Summary
एक मुफ्त कंप्यूटर-असिस्टेड सिस्टम का उपयोग करके आंतों की सूजन का व्यवस्थित स्कोरिंग अल्सर और भड़काऊ परिवर्तनों की उपस्थिति की विशेषता वाले कोलाइटिस मॉडल में हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों की मात्रात्मक रूप से तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर मूल्यांकन नैदानिक टिप्पणियों को मजबूत करता है और डेटा व्याख्या की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
मुरीन कोलाइटिस मॉडल ऐसे उपकरण हैं जो भड़काऊ आंतों के विकारों के रोगविज्ञान को समझने पर केंद्रित अध्ययनों में बड़े पैमाने पर कार्यरत हैं। हालांकि, रोग गंभीरता के उद्देश्य और प्रजनन योग्य मात्राकरण के लिए मजबूत मानकों को परिभाषित किया जाना बाकी है । अधिकांश कोलाइटिस विश्लेषण विधियां आंत के छोटे खंडों के सीमित हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग पर निर्भर करती हैं, जिससे आंशिक या पक्षपातपूर्ण विश्लेषण होते हैं। यहां, हम मुरीन कोलाइटिस के डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) प्रेरित मॉडल में आंतों की चोट और अल्सर को निर्धारित करने के लिए पूरे पेट के उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण और देशांतर विश्लेषण को जोड़ते हैं। यह प्रोटोकॉल व्यापक उपयोगकर्ता प्रशिक्षण के बिना उद्देश्य और प्रजनन योग्य परिणामों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यहां, हम DSS प्रेरित कोलाइटिस से डेटा के उदाहरणों का उपयोग करके नमूना तैयारी और छवि विश्लेषण पर व्यापक विवरण प्रदान करते हैं। इस विधि को आसानी से मुरीन कोलाइटिस के अन्य मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिनमें म्यूकोसल चोट से जुड़ी महत्वपूर्ण सूजन है। हम प्रदर्शित करते हैं कि कोलन की पूरी लंबाई के सापेक्ष सूजन/घायल और क्षीण/अल्सर म्यूकोसा का अंश DSS-प्रेरित रोग प्रगति के बीच वजन घटाने जैसे नैदानिक निष्कर्षों को बारीकी से समानताएं देता है । यह हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल डीएसएस कोलाइटिस प्रयोगों में निष्पक्ष तरीके से रोग गतिविधि के विश्लेषणों को मानकीकृत करने के लिए एक विश्वसनीय समय और लागत प्रभावी सहायता प्रदान करता है।
Introduction
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल एपिथेलियल बैरियर ल्यूमिनल एंटीजन और रोगजनकों को अंतर्निहित ऊतक डिब्बों से अलग करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1. भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी), इस्केमिया या सर्जिकल चोट जैसी रोगजनक स्थितियों में देखे जाने वाले एपिथेलियल चोट और म्यूकोसल घाव नैदानिक लक्षणों से जुड़े होते हैं जिनमें दस्त, वजन कम होना, मल में रक्त और पेट दर्द शामिल हैं। चोट के जवाब में, एपिथेलियल कोशिकाएं म्यूकोसल बैरियर दोषों को फिर से एपिथेलाइज करने और मरम्मत करने के लिए प्रवास और प्रसारित होती हैं। आंतों के म्यूकोसल होयोस्टेसिस और कार्य2,3,4को फिर से स्थापित करने के लिए सूजन और म्यूकोसल अखंडता की क्षतिपूर्ति का संकल्प महत्वपूर्ण है।
आंतों के एपिथेलियल बैरियर को नुकसान से जुड़े अंतर्निहित आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पशु मॉडलों को नियोजित किया गया है। रासायनिक रूप से प्रेरित कोलाइटिस के अच्छी तरह से स्थापित और आसानी से लागू मॉडलों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से आईबीडी जैसे भड़काऊ चोट से संबंधित अध्ययनों में। एक आम, प्रजनन योग्य, और विश्वसनीय मुरीन कोलाइटिस मॉडल डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) मध्यस्थता कोलोनिक चोट और सूजन को रोजगार देता है। रोग की गंभीरता माउस तनाव, डीएसएस की खुराक, डीएसएस प्रशासन की लंबाई औरडीएसएस5,6,7के आणविक वजन के आधार पर भिन्न होती है।
डीएसएस कोलाइटिस के दौरान आंतों के म्यूकोसल क्षति का मूल्यांकन आमतौर पर रोग गतिविधि सूचकांक (दाई) का उपयोग करके किया जाता है, जो वजन घटाने, मल रक्त सामग्री और मल स्थिरता द्वारा निर्धारित एक समग्र स्कोर है। मल रक्त सामग्री सूक्ष्म हो सकती है (स्टूल गुआइक एसिड टेस्ट का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है) या स्थूल; मल स्थिरता को हार्ड, सॉफ्ट या लिक्विड (यानी दस्त)5, 8के रूप में वर्गीकृत कियाजाताहै । इन नैदानिक मापदंडों का स्कोरिंग व्यक्तिपरक हो सकता है और उपयोगकर्ता के अनुभव और पूर्वाग्रह के आधार पर भिन्न हो सकता है, हालांकि कुल मिलाकर, डेटा विश्वसनीय जानकारी प्रदान करता है और इस प्रकार आईबीडी शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, म्यूकोसल क्षति के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए आम तौर पर स्वीकार्य विधि नहीं है। सबसे अधिक, कोलन के चयनित क्षेत्रों का निरीक्षण एक प्रशिक्षित पैथोलॉजिस्ट द्वारा किया जाता है और कई मापदंडों के आधार पर बनाए जाते हैं जिनमें आमतौर पर क्रिप्ट इंजरी और ल्यूकोसिटे घुसपैठ9,10,11शामिल होते हैं। हालांकि, क्योंकि जांच किए गए मापदंडों की संख्या और विश्लेषण किए गए ऊतकों की मात्रा व्यक्तिगत रिपोर्टों के बीच काफी भिन्न होती है, कई प्रकाशित अध्ययनों की तुलनीयता सीमित है। पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह को कम करने और अंतर अध्ययन सामंजस्य को बढ़ाने के लिए, एक आदर्श हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग प्रोटोकॉल को शामिल करना चाहिए: 1) में पेट की पूरी लंबाई शामिल होनी चाहिए, क्योंकि आंतों की म्यूकोसल सूजन सबसे अधिक बार चरती है और घावों को छोड़ना आम है, 2) व्यक्तिपरकता को कम करने के लिए विशिष्ट कुंजी और आसानी से व्याख्या योग्य मापदंडों के लिए विश्लेषण को सीमित करें, 3) बड़ी संख्या में नमूनों की तेजी से, सुसंगत प्रसंस्करण की सुविधा प्रदान करते हैं, और 4) डेटा अधिग्रहण, विश्लेषण और प्रस्तुति के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध और किफायती उपकरणों का उपयोग करते हैं।
यहां हम डीएसएस-प्रेरित कोलाइटिस के कारण आंतों की म्यूकोसल सूजन और क्षति का विश्लेषण करने के लिए एक मुफ्त कंप्यूटर-असिस्टेड स्कोरिंग सिस्टम के उपयोग के साथ-साथ "स्विस रोल" विन्यास में छोटी आंत के पूरे पेट या लंबे खंडों को संसाधित करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं।
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Protocol
वर्णित सभी पशु प्रयोगों के उपयोग और जानवरों की देखभाल पर मिशिगन विश्वविद्यालय की समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. ऊतक फसल
- अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफलुरेन एनेस्थीसिया का उपयोग करके चूहों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें। सभी पशु प्रयोगों के लिए, पशु हैंडलिंग के लिए राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार एक प्रमाणित समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदन प्राप्त किया गया था ।
- माउस को एक विच्छेदन पैड पर एक रीढ़ की स्थिति में रखें। 20 जी x 1 1/2 इंच जी सुइयों का उपयोग करके माउस के चरम को स्थिर करें।
- संदंश और कैंची का उपयोग करके, पेट की त्वचा पर एक छोटा सा चीरा बनाएं और पेरिटोनम को बेनकाब करने के लिए इसे साइड में खींचें।
- पेट के किनारों को जघन हड्डी से पेरिटोनम में मिडलाइन चीरा के साथ पेट की गुहा खोलें।
- जब तक बड़ी आंत की कल्पना न हो जाए तब तक ऊतकों और अंगों को सावधानी से हटा दें। अंग की पूरी कल्पना करने के लिए कोलन के दोनों किनारों पर पेल्विक हड्डी को काटें, जो गुदा से सीकम की ओर विस्तारित होता है।
- धीरे से वसा, छोटी नसों और पेट से जुड़ी धमनियों को हटा दें, जबकि ध्यान से अंग विच्छेदन, गुदा के लिए सिर्फ समीपस्थ काटने और सिर्फ सेकम के लिए डिस्टल ।
नोट: स्विस रोल प्रक्रिया को पूरा करते समय विच्छेदित पेट कमरे के तापमान पर रहना चाहिए। - मल सामग्री को हटाने के लिए गुदा के माध्यम से डाली गई एक लचीली प्लास्टिक गैवेज सुई का उपयोग करके, 1x पीबीएस के साथ कोलन को सावधानीपूर्वक फ्लश करें।
- कोलन को एक सीधी रेखा में रखें, और मेसेंटेरिक धमनी के साथ देशांतर खोलें। कोल को देशांतर से डिस्टल से समीपस्थ अंत(चित्रा 1 ए) तक काटें। ऊतक के एक आधे हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि दूसरे पश्चिमी दाग, पीसीआर के लिए संसाधित किया जा सकता है या ताजा जमे हुए इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी12के लिए एक दूसरे स्विस रोल में लुढ़का ।
2. स्विस रोल की तैयारी
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके समीपस्थ कोलन से अतिरिक्त ऊतक ट्रिम करें जब तक कि पूरे कोलन की लंबाई के साथ लगभग एक ही चौड़ाई प्राप्त नहीं हो जाती है।
- ल्यूमेन फेसिंग-अप को बेनकाब करने के लिए कोलन को संरेखित करें, और एक लचीले गैवेज सुई का उपयोग करके ऊतक को पूरी तरह से समतल करें। प्रक्रिया के दौरान ऊतक नम रखने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अधिक पीबीएस जोड़ें।
- पेपर वाइप का उपयोग करके पीबीएस की अधिकता निकालें। एक सिरिंज और गैवेज सुई के साथ, ऊतक को ठीक करने और समतल करने के लिए ऊतक पर 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन समाधान जोड़ें।
- डिस्टल कोलन के अंत को हड़पने के लिए सीधे संदंश का उपयोग करें और कोलन को डिस्टल से समीपस्थ अंत(चित्रा 1B)तक गाढ़ा हलकों में मोड़ें।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए तर्जनी का उपयोग करते हुए स्विस रोल के अंदर वापस धक्का संभव है ऊतक रोल के अंदर है । - अपने स्विस रोल आकार(चित्रा 1C)को पकड़ने के लिए बीच में पेट पिन करने के लिए 27 जी सुई डालें।
- एक हिस्टोलॉजिक नमूना कंटेनर के अंदर एक एम्बेडिंग कैसेट में सुई के साथ स्विस रोल रखें।
नोट: ऊतक निर्धारण से पहले कैसेट के संबंध में समानांतर रूप से उन्मुख किया जाना चाहिए(चित्रा 1D)। - ऊतक को 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस13पर रात भर ठीक करें।
- रात भर फिक्सेशन के बाद, ऊतक 3x को पीबीएस के साथ धोएं।
- पैराफिन एम्बेडिंग प्रक्रिया से पहले ऊतक में 70% इथेनॉल जोड़ें। आगे बढ़ने से पहले स्विस रोल से सुई निकालें। ऊतक को पैरफिन एम्बेडमेंट13तक कमरे के तापमान पर इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है।
- नमूनों को ऊतक प्रोसेसर में रखें, पैराफिन में एम्बेड करें, और सकारात्मक रूप से चार्ज की गई माइक्रोस्कोपी स्लाइड(चित्रा 1E)पर चढ़कर 4 माइक्रोन सेक्शन तैयार करें। यह एक वैकल्पिक स्टॉप पॉइंट हो सकता है।
नोट: छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त वर्गों को प्राप्त करने के लिए उचित ऊतक अभिविन्यास महत्वपूर्ण है। पैराफिन कैसेट में समानांतर स्विस रोल एम्बेडिंग के परिणामस्वरूप छवि विश्लेषण(चित्रा 1F -1H)के लिए विनियोजित पूर्ण अनुभाग होंगे। अधूरे वर्गों(चित्रा 1I-1K)को रोकने के लिए तिरछे वर्गों से बचा जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए, चर्चा अनुभाग देखें। - हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई)13के साथ दाग वर्ग ।
3. डिजिटल स्कैनिंग और विश्लेषण
नोट: म्यूकोसल परिवर्तनों के सटीक मूल्यांकन के लिए, केवल उन वर्गों का चयन करें जिनमें कुल पेट की लंबाई का कम से कम 90% शामिल है।
- स्लाइड स्कैनर या इमेजर का उपयोग करके दाग अनुभागों को स्कैन करें (सामग्री की तालिकादेखें)। उत्पादित छवियों को 40x उद्देश्य और 40x आवर्धन के साथ प्रति पिक्सेल 0.25 माइक्रोन के रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है।
- स्कैन स्लाइड्स के डिजिटल विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर इंस्टॉल करें और डाउनलोड करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 2A)में स्कैन की गई छवियां खोलें। सत्यापित करें कि पूरे पेट दिखाई दे रहा है और नमूने के कोई लापता क्षेत्र नहीं हैं।
- लेबल इमेजर(चित्रा 2A)पर क्लिक करके स्कैन की गई स्लाइड्स को ठीक से पहचानने के लिए लेबल इमेजर और स्केल बार टूल्स को सक्रिय करें।
- एनोटेशन,(चित्रा 2A)पर क्लिक करके एनोटेशनटूल खोलें और स्विस रोल, सूजन/चोट और कटाव/अल्सर की कुल लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए नई परत (चित्रा 2B)पर क्लिक करके 3 अलग-अलग परतें बनाएं। लेयर कलर(चित्रा 2B)पर क्लिक करके प्रत्येक परत के लिए एक अलग रंग चुनें।
- प्रत्येक परत/श्रेणी की लंबाई को पेन टूल(चित्रा 2 ए)पर क्लिक करके मापें, एक संदर्भ के रूप में पेशी म्यूकोसा का उपयोग करके:
- पेशी म्यूकोसा के पर्याप्त दृश्य की सुविधा के लिए 400 माइक्रोन ज़ूम (या अधिक) पर छवि देखें।
नोट: आवर्धन आसानी से माउस स्क्रॉल व्हील का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है और सभी लाइनों को आकर्षित करने के लिए अनुभाग में आगे बढ़ते समय आवश्यक रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होगी। - मस्कुलर म्यूकोसा(चित्रा 2A)के बाद एक लाइन खींचने के लिए पेन टूल पर क्लिक करें । विश्लेषण के लिए आसन्न क्षेत्र की कल्पना करने के लिए आवश्यकतानुसार सूचक को स्थानांतरित करें।
नोट: हर बार जब कलम बंद कर दिया जाता है, तो एक छोटी नई परत क्षेत्र उत्पन्न होगा। इसे लेयर क्षेत्र टैब (वांछित सेगमेंट का चयन करें और गलतियों या सुधार, चित्रा 2B)के मामले में डिलीट लेयर पर क्लिक करें) के साथ कल्पना और संपादित किया जा सकता है।
- पेशी म्यूकोसा के पर्याप्त दृश्य की सुविधा के लिए 400 माइक्रोन ज़ूम (या अधिक) पर छवि देखें।
- एक बार सभी परतों(चित्रा 2C)को परिभाषित कर दिया जाता है, तो निर्यात ग्रिड का उपयोग करके डेटा को लेयर क्षेत्रों के विकल्पों(चित्रा 2B)के अंदर टेक्स्ट फाइल बटन में निर्यात करें।
नोट: डेटा को ठीक से संग्रहीत करने के लिए परतें बनाते समय अक्सर फ़ाइलों को सहेजें। - टेक्स्ट फाइल्स को खोलें और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर से डाटा कॉपी करें । प्रत्येक क्षेत्र से कुल सभी खंडों और कुल लंबाई के संबंध में चोट और छालों के प्रतिशत की गणना ।
- हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर (एचसीएस) की गणना करने और रोग की गंभीरता का मूल्यांकन करने के लिए, नीचे विस्तृत रूप में तीन मुख्य विशेषताओं पर विचार करें।
- स्वस्थ आंतों म्यूकोसा की जांच करें जो क्रिप्ट-ल्यूमिनल अक्ष में संगठित एपिथेलियल कोशिकाओं, कुछ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ लैमिना प्रोप्रिया, और सबजसेंट मस्कुलरिस म्यूकोसा की विशेषता है जो म्यूकोसा और सबमुकोसा(चित्रा 3 ए)को इंटरफेस करता है।
- सूजन/चोट की जांच करें जो एपिथेलियल क्रिप्ट्स की विशेषता है जो क्षीण या आंशिक रूप से लापता एपिथेलियल कोशिकाओं और क्रिप्टो में न्यूट्रोफिल घुसपैठ के साथ म्यूकोसल सूजन हैं(चित्रा 3B)।
- कटाव/अल्सर की उपस्थिति की जांच करें जो सतह एपिथेलियम या क्षेत्रों से रहित क्षेत्रों की विशेषता है, जिसमें पूरी तरह से संबंधित ल्यूकोसाइट्स(चित्रा 3 सी)के साथ या बिना एपिथेलियल क्रिप्ट्स की कमी होती है ।
- निम्नलिखित सूत्र में कुल लंबाई के प्रतिशत के रूप में व्यक्त घायल और अल्सर क्षेत्रों के एचसीएस की गणना करें:
नोट: एचसीएस सूजन के प्रतिशत को जोड़ती है/चोट और कटाव/अल्सर बाद में दो के एक कारक जोड़ने, एक उचित धारणा है कि एपीथियम की पूरी हानि बाधा अखंडता की अधिकतम हानि में परिणाम है और इसलिए बदतर बीमारी के आधार पर । एचसीएस लगातार डीएसएस प्रेरित प्रयोगात्मक कोलाइटिस के कारण रूपात्मक परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करता है। दिलचस्प बात यह है कि हमने डीएसएस कोलाइटिस में कोलोनिक लिम्फोइड एग्रीगेट्स या रोम और नैदानिक रोग गंभीरता की संख्या के बीच स्पष्ट संबंध नहीं देखा है और इसलिए, हमने इस विश्लेषण में मात्राकरण को शामिल नहीं किया है। - प्रतिनिधि छवियों का एक स्नैपशॉट लें (स्नैपशॉट, चित्रा 2A परक्लिक करें), और सहेजें। शो/हाइड स्केल बार (चित्रा 2A)पर क्लिक करके जरूरत होने पर स्केल बार शामिल करें ।
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Representative Results
डीएसएस चैलेंज और कोलाइटिस से बाद में वसूली के बाद म्यूकोसल क्षति के संदर्भ में इस हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर विश्लेषण की विश्वसनीयता को समझाने के लिए, हमने 5 दिनों के लिए आठ 10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL6 जंगली प्रकार के चूहों के पीने के पानी में 2.5% डीएसएस प्रशासित किया और 5 दिनों के लिए नियमित रूप से पानी के साथ वसूली अवधि के बाद। डीएसएस के तीव्र प्रशासन के दौरान शरीर के वजन में कोई परिवर्तन नहीं किया गया था, दिन 0 से 5(चित्रा 4A)तक। शरीर के वजन में नाटकीय रूप से 5 दिन के बाद कमी आई, जब चूहों नियमित रूप से नल का पानी पीने शुरू कर दिया । रक्त और नरम मल DSS प्रशासन के 3 दिनों के बाद दिखाई दिया और प्रयोग के 8 दिन तक पानी पर बाद के 3 दिनों के लिए जारी रखा(चित्रा 4B)। इन टिप्पणियों ने सुझाव दिया कि 5 और 8 दिनों के बीच वसूली अवधि के दौरान डीएसएस के संपर्क में आने का सबसे हानिकारक प्रभाव देखा गया । 10 दिन में पेट की लंबाई की माप प्रयोग के अंत में एक महत्वपूर्ण छोटा करने की पुष्टि की(चित्रा 4C)। परफिन स्विस रोल बनाने के लिए 0, 2, 5, 7, 8 और 10 दिनों में कोलन काटा गया था। ऊतक एच एंड ई के साथ दाग था और उच्च परिभाषा स्कैन(चित्रा 4D)हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर(चित्रा 4E)और चोट और अल्सर के प्रतिशत(चित्रा 4F)की गणना करने के लिए विश्लेषण किया गया ।
चित्रा 4D अनुपचारित C576BL6 चूहों में सामान्य तहखाना वास्तुकला दिखाता है, पेशी म्यूकोसा के लिए सतही और लैमिना प्रोप्रिया (दिन 0, तीर) द्वारा समर्थित। डीएसएस प्रशासन के 2 दिनों के बाद, प्रतिरक्षा सेल भर्ती (दिन 2, तीर) मनाया गया था। 5 दिन, एपिथेलियल कोशिकाएं क्षतिग्रस्त दिखाई दीं, और एपिथेलियल चोट (दिन 5, तीर) से जुड़े एपिथेलियम (क्रिप्टोटिस) में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ हुई। 5 से 8 दिन तक, सूजन और अल्सर के साथ एपिथेलियल नुकसान के क्षेत्रों (दिन 7 और 8, तीर) नोट किए गए थे। बाद आमतौर पर चूहों वसूली चरण के दौरान नियमित रूप से नल का पानी पीने के रूप में मनाया जाता है। अंत में, एपिथेलियल कोशिकाएं अल्सर क्षेत्रों को पुनर्जीवित और फिर से आबाद करना शुरू करती हैं, धीरे-धीरे दिन 10 (तीर) में कोलोनिक म्यूकोसा बहाल करती हैं।
एचसीएस बारीकी से सूजन/चोट और कटाव/अल्सर के प्रतिशत के सरल आकलन दर्पण, और दोनों मात्रात्मक रूप से प्रदर्शित करता है कि 5 से 10 दिन पर DSS से वसूली के दौरान चूहों के पेट को महत्वपूर्ण नुकसान होता है, जो चित्र 4 डीमें दिखाए गए एपिथेलियल कटाव और ल्यूकोसिट घुसपैठ से संबंधित है । एचसीएस द्वारा प्रदान किए गए डेटा एपिथेलियल चोट बनाम कटाव/अल्सर से जुड़ी सूजन के संबंध में रोग की गंभीरता के बीच अंतर करते हैं ।
इन टिप्पणियों से यह प्रदर्शित होता है कि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित एचसीएस की व्यवस्थित स्कोरिंग प्रणाली म्यूकोसल क्षति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण का गठन करती है ।
चित्र 1:सटीक डेटा विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है। (ए)डिस्टल कोलन पूरी तरह से विस्तारित और मेसेन्टेरिक धमनी के साथ खोला गया है। (ख)स्विस रोलिंग प्रक्रिया । (C)सुई प्रविष्टि स्विस रोल आकार(D)पैराफिन एम्बेडिंग कैसेट धारण करने के लिए । (ई)पैराफिन ब्लॉक। (एफ)स्विस रोल समानांतर अभिविन्यास आंशिक वर्गों से बचने के लिए। (जी)पूरा स्विस रोल, स्केल बार: 2 मिमी(एच)कॉलोनिक क्रिप्ट्स का आदर्श खंड, स्केल बार: 80 माइक्रोन।(I)तिरछी स्विस रोल ओरिएंटेशन। (जम्मू)अधूरा स्विस रोल, स्केल बार: 2mm.(K)कॉलोनिक क्रिप्ट्स का तिरछा खंड, स्केल बार: ८० माइक्रोन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:म्यूकोसल क्षति का मात्रात्मक मूल्यांकन। (ए)स्नैपशॉट के साथ बेसिक टूल बार, जूम स्लाइडर, शो/हाइड स्केल बार/कुल्हाड़ियों/ग्रिड, लेबल इमेजर, एनोटेशन और पेन टूल फीचर्स, अन्य लोगों के बीच । (ख)एनोटेशन मेनू प्रदर्शित लेयर कलर, नई परत, डिलीट लेयर, शो/हिड लेयर, डिलीट एरिया और एक्सपोर्ट ग्रिड टू टेक्स्ट फाइल बटन । (ग)कुल लंबाई, घायल और अल्सर परतों का अवलोकन, स्केल बार: 3 मिमी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:माउस आंतों म्यूकोसा की आकृति विज्ञान तीव्र डीएसएस-प्रायोगिक कोलाइटिस के बाद हेमाटॉक्सीलिन और इओसिन के साथ दाग दार और वसूली के बाद। (क)लैमिना प्रोप्रोरिया से घिरे कोलोनिक क्रिप्ट्स में आयोजित स्वस्थ आंतों की कोशिकाएं और मस्कुलरिस म्यूकोसा द्वारा उपमुकोसा से अलग, स्केल बार: 200 माइक्रोन(बी)तीव्र म्यूकोसल सूजन या चोट म्यूकोसा और क्रिप्ट एपिथेलियम में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ के साथ, क्रिप्टो एपिथेलियल विरूपण/हानि और एपिथेल एटटेन्टे स्केल बार: 200 माइक्रोन (सी)पूरी एपिथेलियल हानि और संबंधित सूजन वाले क्षेत्रों में अल्सर या क्षीण हो गया है।, स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर और चोट और अल्सर का प्रतिशत डीएसएस प्रायोगिक कोलाइटिस के दौरान शरीर के वजन और मल सूचकांक के साथ संबंधित है: (ए)शरीर का वजन और(बी)मल अनुक्रमित जंगली प्रकार चूहों में दैनिक मूल्यांकन कर रहे हैं 5 दिनों (लाल रेखा) के लिए २.५% DSS के साथ इलाज, पानी पर वसूली के 5 दिनों के बाद (काली रेखा) । डेटा प्रति समूह कम से कम 4 चूहों के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं और मतलब ± एसईएम के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। महत्व दो तरह के ANOVA और सिडक कई तुलना, * पी<0.033, **p<0.002, और ***p<0.001 द्वारा निर्धारित किया जाता है। (ग)चूहों की पेट की लंबाई 10 दिन में मापी गई थी । डेटा प्रति समूह कम से कम 3 चूहों के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं और मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। महत्व दो पूंछ वाले छात्र के टी परीक्षण, ***p<0.001 द्वारा निर्धारित किया जाता है। (घ)हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई)-कोलोनिक म्यूकोसा के दाग ऊतक खंडों की गणना करने के लिए विश्लेषण किया गया, स्केल बार: ६० माइक्रोन (ई)हस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर (एचसीएस) और कोलन की लंबाई के सापेक्ष चोट/अल्सर का प्रतिशत । डेटा प्रति समूह 2 चूहों के साथ दो प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं और मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। महत्व एक तरफा ANOVA और Tukey कई तुलना, * पी<0.033, **p<0.002, और ***p<0.001 द्वारा निर्धारित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हमारा हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर सिस्टम आंत में ऊतक सूजन और क्षति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण का गठन करता है। यह दृष्टिकोण छोटे क्षेत्रों या अपूर्ण वर्गों के चयन के पूर्वाग्रह के बिना पूरे अंग की हिस्टोपैथोलॉजिकल स्थिति की बेहतर समझ प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में स्विस रोल की उचित तैयारी है जो कोलन की लंबाई के कम से कम 90% के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं; पैराफिन एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के दौरान समानांतर अभिविन्यास एपिथेलियल क्रिप्ट के देशांतर विचारों के साथ सीधे और एक समान ऊतक वर्गों को सुनिश्चित करने के लिए; अभ्यास और एक अनुभवी रोगविज्ञानी से पर्यवेक्षण के साथ प्रशिक्षण की पुष्टि करने के लिए कि प्रशिक्षुओं तीव्र सूजन, एपिथेलियल चोट, और कटाव/अल्सर के बीच मतभेदों की पहचान; और एक उच्च संकल्प डिजिटल स्कैनर तक पहुंच।
पैराफिन एम्बेडिंग के दौरान और सेक्शनिंग के दौरान स्विस रोल को उचित रूप से उन्मुख करने के लिए छोटे समायोजन और समस्या निवारण की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक पैराफिन कैसेट और ब्लेड(चित्रा 1E-F)के सापेक्ष समानांतर उन्मुख है। इस स्थानिक अभिविन्यास का पालन करने से अधूरे वर्गों की संख्या कम हो जाएगी। यदि कोलन पूरी तरह से खुद पर लुढ़का हुआ है, तो अधिकांश ऊतक लंबाई सहित सबसे अच्छे अनुभाग स्विस रोल(चित्रा 1F)के बीच के पास स्थित होंगे। कई वर्गों को इकट्ठा करने से अच्छी तरह से उन्मुख वर्गों को प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है जहां क्रिप्ट्स की पूरी लंबाई दिखाई देती है(चित्र 1जी-एच)। परिपत्र के आकार के तहखाने या तहखाना डोनट्स(चित्रा 1K)की विशेषता वाले परोक्ष स्विस रोल (चित्रा1I-J)को खंडित करने से बचें। अक्सर माइक्रोस्कोप के तहत एकत्र किए गए वर्गों के दृश्य को उचित तकनीक सुनिश्चित करने के लिए दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। एक अच्छा खंड पेट की पूरी लंबाई को पकड़ता है।
कोई भी उपकरण जो स्विस रोल की पूरी लंबाई को कैप्चर करने में सक्षम बनाता है और क्रिप्ट आर्किटेक्चर की कल्पना करने के लिए ऊतक को बढ़ाने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान करता है एचसीएस के मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है। कुछ माइक्रोस्कोप छोटी छवियों के ओवरलैप की अनुमति देते हैं और पूरे ऊतक वर्गों का पुनर्निर्माण करते हैं। हालांकि, ऊतक स्कोर करने के लिए आवर्धन बढ़ाने के बाद इन छवियों का संकल्प खराब हो सकता है। इसके अतिरिक्त, वर्गों का ओवरलैप सही नहीं हो सकता है, ऊतक के क्षेत्रों को छोड़ देता है जो अच्छी तरह से परिभाषित नहीं हैं और सटीक स्कोर करने के लिए असंभव हैं।
यहां प्रस्तावित स्कोरिंग प्रोटोकॉल के फायदों में केवल दो श्रेणियों सूजन/चोट या कटाव/अल्सर में ऊतक का वर्गीकरण है । यह प्रजनन क्षमता में वृद्धि करते हुए ऊतक क्षति के वर्गीकरण को सरल और तेज करता है। विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर सुलभ, मुफ्त और उपयोग करने में आसान है। एचसीएस सही म्यूकोसल क्षति को दर्शाता है, क्योंकि यह कोलन की पूरी लंबाई के साथ अल्सर क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है और उचित रूप से सूजन, गैर-अल्सर क्षेत्रों पर इस विकृति की ओर अधिक वजन प्रदान करता है। यह स्पष्ट रूप से परिलक्षित होता है जब एचसीएस डेटा की तुलना बनाम चोट/अल्सर(चित्रा 4E-F)के प्रतिशत से की जाती है । प्रत्येक नमूने के स्कोरिंग विश्लेषण में लगभग 40 मिनट लगते हैं। उचित प्रशिक्षण, स्कैन स्लाइड, एक कंप्यूटर, और सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग के साथ, ज्यादातर शोधकर्ताओं विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं । हालांकि, सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक पैथोलॉजिस्ट के साथ स्कोरिंग परिणामों की पुष्टि करना हमेशा उचित होता है। आंतों की सूजन का आकलन किसी भी सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है जो स्लाइड और लंबाई माप के उच्च रिज़ॉल्यूशन आवर्धन की अनुमति देता है; हालांकि, सादगी के लिए, इस प्रोटोकॉल में हमने टेबल ऑफ मैटेरियल्समें सूचीबद्ध सॉफ्टवेयर पर ध्यान केंद्रित किया ।
हम विभिन्न डीएसएस कोलाइटिस प्रयोगों में रोग का सफलतापूर्वक विश्लेषण करने के लिए इस स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, केल्म एट अल14 ने एक उपन्यास एंटीबॉडी (GM35) का उपयोग करके, एपिथेलियल माइग्रेशन और प्रसार के एक महत्वपूर्ण नियामक CD44v6 के ग्लाइकोसिलेशन के महत्व का पता लगाया। उन्होंने चूहों में कम रोग गतिविधि सूचकांक स्कोरिंग और बेहतर एचएससी का प्रदर्शन किया, जो एपिथेलियल सीडी 44v6 पर सियाल लुईस ए ग्लाइकन के लक्ष्यीकरण के बाद तीव्र डीएसएस के साथ चुनौती दी गई, डीएसएस प्रेरित चोट14के बाद वसूली के लिए सीडी 44 वेरिएंट के पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन के महत्व की पुष्टि करता है। एक अन्य उदाहरण में, रीड एट अल15 ने सीडी 47 के एपिथेलियल विशिष्ट विलोपन के साथ चूहों में म्यूकोसल चोट और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक पुरानी डीएसएस मॉडल का उपयोग किया, जो भड़काऊ और मरम्मत प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन है। कोलन स्कैन का विश्लेषण किया गया और ऊपर वर्णित चोट और छालों के प्रतिशत की गणना करने के लिए रन बनाए गए, चूहों में स्पष्ट रूप से बिगड़ा म्यूकोसल मरम्मत का प्रदर्शन किया गया जिसमें एपिथेलियल सीडी47 15की कमी थी। इस रिपोर्ट में क्रोनिक कोलाइटिस मॉडल ने समय के साथ चोट और मरम्मत का विश्लेषण करने के लिए डीएसएस के चक्रीय प्रशासन को नियोजित किया।
हमारे समूह और अन्य लोगों के अतिरिक्त प्रकाशनों ने इस स्कोरिंग प्रणाली के फायदों और नैदानिक लक्षणों के साथइसकेसंबंध 6 , 16,17को दर्शाया है । यह प्रोटोकॉल मुफ्त और आसानी से सुलभ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्विस रोल तैयार करने और स्कोर करने के तरीके का विस्तार से वर्णन करता है। यहां प्रस्तावित स्कोरिंग की सादगी स्कोरिंग प्रक्रिया को सुगम बनाने और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए स्कैन स्लाइडों में केवल दो श्रेणियों (सूजन/चोट या कटाव/अल्सर) के उपयोग पर आधारित है । महत्वपूर्ण बात यह है कि यहां वर्णित स्कोरिंग सिस्टम आंतों की सूजन के नैदानिक मापदंडों से भी संबंधित है। अंत में, हिस्टोलॉजिकल कोलाइटिस स्कोर एक उपकरण है जिसका उपयोग मात्रात्मक रूप से डीएसएस-कोलाइटिस स्कोर करने के लिए किया जा सकता है और सूजन और एपिथेलियल चोट/हानि से जुड़े अन्य कोलाइटिस मॉडलों पर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक NIH धन DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 और मिशिगन पैथोलॉजी स्लाइड स्कैनिंग सेवाओं के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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