DSS. فعلى سبيل المثال، استكشف كيلم وآخرون14 أهمية الجليكوزيلة CD44v6، وهي هيئة تنظيمية هامة للهجرة الظهارية وانتشارها، باستخدام جهاز مضاد جديد (GM35). أظهروا انخفاض مؤشر نشاط المرض وسجل تحسن HSC في الفئران التي تواجه تحديا مع DSS الحادة بعد استهداف سياليل لويس A الجليكان على CD44v6 الظهارية، مما يؤكد على أهمية التعديل بعد الترجمية من المتغيرات CD44 للتعافي بعد الإصابة الناجمة عن DSS14. في مثال آخر، استخدم ريد وآخرون15 نموذج DSS المزمن لدراسة الإصابة المخاطية والإصلاح في الفئران مع حذف محدد ظهاري من CD47، وهو بروتين عبر الميمبران مهم لعمليات الالتهاب والإصلاح. تم تحليل مسح القولون وسجل لحساب النسبة المئوية للإصابة والتقرح كما هو موضح أعلاه، مما يدل على ضعف ملحوظ إصلاح المخاطية في الفئران تفتقر إلى CD4715الظهارية . استخدم نموذج التهاب القولون المزمن في هذا التقرير الإدارة الدورية ل DSS لتحليل الإصابة والإصلاح بمرور الوقت.
وقد أظهرت منشورات إضافية من مجموعتنا وغيرها مزايا هذا النظام التهديف وارتباطه مع الأعراض السريرية6،16،17. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إعداد وتسجيل القوائم السويسرية باستخدام برامج مجانية ويمكن الوصول إليها بسهولة. تستند بساطة التسجيل المقترح هنا إلى استخدام فئتين فقط (الالتهاب / الإصابة أو التآكل / التقرح) في الشرائح الممسوحة ضوئيا لتسهيل عملية التسجيل وزيادة القابلية للاستنساخ. الأهم من ذلك ، يرتبط نظام التسجيل الموصوف هنا أيضا بالمعلمات السريرية لالتهاب الأمعاء. في الختام ، فإن نقاط التهاب القولون النسيجي هي أداة يمكن استخدامها لتسجيل التهاب القولون DSS كميا ويمكن تطبيقها على نماذج التهاب القولون الأخرى المرتبطة بالالتهاب والإصابة / الخسارة الظهارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من تمويل المعاهد القومية للصحة DK055679 و DK089763 و DK079392 و DK061739 و DK072564 وخدمات مسح الشرائح المرضية بجامعة ميشيغان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
