Summary
Il punteggio sistematico dell'infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l'interpretazione dei dati.
Abstract
I modelli di colite murina sono strumenti ampiamente utilizzati in studi incentrati sulla comprensione della patobiologia dei disturbi intestinali infiammatori. Tuttavia, restano da definire standard solidi per una quantificazione obiettiva e riproducibile della gravità della malattia. La maggior parte dei metodi di analisi della colite si basano su un punteggio istologico limitato di piccoli segmenti dell'intestino, portando ad analisi parziali o parziali. Qui, combiniamo l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e l'analisi longitudinale dell'intero colon per quantificare la lesione intestinale e l'ulcerazione nel modello indotto dal solfato di sodio di dextran (DSS) della colite murina. Questo protocollo consente la generazione di risultati oggettivi e riproducibili senza un'ampia formazione degli utenti. Qui, forniamo dettagli completi sulla preparazione del campione e sull'analisi delle immagini utilizzando esempi di dati della colite indotta da DSS. Questo metodo può essere facilmente adattato ad altri modelli di colite murina che hanno un'infiammazione significativa associata a lesioni della mucosa. Dimostriamo che la frazione di mucosa infiammata/ ferita e erosa / ulcerata rispetto alla lunghezza completa del colon è strettamente parallela ai risultati clinici come la perdita di peso in mezzo alla progressione della malattia indotta dal DSS. Questo protocollo istologico fornisce un aiuto affidabile in termini di tempo ed economico per standardizzare le analisi dell'attività della malattia in modo imparziale negli esperimenti di colite DSS.
Introduction
La barriera epiteliale gastrointestinale svolge un ruolo fondamentale nel separare gli antigeni luminali e gli agenti patogeni dai compartimenti tissutalisottostanti 1. Lesioni epiteliali e ferite mucose osservate in condizioni patologiche come malattia infiammatoria intestinale (IBD), ischemia o lesioni chirurgiche sono associate a sintomi clinici che includono diarrea, perdita di peso, sangue nelle feci e dolore addominale. In risposta alle lesioni, le cellule epiteliali migrano e proliferano per er epitelializzare e riparare i difetti della barriera della mucosa. La risoluzione dell'infiammazione e la restituzione dell'integrità della mucosa sono fondamentali per ristabiliscono l'omeostasi della mucosa intestinalee la funzione 2,3,4.
Vari modelli animali sono stati utilizzati per studiare i meccanismi molecolari sottostanti associati al danno alla barriera epiteliale intestinale. Modelli consolidati e facilmente applicabili di colite indotta chimicamente sono ampiamente utilizzati, in particolare negli studi relativi a lesioni infiammatorie come l'IBD. Un modello comune, riproducibile e affidabile di colite murina utilizza lesioni e infiammazioni del solfato di sodio di dextran (DSS). La gravità della malattia varia a seconda dello sforzo del topo, della dose di DSS, della lunghezza della somministrazione di DSS e del peso molecolare di DSS5,6,7.
Il danno mucoso intestinale durante la colite DSS viene solitamente valutato utilizzando l'indice di attività della malattia (DAI), un punteggio composito determinato dalla perdita di peso, dal contenuto di sangue fecale e dalla consistenza delle feci. Il contenuto di sangue fecale può essere microscopico (rilevato utilizzando un test dell'acido guaiaco delle feci) o macroscopico; la consistenza fecale è classificata come dura, morbida o liquida (cioè diarrea)5,8. Il punteggio di questi parametri clinici può essere soggettivo e può variare a seconda dell'esperienza e della distorsione dell'utente, anche se nel complesso, i dati forniscono informazioni affidabili ed è quindi ampiamente utilizzato dai ricercatori IBD. Al contrario, non esiste un metodo generalmente accettato per la valutazione istologica dei danni alla mucosa. Più comunemente, le aree selezionate del colon vengono ispezionate da un patologo addestrato e valutate sulla base di diversi parametri che di solito includono lesioni alla cripta e infiltrazione di leucociti9,10,11. Tuttavia, poiché il numero di parametri studiati e la quantità di tessuto analizzato variano considerevolmente tra i singoli rapporti, la comparabilità di molti studi pubblicati è limitata. Per ridurre la distorsione dell'osservatore e migliorare la concordanza inter-studio, un protocollo di punteggio istologico ideale dovrebbe: 1) includere l'intera lunghezza del colon, poiché l'infiammazione della mucosa intestinale è più spesso variabile e le lesioni skip sono comuni, 2) limitare l'analisi a parametri chiave specifici e facilmente interpretabili per ridurre la soggettività, 3) facilitare un'elaborazione rapida e coerente di un gran numero di campioni e 4) utilizzare strumenti ampiamente disponibili e convenienti per l'acquisizione, l'analisi e la presentazione dei dati.
Qui descriviamo una tecnica per elaborare l'intero colon o i segmenti lunghi dell'intestino tenue in una configurazione "swiss roll" insieme all'uso di un sistema di punteggio assistito da computer gratuito per analizzare l'infiammazione e i danni della mucosa intestinale a causa della colite indotta da DSS.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan.
1. Raccolta dei tessuti
- Eutanasia dei topi umanamente usando l'anestesia isoflurana seguita da lussazione cervicale, in conformità con i protocolli approvati. Per tutti gli esperimenti sugli animali, l'approvazione è stata ottenuta da un comitato di revisione certificato in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali per la manipolazione degli animali.
- Posizionare il mouse su un cuscinetto di sezionamento in posizione supina. Immobilizzare le estremità del mouse utilizzando aghi G da 20 G x 1 1/2 pollice.
- Usando forcep e forbici, fare una piccola incisione sulla pelle addominale e tirarla di lato per esporre il peritoneo.
- Aprire la cavità addominale con un'incisione della linea mediana nel peritoneo dall'osso pubico ai lati dell'addome.
- Rimuovere con cura tessuti e organi fino a visualizzare l'intestino crasso. Tagliare l'osso pelvico su entrambi i lati del colon per visualizzare completamente l'organo, estendendosi dall'ano verso il cieco.
- Rimuovere delicatamente grasso, piccole vene e arterie attaccate al colon, sezionando attentamente l'organo, tagliando solo prossimale all'ano e appena distale al cieco.
NOTA: Il colon sezionato deve rimanere a temperatura ambiente durante il completamento della procedura di rollio svizzero. - Sciacquare con cura i due punti con 1x PBS, utilizzando un ago flessibile di gavage in plastica inserito attraverso l'ano per rimuovere il contenuto fecale.
- Posizionare i due punti in linea retta e aprirlo longitudinalmente lungo l'arteria mesenterica. Bisect il colon longitudinalmente dal distale all'estremità prossimale (Figura 1A). Una metà del tessuto può essere utilizzata per l'analisi istologica, mentre l'altra può essere lavorata per macchia occidentale, PCR o arrotolata in un secondo rotolo svizzero per microscopia ad immunofluorescenza congelatafresca 12.
2. Preparazione di rotoli svizzeri
- Tagliare il tessuto extra dal colon prossimale usando una lama di rasoio fino a ottenere approssimativamente la stessa larghezza lungo la lunghezza dell'intero colon.
- Allineare i due punti per esporre il lume rivolto verso l'alto e appiattire completamente il tessuto utilizzando un ago di gavage flessibile. Aggiungere più PBS, se necessario, per mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura.
- Rimuovere l'eccesso di PBS utilizzando una salvietta di carta. Con una siringa e un ago di gavage, aggiungere una soluzione di formalina tamponata neutra al 10% sul tessuto per 2-3 minuti per fissare e appiattire il tessuto.
- Utilizzare le forcette dritte per afferrare l'estremità del colon distale e ruotare il colon in cerchi concentrici dall'estremità distatale a quella prossimale (Figura 1B).
NOTA: È possibile spingere indietro l'interno del rotolo svizzero mentre si rotola utilizzando l'indice per assicurarsi che il tessuto sia all'interno del rotolo. - Inserire un ago da 27 G per fissare i due punti al centro per mantenere la forma del rotolo svizzero (Figura 1C).
- Posizionare il rotolo svizzero con l'ago in una cassetta di incorporamento all'interno di un contenitore di campioni istologici.
NOTA: Il tessuto deve essere orientato in parallelo rispetto alla cassetta prima della fissazione (Figura 1D). - Fissare il tessuto in soluzione di formalina tamponata neutra al 10% durante la notte a 4 °C13.
- Dopo la fissazione notturna, lavare il tessuto 3 volte con PBS.
- Aggiungere il 70% di etanolo al tessuto prima del processo di incorporamento della paraffina. Rimuovere l'ago dal rotolo svizzero prima di procedere. I tessuti possono essere conservati in etanolo a temperatura ambiente fino all'incorporamento di paraffina13.
- Posizionare i campioni nel processore tissutale, incorporare in paraffina e preparare sezioni da 4 μm, montate su diapositive di microscopia cariche positivamente (Figura 1E). Questo può essere un punto di arresto opzionale.
NOTA: Un corretto orientamento tissutale è fondamentale per ottenere sezioni adatte per l'analisi delle immagini. L'incorporamento parallelo svizzero del rotolo nella cassetta di paraffina si tradurrà in sezioni complete appropriate per l'analisi delle immagini (Figura 1F-1H). Le sezioni oblique devono essere evitate per evitare sezioni incomplete(figura 1I-1K). Per ulteriori dettagli, vedere la sezione Discussione. - Sezioni di macchie con ematossilina ed eosina (H&E)13.
3. Scansione e analisi digitali
NOTA: per una valutazione accurata delle modifiche della mucosa, selezionare solo le sezioni che includono almeno il 90% della lunghezza totale dei due punti.
- Digitalizzare sezioni macchiate utilizzando uno scanner diapositiva o un dispositivo di immagini (vedere Tabella dei materiali). Le immagini prodotte necessitano di una risoluzione di 0,25 micron per pixel con obiettivo 40x e ingrandimento 40x.
- Installare e scaricare un software appropriato per l'analisi digitale delle diapositive digitalizzate (vedere Table of Materials).
- Aprire le immagini digitalizzate nel software di elaborazione delle immagini (Figura 2A). Verificare che l'intero colon sia visibile e che non vi siano aree mancanti del campione.
- Attivare l'imager dell'etichetta e gli strumenti della barra di ridimensiona per identificare correttamente le diapositive digitalizzate facendo clic su Imager etichette (Figura 2A).
- Aprire lo strumento annotazioni facendo clic su Annotazioni(Figura 2A) e creare 3 livelli diversi facendo clic su Nuovo livello (Figura 2B) per quantificare la lunghezza totale del rotolo svizzero, infiammazione/lesione ed erosione/ulcerazione. Scegliere un colore diverso per ogni livello facendo clic su Colore livello (Figura 2B).
- Misurare la lunghezza di ogni livello/categoria facendo clic sull'utensile Penna (Figura 2A), utilizzando la mucosa muscolare come riferimento:
- Visualizza l'immagine con uno zoom di 400 μm (o più) per facilitare un'adeguata visualizzazione della mucosa muscolare.
NOTA: l'ingrandimento è facilmente controllabile utilizzando la rotellina di scorrimento del mouse e dovrà essere regolato se necessario mentre ci si sposta attraverso la sezione per disegnare tutte le linee. - Clicca sullo strumento Penna per tracciare una linea seguendo la mucosa muscolare (Figura 2A). Spostare il puntatore in base alle esigenze per visualizzare l'area adiacente per l'analisi.
NOTA: ogni volta che la penna viene arrestata, verrà generata una nuova piccola area di livello. Può essere visualizzato e modificato con la scheda Aree livello (selezionare il segmento desiderato e fare clic su Elimina livello in caso di errori o correzioni, Figura 2B).
- Visualizza l'immagine con uno zoom di 400 μm (o più) per facilitare un'adeguata visualizzazione della mucosa muscolare.
- Una volta definiti tutti i livelli (Figura 2C), esportare i dati utilizzando il pulsante Esporta griglia in file di testo all'interno delle opzioni delle aree del livello ( Figura2B).
NOTA: salva spesso i file durante la creazione dei livelli per assicurarti che i dati siano archiviati correttamente. - Aprire i file di testo e copiare i dati con un software per fogli di calcolo. Totale tutti i segmenti di ciascuna regione e calcolare la percentuale di lesioni e ulcerazioni rispetto alla lunghezza totale.
- Per calcolare il punteggio di colite istologica (HCS) e valutare la gravità della malattia, considerare tre caratteristiche principali come descritto di seguito.
- Verificare la presenza di mucosa intestinale sana caratterizzata da cellule epiteliali organizzate nell'asse cripto-luminale, lamina propria con poche cellule immunitarie e mucosa muscolare subjacente che interfaccia la mucosa e la sottomucosa (Figura 3A).
- Verificare la presenza di infiammazione/lesione caratterizzata da cripte epiteliali attenuate o parzialmente mancanti e infiammazione della mucosa con infiltrazione di neutrofili nelle cripte(Figura 3B).
- Verificare la presenza di erosione/ulcerazione caratterizzata da aree prive di epitelio superficiale o da aree completamente prive di cripte epiteliali con o senza leucociti associati (Figura 3C).
- Calcolare l'HCS delle regioni lese e ulcerate espresso in percentuale della lunghezza totale nella seguente formula:
NOTA: HCS combina la percentuale di infiammazione/ lesione ed erosione / ulcerazione aggiungendo un fattore due a quest'ultimo, sulla base di un ragionevole presupposto che la completa perdita dell'epitelio si traduce nella massima perdita di integrità della barriera e quindi in una malattia peggiore. HCS rappresenta costantemente i cambiamenti morfologici causati dalla colite sperimentale indotta da DSS. È interessante notare che non abbiamo visto una chiara correlazione tra il numero di aggregati linfoidi colonici o follicoli e la gravità clinica della malattia nella colite DSS e, pertanto, non abbiamo includeto la quantificazione in questa analisi. - Scattare un'istantanea delle immagini rappresentative (fare clic su Snapshot, Figura 2A) e salvare. Se necessario, includere le barre di scala facendo clic su Mostra/Nascondi barra scala ( Figura2A).
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Representative Results
Per illustrare l'affidabilità di questa analisi del punteggio della colite istologica nel contesto dei danni alla mucosa dopo la sfida DSS e il successivo recupero dalla colite, abbiamo somministrato il 2,5% di DSS nell'acqua potabile di otto topi maschi di tipo C57BL6 di 10 settimane per 5 giorni seguiti da un periodo di recupero con acqua regolare per 5 giorni. Non vi è stato alcun cambiamento nel peso corporeo durante la somministrazione acuta di DSS, dal giorno 0 al 5 (Figura 4A). Il peso corporeo è diminuito drasticamente dopo il giorno 5, quando i topi hanno iniziato a bere acqua normale del rubinetto. Sangue e feci morbide sono apparsi dopo 3 giorni di somministrazione del DSS e sono proseguiti per i successivi 3 giorni sull'acqua fino al giorno 8 dell'esperimento (Figura 4B). Queste osservazioni hanno suggerito che gli effetti più dannosi dell'esposizione al DSS sono stati osservati durante il periodo di recupero tra i giorni 5 e 8. La misurazione della lunghezza del colon il giorno 10 ha confermato un significativo accorciamento alla fine dell'esperimento (Figura 4C). I colons sono stati raccolti nei giorni 0, 2, 5, 7, 8 e 10 per fare rotoli svizzeri di paraffina. Il tessuto è stato macchiato di H&E e sono state analizzate scansioni ad alta definizione (Figura 4D) per calcolare il punteggio di coliteistologica ( Figura 4E) e la percentuale di lesioni e ulcerazioni (Figura 4F).
La figura 4D mostra la normale architettura della cripta nei topi C576BL6 non trattati, superficiale alla mucosa muscolare e supportata dalla lamina propria (giorno 0, freccia). Dopo 2 giorni di somministrazione del DSS, è stato osservato il reclutamento delle cellule immunitarie (giorno 2, freccia). Il giorno 5, le cellule epiteliali sono apparse danneggiate e c'è stata un'infiltrazione di neutrofili attraverso l'epitelio (criptite) associata a lesioni epiteliali (giorno 5, freccia). Dal giorno 5 all'8, sono state notate aree di perdita epiteliale con infiammazione e ulcerazione (giorno 7 e 8, frecce). Quest'ultimo è comunemente osservato come i topi bevono acqua di rubinetto regolare durante la fase di recupero. Infine, le cellule epiteliali iniziano a rigenerarsi e ripopolare le aree ulcerate, ripristinando lentamente la mucosa colonica al giorno 10 (freccia).
HCS rispecchia da vicino la semplice valutazione della percentuale di infiammazione/ lesione ed erosione / ulcerazione, ed entrambi dimostrano quantitativamente che c'è un danno significativo al colon dei topi durante il recupero dal DSS il giorno 5 a 10, che è correlato con erosioni epiteliali e infiltrazioni di leucociti mostrati nella figura 4D. I dati forniti dall'HCS distinguono tra la gravità della malattia per quanto riguarda l'infiammazione associata a lesioni epiteliali rispetto all'erosione / ulcerazione.
Queste osservazioni dimostrano che il sistema di punteggio sistematico dell'HCS proposto in questo protocollo costituisce uno strumento affidabile per quantificare i danni alla mucosa.
Figura 1: La preparazione del campione è fondamentale per un'accurata analisi dei dati. (A) Colon distale completamente esteso e aperto lungo l'arteria mesenterica. (B) Processo di laminazione svizzero. (C) Inserimento dell'ago per contenere la cassetta di incorporamento della paraffina a forma di rotolo svizzero(D). (E)Blocco di paraffina. (F) Orientamento parallelo del rotolo svizzero per evitare sezioni parziali. (G) Rotolo svizzero completo, barradi scala: 2 mm. (J) Rotolo svizzero incompleto, barra di scala: 2mm. (K) Sezione obliqua delle cripte coloniche, barra di scala: 80 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione quantitativa dei danni alla mucosa. ( A )Barradegli strumenti di base con snapshot, dispositivo di scorrimento zoom, barra/assi/griglia di scala mostra/nascondi, imager etichette, annotazioni e caratteristiche dello strumento penna, tra gli altri. (B) Menu Annotazioni che visualizza il colore del livello, un nuovo livello, elimina il livello, mostra/nascondi livello, elimina area ed esporta griglia nei pulsanti del file di testo. (C) Panoramica della lunghezza totale, degli strati feriti e ulcerati, barra di scala: 3 mm.
Figura 3: Morfologia della mucosa intestinale del topo macchiata di ematossilina & eosina dopo colite acuta DSS-sperimentale seguita da recupero. (A) Cellule intestinali sane organizzate in cripte coloniche circondate da lamina propria e separate dalla submucosa dalla mucosa muscolare, barra di scala: 200 μm. (B) Infiammazione/perdita mucosa acuta o lesioni con infiltrazione di neutrofili nella mucosa e nell'epitelio della cripta, associata a distorsione/perdita epiteliale della cripta e attenuazione epiteliale, barra di scala: 200 μm. (C) Aree ulcerate o erose con perdita epiteliale completa e infiammazione associata., barra di scala: 200 μm.
Figura 4: Punteggio di colite istologica e percentuale di lesioni e ulcerazioni correlate con il peso corporeo e l'indice delle feci durante la colite sperimentale DSS: (A) Gli indici del peso corporeo e delle feci(B)vengono valutati quotidianamente nei topi di tipo selvatico trattati con DSS al 2,5% per 5 giorni (linea rossa), seguiti da 5 giorni di recupero sull'acqua (linea nera). I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con almeno 4 topi per gruppo e sono espressi come media ± SE<<
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Discussion
Il nostro sistema di punteggio di colite istologica costituisce uno strumento affidabile per quantificare l'infiammazione e i danni dei tessuti nell'intestino. Questo approccio fornisce una migliore comprensione dello stato istopatologico dell'intero organo senza la tendenza a selezionare piccole aree o sezioni incomplete. Tra le fasi critiche per eseguire con successo questo protocollo ci sono la corretta preparazione dei rotoli svizzeri che consentono l'analisi di almeno il 90% della lunghezza dei due punti; orientamento parallelo durante l'incorporamento e la sessatura della paraffina per garantire sezioni tissutali dritte e uniformi con viste longitudinali delle cripte epiteliali; pratica e formazione con la supervisione di un patologo esperto per confermare che i tirocinanti identificano le differenze tra infiammazione acuta, lesioni epiteliali ed erosione / ulcerazione; e l'accesso a uno scanner digitale ad alta risoluzione.
Sono necessarie piccole regolazioni e risoluzione dei problemi per orientare adeguatamente il rotolo svizzero durante l'incorporamento della paraffina e durante il sessificazione per garantire che il tessuto sia orientato in parallelo rispetto alla cassetta e alla lama diparaffina (Figura 1E-F). L'adesione a questo orientamento spaziale ridurrà il numero di sezioni incomplete. Se il colon è perfettamente arrotolato su se stesso, le sezioni migliori, compresa la maggior parte della lunghezza del tessuto, si trovano vicino al centro del rotolo svizzero(Figura 1F). La raccolta di diverse sezioni aumenta notevolmente la possibilità di ottenere sezioni ben orientate in cui è visibile l'intera lunghezza delle cripte (Figura 1G-H). Evitare di sequestri di rotoli svizzeri obliqui (Figura 1I-J), caratterizzati da cripte a forma circolare o ciambelle di cripta(Figura 1K). Spesso si consiglia vivamente la visualizzazione delle sezioni raccolte al microscopio per garantire una tecnica adeguata. Una buona sezione cattura l'intera lunghezza dei due punti.
Qualsiasi strumento che consenta di catturare l'intera lunghezza del rotolo svizzero e fornisca la risoluzione necessaria per ingrandire il tessuto per visualizzare l'architettura della cripta è adeguato per la valutazione dell'HCS. Alcuni microscopi consentono la sovrapposizione di piccole immagini e ricostruiscono intere sezioni tissutali. Tuttavia, la risoluzione di queste immagini potrebbe essere scarsa dopo aver aumentato l'ingrandimento per segnare il tessuto. Inoltre, la sovrapposizione di sezioni potrebbe non essere perfetta, lasciando aree di tessuto che non sono ben definite e impossibili da segnare con precisione.
Tra i vantaggi del protocollo di punteggio qui proposto ci sono la classificazione del tessuto in due solo due categorie infiammazione / lesione o erosione / ulcerazione. Ciò semplifica e accelera la classificazione dei danni ai tessuti, aumentando al contempo la riproducibilità. Il software utilizzato per l'analisi è accessibile, gratuito e facile da usare. HCS riflette accuratamente i danni della mucosa, in quanto consente di quantificare le aree ulcerate lungo l'intera lunghezza del colon e fornisce in modo appropriato più peso verso questa patologia su regioni infiammate e non ulcerate. Ciò si riflette chiaramente quando si confrontato i dati HCS con la percentuale di lesioni/ulcerazioni (figura 4E-F). L'analisi del punteggio di ogni campione richiede circa 40 minuti. Con la formazione appropriata, l'accesso alle diapositive scansionate, un computer e il software, la maggior parte dei ricercatori può eseguire l'analisi. Tuttavia, è sempre consigliabile confermare i risultati del punteggio con un patologo per garantire precisione e riproducibilità. La valutazione dell'infiammazione intestinale può essere eseguita con qualsiasi software che consenta l'ingrandimento ad alta risoluzione di diapositive e misurazioni della lunghezza; tuttavia, per semplicità, in questo protocollo ci siamo concentrati sul software elencato nella Tabella dei Materiali.
Abbiamo utilizzato questo sistema di punteggio per analizzare con successo le malattie in vari esperimenti di colite DSS. Ad esempio, Kelm et al. Hanno dimostrato una riduzione del punteggio dell'indice di attività della malattia e un miglioramento dell'HSC nei topi sfidati con DSS acuto dopo il targeting di glicani sialyl lewis A su CD44v6 epiteliale, confermando l'importanza della modifica post traslazionale delle varianti CD44 per il recupero dopo la lesione indotta da DSS14. In un altro esempio, Reed etal. Le scansioni del colon sono state analizzate e valutate per calcolare la percentuale di lesioni e ulcerazioni come descritto sopra, dimostrando una riparazione mucosa marcatamente compromessa nei topi privi di CD4715epiteliale . Il modello di colite cronica in questo rapporto ha impiegato la somministrazione ciclica di DSS per analizzare lesioni e riparare nel tempo.
Ulteriori pubblicazioni del nostro gruppo e di altri hanno dimostrato i vantaggi di questo sistema di punteggio e la sua correlazione con isintomi clinici 6,16,17. Questo protocollo descrive in dettaglio come preparare e segnare i rotoli svizzeri, utilizzando software gratuito e facilmente accessibile. La semplicità del punteggio qui proposto si basa sull'uso di due solo categorie (infiammazione/ lesione o erosione / ulcerazione) nelle diapositive scansionate per facilitare il processo di punteggio e aumentare la riproducibilità. È importante sottolineare che il sistema di punteggio qui descritto è correlato anche ai parametri clinici dell'infiammazione intestinale. In conclusione, il punteggio di colite istologica è uno strumento che può essere utilizzato per segnare quantitativamente la colite DSS e può essere applicato ad altri modelli di colite associati a infiammazione e lesioni / perdite epiteliali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il supporto del finanziamento NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 e dell'Università del Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
