Summary
Systematisk poängsättning av intestinala inflammation med hjälp av ett gratis datorassisterat system är ett kraftfullt verktyg för att kvantitativt jämföra histopatologiska förändringar i kolitmodeller som kännetecknas av förekomsten av sår och inflammatoriska förändringar. Histologisk kolit poäng utvärdering stärker kliniska observationer och underlättar data tolkning.
Abstract
Murine colitis modeller är verktyg som används i stor utsträckning i studier fokuserade på att förstå patobiologin hos inflammatoriska tarmsjukdomar. Robusta standarder för objektiv och reproducerbar kvantifiering av sjukdomens svårighetsgrad återstår dock att definiera. De flesta kolit analys metoder förlitar sig på begränsad histologisk poängsättning av små segment av tarm, vilket leder till partiella eller partiska analyser. Här kombinerar vi högupplöst bildförvärv och longitudinell analys av hela tjocktarmen för att kvantifiera tarmskada och ulceration i dextran natriumsulfat (DSS) inducerad modell av murin kolit. Detta protokoll möjliggör generering av objektiva och reproducerbara resultat utan omfattande användarutbildning. Här ger vi omfattande information om provberedning och bildanalys med hjälp av exempel på data från DSS inducerad kolit. Denna metod kan enkelt anpassas till andra modeller av murin kolit som har betydande inflammation i samband med slemhinneskada. Vi visar att fraktionen av inflammerade/skadade och eroderade/ulcerated slemhinnan i förhållande till hela längden av kolon nära paralleller kliniska resultat såsom viktminskning bland DSS-inducerad sjukdom progression. Detta histologiska protokoll ger en tillförlitlig tid och kostnadseffektivt stöd för att standardisera analyser av sjukdomsaktivitet på ett opartiskt sätt i DSS-kolitexperiment.
Introduction
Den gastrointestinala epitelbarriären spelar en avgörande roll vid separation av luminala antigener och patogener från underliggande vävnadsutrymmen1. Epitelskada och slemhinnor som ses i patologiskt tillstånd såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), ischemi eller kirurgisk skada är förknippade med kliniska symtom som inkluderar diarré, viktminskning, blod i avföring och buksmärta. Som svar på skada migrerar epitelceller och förökar sig för att åter epitelialisera och reparera slemhinnor barriär defekter. Upplösning av inflammation och upprättelse av slemhinnor integritet är avgörande för att återupprätta intestinala slemhinnan homeostas och funktion2,3,4.
Olika djurmodeller har använts för att studera de underliggande molekylära mekanismerna som är förknippade med skadorna på tarmepitela barriären. Väletablerade och lätt tillämpliga modeller av kemiskt inducerad kolit används ofta, särskilt i studier relaterade till inflammatorisk skada som IBD. En vanlig, reproducerbar och pålitlig murin kolit modell använder dextran natriumsulfat (DSS) medierad colonic skada och inflammation. Svårighetsgraden av sjukdomen varierar beroende på musstam, dos av DSS, längden på DSS-administrering och molekylvikten för DSS5,6,7.
Intestinala slemhinnor under DSS kolit utvärderas vanligtvis med hjälp av Disease Activity Index (DAI), en sammansatt poäng som bestäms av viktminskning, fekal blodhalt och avföring konsistens. Fekalblodhalten kan vara mikroskopisk (detekteras med hjälp av ett avförings guaiac acid test) eller makroskopisk; fekal konsistens klassificeras som hård, mjuk eller flytande (dvs. diarré)5,8. Poängsättning av dessa kliniska parametrar kan vara subjektiv och kan variera beroende på användarens erfarenhet och partiskhet, även om uppgifterna totalt sett ger tillförlitlig information och används därför i stor utsträckning av IBD-forskare. Däremot finns det ingen allmänt accepterad metod för histologisk utvärdering av slemhinnor skador. Oftast inspekteras utvalda områden i tjocktarmen av en utbildad patolog och poängsätts baserat på flera parametrar som vanligtvis inkluderar kryptskada och leukocytinfiltration9,10,11. Men eftersom antalet undersökta parametrar och mängden vävnad som analyseras varierar avsevärt mellan enskilda rapporter, är jämförbarheten hos många publicerade studier begränsad. För att minska observatörens partiskhet och förbättra överensstämmelsen mellan studier bör ett idealiskt histologiskt poängprotokoll: 1) omfatta hela tjocktarmens längd, eftersom tarmslemhinnainflammation oftast är variabel och hoppa över lesioner är vanliga, 2) begränsa analysen till specifika nyckel- och lätttolkande parametrar för att minska subjektiviteten, 3) underlätta snabb, konsekvent bearbetning av ett stort antal prover och 4) använda allmänt tillgängliga och prisvärda verktyg för datainsamling, analys och presentation.
Här beskriver vi en teknik för att bearbeta hela tjocktarmen eller långa segment av tunntarmen i en "schweizisk rulle" konfiguration tillsammans med användningen av en fri datorstödd poängsättningssystem för att analysera intestinala slemhinneinflammation och skador på grund av DSS-inducerad kolit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrevs godkändes av University of Michigans kommitté för användning och vård av djur.
1. Vävnadsskörd
- Avliva möss humant med isofluranbedövning följt av livmoderhalsförskjutning, i enlighet med godkända protokoll. För alla djurförsök erhölls godkännande av en certifierad granskningsnämnd i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer för djurhantering.
- Placera musen på en dissekeringsplatta i ett supinläge. Immobilisera musens extremiteter med 20 G x 1 1/2-tums G-nålar.
- Använd tång och sax, gör ett litet snitt på bukhuden och dra den åt sidan för att exponera bukhinnan.
- Öppna bukhålan med ett mittlinjesnitt i bukhinnan från könsbenet till sidorna av buken.
- Ta försiktigt bort vävnader och organ tills tjocktarmen visualiseras. Skär bäckenbenet på båda sidor av tjocktarmen för att helt visualisera organet och sträck sig från anusen mot cecum.
- Ta försiktigt bort fett, små vener och artärer som är fästa vid tjocktarmen, samtidigt som du försiktigt dissekerar organet, skär bara proximalt till anus och bara distal till cecum.
OBS: Det dissekerade tjocktarmen ska förbli i rumstemperatur medan du slutför den schweiziska rullproceduren. - Spola försiktigt kolonet med 1x PBS, använd en flexibel plastdlande nål som sätts in genom anusen för att ta bort fekalt innehåll.
- Placera tjocktarmen i en rak linje och öppna längs längs den mesenteriala artären. Dela tjocktarmen längsgående från distala till proximala änden (figur 1A). Ena halvan av vävnaden kan användas för histologisk analys medan den andra kan bearbetas för western blot, PCR eller rullas in i en andra schweizisk rulle för färsk fryst immunofluorescensmikroskopi12.
2. Förberedelse av schweiziska rullar
- Trimma extra vävnad från proximalkolonet med ett rakblad tills ungefär samma bredd längs hela tjocktarmens längd erhålls.
- Justera tjocktarmen för att exponera lumen uppåt och platta till vävnaden helt med en flexibel sonderingsnål. Tillsätt mer PBS, om det behövs, för att hålla vävnaden fuktig under hela proceduren.
- Ta bort överskottet av PBS med en pappersservett. Tillsätt 10% neutral buffrad formalinlösning över vävnaden i 2-3 min med en spruta och sondningsnål för att fixa och platta till vävnaden.
- Använd raka tångar för att ta tag i änden av det distala tjocktarmen och vrid kolonet till koncentriska cirklar från den distala till proximala änden (Figur 1B).
OBS: Det är möjligt att trycka tillbaka insidan av den schweiziska rullen medan du rullar med pekfingret för att säkerställa att vävnaden är inuti rullen. - Sätt in en 27 G nål för att fästa kolonet i mitten för att hålla sin schweiziska rullform (Figur 1C).
- Placera den schweiziska rullen med nålen i en inbäddningskassett i en histologic provbehållare.
OBS: Vävnaden måste vara parallellorienterad med avseende på kassetten före fixering (figur 1D). - Fixera vävnaden i 10% neutral buffrad formalinlösning över natten vid 4 °C13.
- Efter fixering över natten, tvätta vävnaden 3x med PBS.
- Tillsätt 70% etanol till vävnaden före paraffininbäddningsprocessen. Ta bort nålen från den schweiziska rullen innan du fortsätter. Vävnad kan förvaras i etanol vid rumstemperatur tills paraffininbäddning13.
- Placera proverna i vävnadsprocessorn, bädda in i paraffin och förbered 4 μm sektioner, monterade på positivt laddade mikroskopibilder (figur 1E). Detta kan vara en valfri stopppunkt.
OBS: Korrekt vävnadsorientering är avgörande för att uppnå avsnitt som lämpar sig för bildanalys. Parallell schweizisk rullinbäddning i paraffinkassetten resulterar i fullständiga avsnitt som är lämpliga för bildanalys (Figur 1F-1H). Sneda sektioner måste undvikas för att förhindra ofullständiga avsnitt (figur 1I-1K). Mer information finns i avsnittet Diskussion. - Fläcksektioner med hematoxylin och eosin (H&E)13.
3. Digital skanning och analys
OBS: För noggrann utvärdering av slemhinnor, välj endast avsnitt som innehåller minst 90% av den totala kolonlängden.
- Skanna färgade avsnitt med en bildskanner eller bildläsare (se Materialförteckning). Bilder som produceras behöver en upplösning på 0,25 mikron per pixel med 40x mål och 40x förstoring.
- Installera och ladda ned en lämplig programvara för digital analys av skannade bilder (se Materialförteckning).
- Öppna skannade bilder i bildbehandlingsprogrammet (bild 2A). Kontrollera att hela kolonet är synligt och att det inte saknas några områden i exemplet.
- Aktivera verktygen för etikettbildaren och skalningslisten för att korrekt identifiera skannade bilder genom att klicka på Etikettbildare (Bild 2A).
- Öppna anteckningsverktyget genom att klicka på Anteckningar, (Bild 2A) och skapa 3 olika lager genom att klicka på Nytt lager (Figur 2B) för att kvantifiera den totala längden på den schweiziska rullen, inflammation / skada och erosion / sårbildning. Välj en annan färg för varje lager genom att klicka på Lagerfärg (Bild 2B).
- Mät längden på varje lager/kategori genom att klicka på ritstiftsverktyget (figur 2A), med hjälp av muskulasslemhinnan som referens:
- Visa bilden vid 400 μm zoom (eller mer) för att underlätta adekvat visualisering av muskulära slemhinnor.
OBS: Förstoringen styrs enkelt med musens rullningshjul och måste justeras vid behov när du rör dig över avsnittet för att rita alla linjer. - Klicka på ritstiftsverktyget för att rita en linje efter muskulössslemhinnan (Figur 2A). Flytta pekaren efter behov för att visualisera det intilliggande området för analys.
Obs: Varje gång pennan stoppas genereras en liten ny lagerregion. Den kan visualiseras och redigeras med fliken Lagerregioner (välj önskat segment och klicka på Ta bort lager vid misstag eller korrigeringar, bild 2B).
- Visa bilden vid 400 μm zoom (eller mer) för att underlätta adekvat visualisering av muskulära slemhinnor.
- När alla lager (figur 2C) har definierats exporterar du data med knappen Exportera rutnät till textfil i lagerområdena ( bild2B).
Spara filer ofta när du skapar lagren för att säkerställa att data lagras korrekt. - Öppna textfilerna och kopiera data med ett kalkylbladsprogram. Totalt alla segment från varje region och beräkna procentandelen skada och sårbildning med avseende på total längd.
- För att beräkna histologiska kolitpoängen (HCS) och för att utvärdera svårighetsgraden av sjukdomen, överväga tre huvudegenskaper som beskrivs nedan.
- Kontrollera om det finns friska tarmslemhinnor som kännetecknas av organiserade epitelceller i den kryptiska luminalaxeln, lamina propria med få immunceller och subjacent muscularis slemhinna som gränssnitt mellan slemhinnan och submukosa (figur 3A).
- Kontrollera om det finns inflammation/skada som kännetecknas av epitelkrypter som är försvagade eller delvis saknar epitelceller och slemhinneinflammation med neutrofiltration i krypter (figur 3B).
- Kontrollera förekomsten av erosion/sårbildning som kännetecknas av områden utan ytepitelet eller områden som helt saknar epitelkrypterade med eller utan tillhörande leukocyter (figur 3C).
- Beräkna HCS i skadade och ulcererade regioner uttryckt i procent av den totala längden i följande formel:
OBS: HCS kombinerar andelen inflammation/skada och erosion/sårbildning och lägger till en faktor på två till den senare, baserat på ett rimligt antagande att fullständig förlust av epitel resulterar i maximal förlust av barriärintegritet och därmed värre sjukdom. HCS representerar konsekvent de morfologiska förändringar som orsakas av DSS inducerad experimentell kolit. Intressant nog har vi inte sett ett tydligt samband mellan antalet colonic lymfoida aggregat eller folliklar och klinisk sjukdom allvarlighetsgrad i DSS kolit och därför inkluderade vi inte kvantifieringen i denna analys. - Ta en ögonblicksbild av de representativa bilderna (klicka på Ögonblicksbild, Bild 2A) och spara. Inkludera skalstreck om det behövs genom att klicka på Visa/dölj skalstreck (Bild 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera tillförlitligheten hos denna histologiska kolit poäng analys i samband med slemhinneskador efter DSS utmaning och efterföljande återhämtning från kolit, administrerade vi 2,5% DSS i dricksvatten av åtta 10 veckor gammal manliga C57BL6 vilda typ möss i 5 dagar följt av en återhämtningsperiod med regelbundet vatten i 5 dagar. Det fanns ingen förändring i kroppsvikten under akut administrering av DSS, från dag 0 till 5 (figur 4A). Kroppsvikten minskade dramatiskt efter dag 5, när möss började dricka vanligt kranvatten. Blod och mjuka avföring uppträdde efter 3 dagars administrering av DSS och fortsatte under de följande 3 dagarna på vatten fram till dag 8 i försöket (figur 4B). Dessa observationer tydde på att de mest skadliga effekterna av exponering för DSS observerades under återhämtningsperioden mellan dag 5 och 8. Mätningen av kolonlängden dag 10 bekräftade en betydande förkortning i slutet av försöket (figur 4C). Kolon skördades vid dagarna 0, 2, 5, 7, 8 och 10 för att göra paraffin schweiziska rullar. Vävnaden var fläckad med H&E och högupplösta skanningar (Figur 4D) analyserades för att beräkna histologiska kolitpoängen (figur 4E) och procentandelen skada och sårbildning (Figur 4F).
Figur 4D visar normal kryptarkitektur hos obehandlade C576BL6-möss, ytliga för muscularisslemhinnan och stöds av lamina propria (dag 0, pil). Efter 2 dagar av DSS administration observerades immun cell rekrytering (dag 2, pil). Dag 5 verkade epitelceller skadade, och det fanns en infiltration av neutrofiler över epitel (kryptit) i samband med epitelial skada (dag 5, pil). Från dag 5 till 8 noterades områden med epitelförlust med inflammation och ulceration (dag 7 och 8, pilar). Det senare observeras ofta eftersom mössen dricker regelbundet kranvatten under återhämtningsfasen. Slutligen börjar epitelceller regenerera och återbefolka ulcererade områden, långsamt återställa colonic slemhinnan vid dag 10 (pil).
HCS speglar noggrant en enkel bedömning av procentandelen inflammation/skada och erosion/sårbildning, och båda visar kvantitativt att det finns betydande skador på mössens kolon under återhämtning från DSS dag 5 till 10, vilket korrelerar med epitelerosioner och leukocytinfiltration som visas i figur 4D. Data från HCS skiljer mellan sjukdomens svårighetsgrad när det gäller inflammation i samband med epitelskada kontra erosion/sårbildning.
Dessa iakttagelser visar att det systematiska poängsystem för HCS som föreslås i detta protokoll utgör ett tillförlitligt verktyg för att kvantifiera slemhinnor.
Figur 1: Provberedning är avgörande för noggrann dataanalys. B)Schweizisk rullningsprocess. C)Nålinsättning för att hålla schweizisk rullform(D)paraffin inbäddning kassett. (E) Paraffinblock. F)Schweiziskrull parallell orientering för att undvika partiella sektioner. (G) Komplett schweizisk rulle, skalstång: 2 mm. (H) Idealisk sektion av colonic krypter, skalstång: 80 μm. (I) Sned schweizisk rullorientering. (J) Ofullständig schweizisk rulle, skalstång: 2 mm. (K) Sned sektion av colonic krypter, skalbar: 80 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2:Kvantitativ utvärdering av slemhinnor. (A) Grundläggande verktygsfält med snapshot, zoomreglage, visa/dölj skalstreck/axlar/rutnät, etikettbildare, anteckningar och pennverktygsfunktioner, bland andra. (B) Anteckningsmeny som visar lagerfärg, nytt lager, ta bort lager, visa/dölja lager, ta bort region och exportera rutnät till textfilknappar. (C) Översikt över total längd, skadade och ulcererade lager, skalstång: 3 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Morfologi av musens tarmslemhinna fläckad med hematoxylin & eosin efter akut DSS-experimentell kolit följt av återhämtning. (A) Friska tarmceller organiserade i colonic krypter omgivna av lamina propria och separerade från submucosa av muscularis slemhinnan, skalbar: 200 μm. (B) Akut mukosal inflammation eller skada med infiltration av neutrofiler i slemhinnan och kryptan epitel, associerad med krypt epitelial förvrängning/förlust och epitelial dämpning, skalstång: 200 μm. (C) Ulcerated eller eroderade områden med fullständig epitelial förlust och tillhörande inflammation., skalstång: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologisk kolitpoäng och procentandel av skada och sår korrelerar med kroppsvikt och avföringsindex under DSS experimentell kolit: (A) Kroppsvikt och (B) avföringsindex utvärderas dagligen hos vilda möss behandlade med 2, 5% DSS i 5 dagar (röd linje), följt av 5 dagars återhämtning på vatten (svart linje). Data är representativa för två oberoende experiment med minst 4 möss per grupp och uttrycks som medelvärde ± SEM. Betydelsen bestäms av tvåvägs ANOVA och Sidak multipla jämförelser, *p<0.033, **p<0.002 och ***p<0.001. (C) Kolonlängden hos möss mättes dag 10. Data är representativa för två oberoende experiment med minst 3 möss per grupp och uttrycks som medelvärde ± SEM. Betydelsen bestäms av tvåsidiga students t-test, ***p<0.001. (D) Hematoxylin och eosin (H&E)-färgade vävnadsdelar av colonic slemhinnor analyserades för att beräkna, skalstänger: 60 μm. (E) Histologiska kolit poäng (HCS) och procentandel av skada/ulceration i förhållande till längden på kolon. Data är representativa för två experiment med 2 möss per grupp och uttrycks som medelvärde ± SEM. Betydelsen bestäms av envägs ANOVA och Tukey multipla jämförelser, *p<0.033, **p<0.002 och ***p<0.001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt histologiska kolitpoängsystem utgör ett pålitligt verktyg för att kvantifiera vävnadsinflammation och skador i tarmen. Detta tillvägagångssätt ger en förbättrad förståelse för det histopatologiska tillståndet i hela organet utan partiskhet att välja små områden eller ofullständiga avsnitt. Bland de kritiska stegen för att framgångsrikt utföra detta protokoll är korrekt förberedelse av schweiziska rullar som möjliggör analys av minst 90% av tjocktarmens längd; Parallell orientering under paraffinbäddning och sektionering för att säkerställa raka och enhetliga vävnadssektioner med längsgående vyer av epitelkrypterade krypter. Praktik och utbildning med övervakning från en erfaren patolog för att bekräfta att praktikanter identifierar skillnaderna mellan akut inflammation, epitelskada och erosion/sårbildning. och tillgång till en högupplöst digital skanner.
Små justeringar och felsökning krävs för att på lämpligt sätt orientera den schweiziska rullen under paraffininbäddning samt under sektionering för att säkerställa att vävnaden är parallellorienterad i förhållande till paraffinkassetten och bladet (figur 1E-F). Att följa denna rumsliga orientering kommer att minska antalet ofullständiga sektioner. Om tjocktarmen är perfekt rullad på sig själv, kommer de bästa sektionerna inklusive det mesta av vävnadslängden att ligga nära mitten av den schweiziska rullen (Figur 1F). Att samla flera sektioner ökar avsevärt chansen att få välorienterade sektioner där kryptornas hela längd är synlig (Figur 1G-H). Undvik att dela upp sneda schweiziska rullar (Figur 1I-J), kännetecknad av cirkulärformade krypter eller krypt munkar (Figur 1K). Ofta rekommenderas visualisering av de sektioner som samlas in under mikroskopet starkt för att säkerställa korrekt teknik. Ett bra avsnitt fångar hela tjocktarmens längd.
Alla instrument som gör det möjligt att fånga hela längden på den schweiziska rullen och ger den upplösning som behövs för att förstora vävnaden för att visualisera kryptarkitekturen är tillräcklig för utvärdering av HCS. Vissa mikroskop tillåter överlappning av små bilder och rekonstruerar hela vävnadssektioner. Upplösningen av dessa bilder kan dock vara dålig efter ökande förstoring för att poängta vävnaden. Dessutom kanske överlappningen av sektioner inte är perfekt, vilket lämnar områden av vävnad som inte är väldefinierade och omöjliga att exakt poäng.
Bland fördelarna med poängprotokollet som föreslås här är klassificeringen av vävnaden i endast två kategorier inflammation / skada eller erosion / ulceration. Detta förenklar och påskyndar klassificeringen av vävnadsskador, samtidigt som reproducerbarheten ökar. Programvaran som används för analysen är tillgänglig, gratis och enkel att använda. HCS återspeglar noggrant slemhinnor skador, eftersom det möjliggör kvantifiering av ulcerated områden längs hela längden av tjocktarmen och på lämpligt sätt ger mer vikt mot denna patologi över inflammerade, icke-ulcerated regioner. Detta återspeglas tydligt när HCS-data jämförs jämfört med procentandelen skada/sårbildning (figur 4E-F). Poängsättningsanalys av varje prov tar cirka 40 minuter. Med lämplig utbildning, tillgång till skannade bilder, en dator och programvaran kan de flesta forskare utföra analysen. Det är dock alltid tillrådligt att bekräfta poängresultat med en patolog för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet. Bedömning av tarminflammation kan utföras med alla program som möjliggör högupplöst förstoring av diabilder och längdmätningar; Men för enkelhetens skull fokuserade vi i detta protokoll på programvaran som anges i materialförteckningen.
Vi har använt detta poängsystem för att framgångsrikt analysera sjukdomar över olika DSS-kolitexperiment. Till exempel undersökte Kelm et al.14 vikten av glykosylering av CD44v6, en viktig regulator för epitelmigration och spridning, med hjälp av en ny antikropp (GM35). De visade minskad sjukdom verksamhet index poäng och förbättrad HSC hos möss utmanas med akut DSS efter inriktning av sialyl lewis A glykaner på epitelial CD44v6, bekräftar vikten av post translationell modifiering av CD44 varianter för återhämtning efter DSS inducerad skada14. I ett annat exempel använde Reed et al.15 en kronisk DSS-modell för att studera slemhinna skada och reparation hos möss med en epitelial specifik borttagning av CD47, ett transmembranprotein som är viktigt för inflammatoriska och reparationsprocesser. Kolon skanningar analyserades och poängsätts för att beräkna andelen skada och ulceration som beskrivs ovan, visar markant nedsatt slemhinna reparation hos möss saknar epitelial CD4715. Den kroniska kolit modellen i denna rapport använde cyklisk administration av DSS att analysera skada och reparation över tid.
Ytterligare publikationer från vår grupp och andra har visat fördelarna med detta poängsystem och dess korrelation med kliniska symtom6,16,17. Detta protokoll beskriver i detalj hur man förbereder och poäng schweiziska rullar, med hjälp av gratis och lättillgänglig programvara. Enkelheten i den poängsättning som föreslås här är baserad på användning av endast två kategorier (inflammation / skada eller erosion / ulceration) i skannade bilder för att underlätta poängprocessen och öka reproducerbarheten. Viktigt, poängsystemet som beskrivs här korrelerar också med kliniska parametrar för intestinala inflammation. Sammanfattningsvis är Histological Colitis Score ett verktyg som kan användas för att kvantitativt poäng DSS-kolit och kan tillämpas på andra kolitmodeller i samband med inflammation och epitelial skada / förlust.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från NIH-finansiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 och University of Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
