Summary
무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.
Abstract
뮤린 대장염 모델은 염증성 장 질환의 병리학을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구에서 광범위하게 사용되는 도구입니다. 그러나 질병 심각도의 객관적이고 재현 가능한 정량화를 위한 강력한 표준은 정의되어야 합니다. 대부분의 대장염 분석 방법은 소장의 작은 세그먼트의 제한된 조직학 점수에 의존하여 부분적 또는 편향된 분석으로 이어집니다. 여기서, 우리는 전체 결장의 고해상도 영상 수집 및 세로 분석을 결합하여 뮤린 대장염의 유도된 탈파나트륨(DSS)에서 장 내 부상 및 궤양을 정량화한다. 이 프로토콜은 광범위한 사용자 교육 없이 객관적이고 재현 가능한 결과를 생성할 수 있도록 합니다. 여기서는 DSS 유도 대장염의 데이터 예를 사용하여 샘플 준비 및 이미지 분석에 대한 포괄적인 세부 정보를 제공합니다. 이 방법은 점막 손상과 관련된 중요한 염증이있는 뮤린 대장염의 다른 모델에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 우리는 결장의 전체 길이에 비해 염증 / 부상 및 침식 / 궤양 점막의 분획이 DSS 유발 질병 진행 중 체중 감소와 같은 임상 연구 결과를 유사하게 한다는 것을 보여줍니다. 이 조직학적 프로토콜은 DSS 대장염 실험에서 편견없는 방식으로 질병 활동의 분석을 표준화하는 신뢰할 수있는 시간과 비용 효율적인 원조를 제공합니다.
Introduction
위장관 상피 장벽은 기본 조직 구획1에서발광 항원 및 병원균을 분리하는 데 중추적 인 역할을한다. 염증성 장 질환 (IBD), 허혈 또는 외과 적 부상과 같은 병리학 적 조건에서 볼 수있는 상피 손상 및 점막 상처는 설사, 체중 감소, 대변의 혈액 및 복통을 포함하는 임상 증상과 관련이 있습니다. 상해에 응하여, 상피 세포는 점막 결점을 다시 상형화하고 복구하기 위하여 이주하고 증식합니다. 점막 무결성의 염증 및 배상금의 해결은 장 점막 항상성 및 기능2,3,4를재확립하는 데 매우 중요합니다.
다양한 동물 모델은 장 상피 장벽의 손상과 관련된 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해 사용되었습니다. 화학적으로 유도된 대장염의 잘 확립되고 쉽게 적용 가능한 모델은 특히 IBD와 같은 염증성 손상과 관련된 연구에서 널리 사용됩니다. 일반적인 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 뮤린 대장염 모델은 요염 나트륨(DSS)을 매개한 대장 상해와 염증을 사용합니다. 질병의 중증도는 마우스 변형, DSS 투여 량, DSS 투여 길이 및 DSS5,6,7의분자량에 따라 다릅니다.
DSS 대장염 중 장 점막 손상은 일반적으로 체중 감소, 대변 혈중 및 대변 일관성에 의해 결정되는 복합 점수인 질병 활동 지수(DAI)를 사용하여 평가됩니다. 대변 혈액 함량은 현미경 (대변 과이악 산 검사를 사용하여 검출) 또는 거시화 될 수 있습니다; 대변 일관성은 하드, 소프트 또는 액체 (즉, 설사) 5,8로분류된다. 이러한 임상 매개 변수의 점수는 주관적이고 사용자의 경험과 편견에 따라 달라질 수 있지만 전반적으로 데이터는 신뢰할 수있는 정보를 제공하고 IBD 연구원이 널리 사용됩니다. 대조적으로, 점막 손상의 조직학적 평가를 위한 일반적으로 허용되는 방법은 없습니다. 가장 일반적으로, 결장의 선택된 지역은 훈련된 병리학자에 의해 검사되고 일반적으로 토굴 손상 및 백혈구 침투9,10,11을포함하는 몇몇 매개변수를 기준으로 득점됩니다. 그러나, 조사된 파라미터의 수와 분석된 조직의 양은 개별 보고 사이에서 상당히 다르기 때문에, 많은 간행된 연구 결과의 비교는 제한됩니다. 관찰자 편향을 줄이고 연구 간 일치를 향상시키기 위해 이상적인 조직적 채점 프로토콜은 1) 대장의 전체 길이를 포함해야 한다: 장 점막 염증이 가장 자주 가변적이고 병변이 일반적이기 때문에, 2) 특정 키에 대한 분석을 제한하고 쉽게 해석 할 수있는 매개 변수로 주관성을 감소시키고, 3) 많은 수의 샘플 및 4) 널리 사용할 수있는 데이터 및 4) 사용 가능한 데이터 제공에 사용할 수 있습니다.
여기서우리는 DSS 유도 대장염으로 인해 장 점막 염증및 손상을 분석하기 위해 무료 컴퓨터 보조 점수 시스템의 사용과 함께 "스위스 롤"구성으로 소장의 전체 결장 또는 긴 세그먼트를 처리하는 기술을 설명합니다.
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Protocol
설명된 모든 동물 실험은 동물의 사용 및 배려에 미시간 대학의 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 조직 수확
- 승인된 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구다음에 이소플루란 마취를 사용하여 인간적으로 마우스를 안락사시. 모든 동물 실험에 대해 동물 취급에 대한 국가 및 기관의 지침에 따라 인증 된 검토 위원회에 의해 승인을 받았습니다.
- 마우스를 해부 패드에 양분 패드에 놓습니다. 20 G x 1/2 인치 G 바늘을 사용하여 마우스 사지를 고정합니다.
- 집게와 가위를 사용하여 복부 피부에 작은 절개를하고 옆으로 당겨 복막을 노출시합니다.
- 복막뼈에서 복부 의 측면에 이르기까지 복막에 중간개절로 복강을 엽니다.
- 내장이 시각화될 때까지 조직과 장기를 신중하게 제거합니다. 결장의 양쪽에 있는 골반 뼈를 잘라 내어 항문에서 cecum쪽으로 확장된 장기를 완전히 시각화합니다.
- 결장에 부착된 지방, 작은 정맥 및 동맥을 부드럽게 제거하고, 조심스럽게 장기를 해부하면서 항문과 근위를 자르고 cecum에 단면으로 절단하십시오.
참고: 해부된 결장은 스위스 롤 절차를 완료하는 동안 실온에 머물러야 합니다. - 항문을 통해 삽입된 유연한 플라스틱 개비지 바늘을 사용하여 대변 내용물을 제거하여 1배 PBS로 결장들을 조심스럽게 플러시합니다.
- 결장은 직선으로 배치하고, 간질 동맥을 따라 세로로 엽니다. 결장과 근위쪽 끝에 경구로 결장(도1A)을양분한다. 조직의 절반은 조직 학적 분석을 위해 사용될 수 있으며 다른 하나는 서부 블롯, PCR 또는 신선한 냉동 면역 형광 현미경 검사법(12)에대한 두 번째 스위스 롤로 압연 될 수 있습니다.
2. 스위스 롤 준비
- 전체 결장의 길이를 따라 거의 동일한 폭이 얻어질 때까지 면도날을 사용하여 근위 결장에서 여분의 조직을 다듬는다.
- 결장정렬하여 루멘을 향상에 노출시키고 유연한 개비지 바늘을 사용하여 조직을 완전히 평평하게 합니다. 더 많은 PBS를 추가, 필요한 경우, 절차 전반에 걸쳐 조직을 촉촉하게 유지 하기 위해.
- 종이 닦아 PBS의 초과를 제거합니다. 주사기 와 gavage 바늘로, 조직을 고치고 평평하게하기 위해 2-3 분 동안 조직에 10 % 중성 완충 포어틴 용액을 추가합니다.
- 직선 집게를 사용하여 결단결의 끝을 잡고 결장결을 원심 끝에서 근위 쪽 끝에 동심원으로 비틀어넣습니다(도1B).
참고: 에이핑거를 사용하여 압연하면서 스위스 롤 내부를 밀어낼 수 있어 조직이 롤 내부에 있는지 확인할 수 있습니다. - 27 G 바늘을 삽입하여 중간에 결장고정하여 스위스 롤모양(그림 1C)을고정합니다.
- 스위스 롤에 바늘을 넣은 카세트에 내장된 카세트에 넣습니다.
참고: 조직은 고정하기 전에 카세트에 대하여 병렬로 지향되어야합니다(도 1D). - 4°C13에서하룻밤 사이에 10% 중성 완충 포어틴 용액으로 조직을 고정한다.
- 하룻밤 고정 후, PBS로 조직을 3 배 세척합니다.
- 파라핀 포함 공정 전에 조직에 70% 에탄올을 추가합니다. 진행하기 전에 스위스 롤에서 바늘을 제거합니다. 조직은 파라핀임베디먼트(13)까지실온에서 에탄올에 보관할 수 있다.
- 샘플을 티슈 프로세서에 넣고 파라핀에 내장되어 있으며, 양전하 현미경슬라이드(그림 1E)에장착된 4μm 섹션을 준비합니다. 이는 선택적 정지 지점일 수 있습니다.
참고: 적절한 조직 배향은 이미지 분석에 적합한 섹션을 달성하는 데 중요합니다. 파라핀 카세트에 평행 스위스 롤 을 포함하면 이미지 분석에 적합한 전체 섹션이 생성됩니다(그림 1F-1H). 경사 섹션은 불완전한 섹션을 방지하기 위해 피해야합니다(그림 1I-1K). 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - 헤마톡시린과 에신(H&E)13을가진 스테인 섹션 .
3. 디지털 스캐닝 및 분석
참고: 점막 변경에 대한 정확한 평가를 위해 전체 결장 길이의 90% 이상을 포함하는 섹션만 선택합니다.
- 슬라이드 스캐너 또는 이미저를 사용하여 스테인드 섹션을 스캔합니다(재료 표참조). 생성된 이미지는 40배 목표와 40배 배율로 픽셀당 0.25 미크론의 해상도가 필요합니다.
- 스캔한 슬라이드의 디지털 분석을 위한 적절한 소프트웨어를 설치하고 다운로드합니다(자료 표참조).
- 이미지 프로세싱소프트웨어(그림 2A)에서스캔된 이미지를 엽니다. 전체 결장이 표시되고 샘플의 누락된 영역이 없는지 확인합니다.
- 레이블 이미저를 활성화하고 막대 도구를 조정하여 레이블 이미저(그림 2A)를클릭하여 스캔된 슬라이드를 올바르게 식별합니다.
- 주석 도구를 열고 주석 도구를열고(그림 2A)을클릭하여 3개의 상이다른 층(도 2B)을클릭하여 스위스 롤, 염증/부상 및 침식/궤양을 정량화한다. 레이어 색상(그림 2B)을클릭하여 각 레이어에 대해 다른 색상을 선택합니다.
- 각 층/범주의 길이를 펜도구(그림 2A)를클릭하여 근막 점막을 참고로 사용하여 측정합니다.
- 근육점막의 적절한 시각화를 용이하게 하기 위해 400 μm 줌(또는 그 이상)에서 이미지를 본다.
참고: 배율은 마우스 스크롤 휠을 사용하여 쉽게 제어되며 모든 선을 그리려면 섹션을 가로질러 이동하는 동안 필요에 따라 조정해야 합니다. - 펜 도구를 클릭하여 근육점막(그림2A)에따라 선을 그립니다. 필요에 따라 포인터를 이동하여 분석을 위해 인접한 영역을 시각화합니다.
참고: 펜이 중지될 때마다 작은 새 레이어 영역이 생성됩니다. 레이어 영역 탭으로 시각화하고 편집할 수 있습니다(원하는 세그먼트를 선택하고 실수 또는 수정시 레이어 삭제를 클릭합니다.
- 근육점막의 적절한 시각화를 용이하게 하기 위해 400 μm 줌(또는 그 이상)에서 이미지를 본다.
- 모든레이어(그림 2C)가정의되면, 레이어 영역 옵션(그림2B)내의 텍스트 파일 버튼으로 내보내기 그리드를 사용하여 데이터를 내보냅니다.
참고: 데이터가 제대로 저장되도록 레이어를 만드는 동안 파일을 자주 저장합니다. - 텍스트 파일을 열고 스프레드시트 소프트웨어로 데이터를 복사합니다. 각 지역의 모든 세그먼트를 합산하고 총 길이에 대한 부상 및 궤양의 백분율을 계산합니다.
- 조직학 대장염 점수(HCS)를 계산하고 질병의 심각성을 평가하기 위해 아래와 같이 세 가지 주요 특성을 고려하십시오.
- 폐구 발광축에서 조직된 상피 세포, 면역 세포가 적은 라미나 프로프리아, 점막과 아부코사(그림3A)를계면한 서브자센트 근육점막이 특징인 건강한 장점막을 확인한다.
- 소굴로 침투하여 감쇠또는 부분적으로 누락된 상피 세포 및 점막 염증을 특징으로 하는 염증/상해를 확인하십시오(그림3B).
- 표면 상피가 없는 영역또는 연관된 백혈구(도3C)의유무에 관계없이 상피 토굴이 완전히 결여된 영역을 특징으로 하는 침식/궤양의 존재를 확인한다.
- 다음 수식에서 총 길이의 백분율로 표현된 부상 및 궤양 영역의 HCS 계산:
참고: HCS는 염증/부상 및 침식/궤양의 백분율을 결합하여 상피의 완전한 손실이 장벽 무결성의 최대 손실을 초래하고 따라서 더 나쁜 질병을 초래한다는 합리적인 가정에 근거하여 후자에 2의 요인을 추가합니다. HCS는 일관되게 DSS 유도된 실험 대장염에 기인한 형태학적 변화를 나타냅니다. 흥미롭게도, 우리는 DSS 대장염에 있는 결장 림프골 집계 또는 여포 및 임상 질병 엄격의 수 사이 명확한 상관관계를 보이지 않았고, 그러므로, 우리는 이 분석에 정량화를 포함하지 않았습니다. - 대표 이미지의 스냅샷을 찍고(스냅샷클릭, 그림 2A)을클릭하고 저장합니다. 표시/숨기기 스케일 표시 (그림 2A)를클릭하여 필요한 경우 스케일 막대를 포함합니다.
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Representative Results
DSS 도전 후 점막 손상의 맥락에서 이러한 조직학 대장염 점수 분석의 신뢰성을 설명하기 위해, 우리는 5 일 동안 일반 물로 회복 기간을 5 일 동안 8 10 주 된 남성 C57BL6 야생 형 마우스의 식수에 2.5 % DSS를 투여했습니다. DSS의 급성 투여 시 체중에 변화가 없었으며, 0일부터5일째(도 4A)까지. 쥐가 일반 수돗물을 마시기 시작했을 때 체중이 5일째 에 크게 감소했습니다. 혈액 및 연약한 발판은 DSS 투여 3일 후에 나타났고, 실험8일째까지 물에서 3일 동안 계속하였다(도4B). 이러한 관측은 DSS에 노출의 가장 해로운 효력이 일 5와 8 사이 복구 기간 도중 관찰되었다는 것을 건의했습니다. 10일째에 결장 길이를 측정하여 실험이 끝날 때 상당한 단축을 확인하였다(도4C). 콜론은 파라핀 스위스 롤을 만들기 위해 일 0, 2, 5, 7, 8, 10일에 수확되었다. 조직은 H&E 및 고화질검사(도 4D)로염색되어 조직학 대장염 점수(도4E)및 부상 및 궤양비율(도4F)을계산하기 위해 분석되었다.
도 4D는 처리되지 않은 C576BL6 마우스에서 정상적인 토굴 아키텍처를 나타내며, 근육점막에 피상적이며 라미나 프로프리아(일0, 화살표)에 의해 지원된다. DSS 투여 2일 후 면역세포 모집(2일째, 화살)이 관찰되었다. 5일째에는 상피 세포가 손상된 것으로 나타났고, 상피 손상(5일째, 화살)과 관련된 상피(cryptitis)를 통해 호중구가 침투했습니다. 5일째부터 8일까지 염증과 궤양을 가진 상피 손실 부위(7일과 8일, 화살)가 지적되었다. 후자는 일반적으로 쥐가 회복 단계 동안 일반 수돗물을 마실 때 관찰된다. 마지막으로 상피 세포는 궤양 부위를 재생하고 다시 채우기 시작하여 10일째 (화살표)에 대장 점막을 천천히 복원합니다.
HCS는 염증/부상 및 침식/궤양의 비율에 대한 간단한 평가를 밀접하게 반영하며, 둘 다 도 4D에나타난 상피 침식 및 백혈구 침윤과 상관관계가 있는 5일째에서 10일째에 DSS에서 회복하는 동안 마우스의 결장에 상당한 손상이 있음을 정량적으로 입증한다. HCS가 제공한 데이터는 상피 손상과 관련된 염증과 침식/궤양과 관련하여 질병의 심각도를 구별합니다.
이러한 관측은 이 프로토콜에 제안된 HCS의 체계적인 채점 시스템이 점막 손상을 정량화하는 신뢰할 수 있는 도구를 구성한다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 샘플 준비는 정확한 데이터 분석을 위해 매우 중요합니다. (A)단장 결장은 완전히 확장되고 간질 동맥을 따라 열립니다. (B)스위스 압연 공정. (C)스위스 롤형상(D)파라핀 포함 카세트를 보유하는 바늘 삽입. (E)파라핀 블록. (F)부분 단면을 피하기 위해 스위스 롤 병렬 방향. (G)완전한 스위스 롤, 스케일 바 : 2mm.(H)콜로니 토굴의 이상적인 섹션, 스케일 바 : 80 μm.(I)경사 스위스 롤 오리엔테이션. (J)불완전한 스위스 롤, 스케일 바: 2mm.(K)식민지 토굴의 경사 구간, 스케일 바: 80 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 점막 손상의 정량적 평가. (A)스냅샷, 줌 슬라이더, 비늘 막대/축/그리드 표시/숨기기, 라벨 이미저, 주석 및 펜 도구 기능 등이 있는 기본 도구 막대. (B)레이어 색상, 새 레이어, 삭제 레이어, 레이어 표시/숨기기, 영역 삭제 및 그리드를 텍스트 파일 단추로 표시하는 주석 메뉴. (C)총 길이, 부상 및 궤양 층의 개요, 스케일 바 : 3mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 급성 DSS 실험 대장염 후 헤마톡신린과 에신으로 염색된 마우스 장점막의 형태학이 회복에 따른것이다. (A)라미나 프로프리아로 둘러싸인 대장 내 토굴로 조직된 건강한 장세포는 근육점막, 스케일 바에 의해 아부코사에서 분리: 200 μm.(B)급성 점막 염증 또는 손상으로 점막과 토피에 침투하여 점막과 오피상부와 관련된 스케일 바: 200 μm.(C)완전한 상피 손실 및 관련 염증이 있는 울혈 또는 침식된 영역., 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DSS 실험 대장염 중 체중 및 대변 지수와 관련된 조직학적 대장염 점수 및 비율( A)체중 및(B)대변 지수는 5일 동안 2.5%의 DSS(레드 라인)로 처리된 야생형 마우스에서 매일 평가되며, 5일간의 물(블랙 라인)에서 회복됩니다. 데이터는 그룹당 적어도 4마리의 마우스를 갖는 두 개의 독립적인 실험을 대표하며, SEM의 평균± 의미로 표현되며, 의미는 양방향 ANOVA 및 시닥 다중 비교, *p<0.033, **p<0.002 및 ***p<0.001에 의해 결정된다. (C)마우스의 결장 길이는 10일째에 측정하였다. 데이터는 그룹당 적어도 3마리의 마우스를 갖는 2개의 독립적인 실험을 대표하며, SEM에 ± 평균으로 표현<됩니다. (D)헤마톡시린과 에오신(H&E)-대장점막의 염색조직 구간을 계산하여, 스케일바: 60 μm.(E)조직학 대장염 점수(HCS) 및 결장의 길이에 비해 부상/궤양의 백분율을 계산하기 위해 분석하였다. 데이터는 그룹당 2마리의 마우스를 갖는 두 가지 실험을 대표하며, 의미 ± SEM으로 표현되며, 의미는 ANOVA 및 Tukey 다중 비교, *p<0.033, **p<0.002 및 *p<0.001에 의해 결정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 조직학 대장염 점수 시스템은 내장의 조직 염증과 손상을 정량화하는 신뢰할 수있는 도구를 구성합니다. 이 접근법은 작은 지역 또는 불완전한 단면도의 선택의 편견 없이 전체 기관의 조직 병리학 상태의 향상된 이해를 제공합니다. 이 프로토콜을 성공적으로 실행하는 중요한 단계 중에는 결장 길이의 90% 이상을 분석할 수 있는 스위스 롤을 적절히 준비하는 단계입니다. 파라핀 포함 및 단면 동안 병렬 방향은 상피 지하실의 세로 보기를 가진 직선적이고 균일 한 조직 섹션을 보장하기 위해; 숙련 된 병리학자의 감독과 연습 및 훈련 연수생 급성 염증 사이의 차이를 식별 확인, 상피 손상, 침식 / 궤양; 고해상도 디지털 스캐너에 액세스할 수 있습니다.
작은 조정 및 문제 해결은 파라핀 포함 시 스위스 롤을 적절히 방향을 지정해야 하며 단면화 중에 는 파라핀 카세트 및 블레이드(도1E-F)에비해 조직이 병렬 지향되도록 해야 합니다. 이 공간 방향을 준수하면 불완전한 섹션의 수가 줄어듭니다. 결장이 완벽하게 압연되면 대부분의 조직 길이를 포함한 최고의 섹션이 스위스 롤(그림1F)의중간 근처에 위치하게 됩니다. 여러 섹션을 수집하여 토굴의 전체 길이가 보이는 잘 지향적인 섹션을 얻을 확률이 크게 증가합니다(그림1G-H). 경사 스위스 롤(그림 1I-J)을 분리하지 마십시오(그림1I-J),원형 모양의 토굴 또는 토굴 도넛(그림1K)이특징입니다. 종종 현미경에 따라 수집 된 섹션의 시각화는 적절한 기술을 보장하기 위해 강력하게 권장됩니다. 좋은 섹션은 결장의 전체 길이를 캡처합니다.
스위스 롤의 전체 길이를 캡처할 수 있고 토굴 아키텍처를 시각화하는 조직을 확대하는 데 필요한 해상도를 제공하는 모든 계측기는 HCS 의 평가에 적합합니다. 몇몇 현미경은 작은 심상의 중첩을 허용하고 전체 조직 단면도를 재구성합니다. 그러나, 이러한 이미지의 해상도 조직을 점수 배율을 증가 후 가난한 수 있습니다. 또한, 섹션의 중복은 완벽하지 않을 수 있습니다, 잘 정의되지 않고 정확하게 점수를 불가능 조직의 영역을 떠나.
여기서 제안된 점수 프로토콜의 장점 중에는 염증/부상 또는 침식/궤양이 두 가지 범주에서 만 조직의 분류가 있습니다. 이것은 조직을 단순화하고 조직 손상의 분류를 가속화하고 재현성을 증가시면 가속화됩니다. 분석에 사용되는 소프트웨어는 액세스 가능하고 무료이며 사용하기 쉽습니다. HCS는 결장의 전체 길이를 따라 궤양 부위를 정량화할 수 있고 염증이 없는 비궤양 부위를 통해 이 병리학에 더 많은 무게를 적절히 제공하기 때문에 점막 손상을 정확하게 반영합니다. 이는 HCS 데이터가 부상/궤양 비율과 비교될 때 명확하게 반영됩니다(그림4E-F). 각 샘플의 채점 분석은 약 40분이 소요됩니다. 적절한 교육, 스캔된 슬라이드, 컴퓨터 및 소프트웨어에 대한 액세스를 통해 대부분의 연구원은 분석을 수행할 수 있습니다. 그러나 정확성과 재현성을 보장하기 위해 병리학자와 점수 매기기 결과를 확인하는 것이 좋습니다. 장 염증의 평가슬라이드 및 길이 측정의 고해상도 배율을 허용하는 모든 소프트웨어와 함께 수행 될 수있다; 그러나 단순성으로이 프로토콜에서는 재료 표에 나열된 소프트웨어에 중점을 두습니다.
우리는 다양한 DSS 대장염 실험에서 질병을 성공적으로 분석하기 위해이 점수 시스템을 사용하고 있습니다. 예를 들어, Kelm외. 14는 새로운 항체(GM35)를 사용하여 상피 이동 및 증식의 중요한 조절기관인 CD44v6의 글리코실화의 중요성을 탐구했다. 그(것)들은 상피 CD44v6에 실릴 루이스 A 글리칸의 표적으로 다음 급성 DSS로 도전한 마우스에 있는 감소된 질병 활동 지수 점수 및 향상한 HSC를 보여주었습니다, DSS 유도 상해 후 회복을 위한 CD44 변이체의 포스트 번역 수정의 중요성을확인함 14. 또 다른 예에서, Reed et al.15는 염증 및 수리 과정에 중요한 막 단백질인 CD47의 상피 특이적 결실을 가진 마우스에서 점막 손상을 연구하고 수리하기 위해 만성 DSS 모델을 사용하였다. 대장 검사는 상피 CD4715가부족한 마우스에서 현저하게 손상된 점막 수리를 입증하여 상술한 바와 같이 부상및 궤양의 백분율을 계산하기 위해 분석 및 득점하였다. 이 보고서의 만성 대장염 모델은 DSS의 순환 투여를 사용하여 부상을 분석하고 시간이 지남에 따라 수리했습니다.
우리 그룹 및 다른 사람들의 추가 간행물은 이 채점 시스템의장점과 임상 증상6,16, 17과의상관 관계를입증하였다. 이 프로토콜은 자유롭고 쉽게 액세스할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 스위스 롤을 준비하고 점수를 매기는 방법을 자세히 설명합니다. 여기서 제안된 점수의 단순성은 득점 과정을 용이하게하고 재현성을 높이기 위해 스캔된 슬라이드에서 두 가지 범주(염증/부상 또는 침식/궤양)만 사용하는 것을 기반으로 합니다. 중요한 것은, 여기에서 기술된 채점 시스템은 또한 장 염증의 임상 파라미터와 상관관계가 있습니다. 결론적으로, 조직학 대장염 점수는 DSS-대장염을 정량적으로 득점하는 데 사용할 수 있는 도구이며 염증 및 상피 손상/손실과 관련된 다른 대장염 모델에 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 NIH 자금 DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 및 미시간 대학 병리학 슬라이드 스캐닝 서비스의 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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