Summary
Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.
Abstract
El desarrollo del paladar es un proceso dinámico, que implica el crecimiento vertical de estantes palatales bilaterales junto a la lengua seguido de elevación y fusión por encima de la lengua. Los defectos en este proceso conducen al paladar hendido, un defecto congénito común. Estudios recientes han demostrado que la elevación de la plataforma palatal implica un proceso de remodelación que transforma la orientación de la plataforma de una vertical a una horizontal. El papel de las células mesenquimales de la plataforma palatal en esta remodelación dinámica ha sido difícil de estudiar. El análisis cuantitativo basado en imágenes de lapso de tiempo se ha utilizado recientemente para mostrar que las células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón (MEPM) pueden autoorganizarse en un movimiento colectivo. Los análisis cuantitativos pudieron identificar diferencias en las células MEPM mutantes a partir de un modelo de ratón con defectos de elevación del paladar. Este artículo describe métodos para aislar y cultivar células MEPM de embriones E13.5, específicamente para imágenes de lapso de tiempo, y para determinar varios atributos celulares del movimiento colectivo, incluidas las medidas para la formación de corrientes, la alineación de la forma y la persistencia de la dirección. Postula que las células MEPM pueden servir como un modelo proxy para estudiar el papel del mesénquima de la plataforma palatina durante el proceso dinámico de elevación. Estos métodos cuantitativos permitirán a los investigadores en el campo craneofacial evaluar y comparar los atributos de movimiento colectivo en células de control y mutantes, lo que aumentará la comprensión de la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Además, las células MEPM proporcionan un modelo de célula mesenquimal raro para la investigación del movimiento celular colectivo en general.
Introduction
El desarrollo del paladar se ha estudiado ampliamente ya que los defectos en la palatogénesis conducen al paladar hendido, un defecto congénito común que ocurre en casos aislados o como parte de cientos de síndromes1,2. El desarrollo del paladar embrionario es un proceso dinámico que implica el movimiento y la fusión del tejido embrionario. Este proceso se puede dividir en cuatro pasos principales: 1) inducción de estantes palatales, 2) crecimiento vertical de los estantes palatales junto a la lengua, 3) elevación de los estantes palatales por encima de la lengua, y 4) fusión de los estantes palatales en la línea media1,3,4. En las últimas décadas, se han identificado muchos mutantes de ratón que manifiestan paladar hendido5,6,7,8. La caracterización de estos modelos ha indicado defectos en los pasos de inducción, proliferación y fusión de la plataforma palatal; sin embargo, los defectos de elevación de la plataforma palatal han sido raros. Por lo tanto, comprender la dinámica de la elevación de la plataforma palatal es un área intrigante de investigación.
El análisis cuidadoso de algunos mutantes de ratón con defectos de elevación de la plataforma palatina ha llevado al modelo actual que muestra que la región muy anterior de la plataforma palatina parece voltearse hacia arriba, mientras que un movimiento vertical a horizontal o "remodelación" de las plataformas palatinas ocurre en las regiones medias a posteriores del paladar1,3,4, 9,10,11. El epitelio del borde medial de la plataforma palatal probablemente inicia la señalización requerida para esta remodelación, que luego es impulsada por el mesénquima de la plataforma palatina. Recientemente, muchos investigadores han identificado retraso en la elevación de la plataforma palatal en modelos de ratón que mostraron adherencias orales transitorias que involucran estantes palatales12,13. La remodelación mesenquimal implica la reorganización de las células para crear una protuberancia en la dirección horizontal, mientras que simultáneamente retrae el estante palatal en la dirección vertical9,10,14. Entre los diversos mecanismos propuestos para afectar la elevación de la plataforma palatina y la remodelación mesenquimal subyacente se encuentran la proliferación celular15,16,17,los gradientes quimiotácticos18y los componentes de la matriz extracelular19,20. Surgió una pregunta importante: ¿el retraso en la elevación de la plataforma palatal observado en ratones deficientes en Specc1ltambién se debe en parte a un defecto en la remodelación de la plataforma palatal, y podría este defecto de remodelación manifestarse en un defecto intrínseco en el comportamiento de las células PRIMARIAS de MEPM21?
Las células MEPM primarias se han utilizado en el campo craneofacial para muchos estudios que involucran la expresióngénica 22,23, 24,25,26,27,28,29,y algunos que involucran proliferación30,31 y migración25,31,32 , pero ninguno para el análisis colectivo del comportamiento celular. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células MEPM en cultivo 2D y ensayos de reparación de heridas para mostrar que las células MEPM mostraban movimiento direccional y formaban corrientes celulares dependientes de la densidad-atributos del movimiento colectivo21. Además, las células mutantes specc1l formaron flujos celulares más estrechos y mostraron trayectorias de migración celular muy variables. Se considera que esta falta de motilidad coordinada contribuye al retraso de la elevación del paladar en embriones mutantes Specc1l 13,21. Por lo tanto, estos ensayos relativamente simples que utilizan células MEPM primarias pueden servir como un proxy para estudiar la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de células MEPM primarias, así como las imágenes y análisis de lapso de tiempo, para los ensayos 2D y de reparación de heridas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de KUMC, de acuerdo con sus directrices y regulaciones (Número de protocolo: 2018-2447).
1. Cosecha embriones E13.5
- Sacrificar ratones hembra preñados utilizando una cámara de inhalación de CO2 o mediante un procedimiento aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Proceda inmediatamente a la disección.
- Exponga la mitad inferior de la cavidad abdominal eliminando la piel y el peritoneo. Extirpar ambos cuernos del útero, que contienen los embriones E13.5.
- Coloque brevemente el útero en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) precalentada a 37 °C para enjuagar el exceso de sangre, cabello u otros desechos. Coloque el útero en un plato estéril de 10 cm lleno de PBS estéril.
- Usando tijeras pequeñas, corte a través de la pared uterina a lo largo del útero para exponer cada embrión, todavía en su saco vitelino. Retire el saco vitelino que rodea al embrión, pero guárdelo para el genotipado, si es necesario. A medida que se extraen los embriones, coloque cada embrión en su propio pozo de una placa de 12 pozos llena de PBS.
2. Disección de estantes palatales de embriones (Figura 1)
NOTA: Esterilizar los instrumentos de disección de acero inoxidable (ver la Tabla de Materiales)después de procesar cada embrión colocando los instrumentos primero en un beaker de alcohol etílico 100% (EtOH), luego en un esterilizador de instrumentos a 350 °C durante 10 s, y luego enfriándolos en un segundo beaker de 100% EtOH.
- Usando una cuchara perforada esterilizada, coloque el embrión en un nuevo plato de 10 cm lleno de medio de cultivo MEPM que consiste en el medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), L-glutamina (4 mM L-Glu) y los antibióticos-penicilina y estreptomicina (50 unidades / ml).
- Decapitar el embrión justo debajo de la línea de la mandíbula usando tijeras estériles(Figura 1A,línea punteada roja). Retire la mandíbula inferior insertando un punto de las pinzas finas # 5 esterilizadas en la boca, manteniéndola justo dentro de la mejilla. Empuje la punta de las pórceps insertadas hasta que salga por la parte posterior del cráneo.
- Oriente las pinzas, a lo largo de la línea amarilla en la Figura 1B,de modo que el otro lado de las pinzas (que todavía está fuera del embrión) esté flotando justo sobre el canal auditivo, luego pellizque las pinzas cerradas para cortar el tejido. Si es necesario, pase otra pinza fina a lo largo de la costura de las pinzas ahora cerradas para cortar cualquier tejido que no haya sido completamente cortado por el pellizco.
- Repita el paso anterior para el otro lado de la cabeza del embrión. Continúe el procedimiento de pellizco para extirpar completamente la mandíbula inferior, la lengua y la parte inferior del cráneo y exponer los estantes palatales.
- Retire el cráneo del cráneo cortando justo por encima de los ojos, como se muestra en la Figura 1C (línea verde). Haga esto colocando la cabeza en su lado izquierdo o derecho y colocando los puntos de las pequeñas tijeras de acero inoxidable delante y detrás del cráneo justo por encima del nivel del ojo del embrión. Corta la parte superior del cráneo con un corte rápido de las tijeras, creando una superficie plana que será importante para la estabilidad en pasos posteriores y que debería parecerse a la Figura 1D cuando se vea desde un lado.
- Coloque la parte restante de la cabeza boca abajo, con el aspecto superior de la cabeza (cráneo eliminado) descansando plana en la parte inferior del plato, lo que proporcionará una superficie estable para la eliminación del estante palatal. Tómese un momento para identificar los estantes palatales, que ahora están expuestos y mirando hacia arriba y aparecerán como dos crestas elevadas a cada lado de un surco central en la mitad anterior de la cabeza(Figura 1E).
- Fije la porción restante de la cabeza al plato para inmovilizarlo mientras se retiran los estantes. Haga esto insertando un punto de un fórceps fino a través del tejido cerca de la región nasal de la cabeza, anterior a los estantes palatales, e inserte el otro punto de los fórceps a través de la base del cráneo, posterior a los estantes palatales. Manténgalos en su lugar mientras realiza la escisión de los estantes palatales.
- Inmovilizando la cabeza con una mano, escoja cualquiera de los dos estantes para quitar primero, e inserte ambos puntos de un segundo par de fórceps finos en el tejido en la base de la superficie lateral del estante, y pellizque para cortar el tejido (Figura 1F). Repita esto a lo largo de la base de la superficie medial del estante y luego en los extremos anterior y posterior del estante para separarse de la cabeza.
- Levante suavemente el estante, haciendo pellizcos adicionales, según sea necesario, para liberar completamente el estante del tejido circundante.
- Repita los dos pasos anteriores para quitar el segundo estante palatal.
- Con los estantes palatales ahora liberados del tejido circundante y colocados en PBS(Figura G),use una pipeta de transferencia de bulbo de plástico estéril para dibujar los estantes en la pipeta y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml junto con aproximadamente 500 μL de PBS. Mantenga los tubos que contienen estantes palatales en hielo, ya que el resto de la basura se procesa de la misma manera.
NOTA: Alternativamente, los estantes se pueden colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga tripsina precalenada (0,25%) inmediatamente después de la disección (en lugar de colocarlos en hielo). Las muestras serán más frescas, pero se debe tener cuidado de cronometrar todos los pasos del procedimiento para cada muestra individual en lugar de tratar las muestras colectivamente.
3. Cultivo de células MEPM
NOTA: En las condiciones descritas aquí, las células epiteliales del paladar no sobreviven al primer pasaje, lo que resulta en un cultivo de células mesenquimales de paladar puro. Utilice una técnica estéril para realizar todos los pasos en una campana de cultivo de tejidos.
- Aspire y deseche el PBS del tubo de 1.5 mL, teniendo cuidado de no desechar los estantes en el proceso. Agregue inmediatamente 200 μL de tripsina precalenada (37 °C) (0,25%) a cada tubo que contenga estantes palatales. Pipetee brevemente los estantes hacia arriba y hacia abajo en la tripsina usando una punta de pipeta de 1000 μL para acelerar la tripsinización.
- Incubar los tubos durante 5 min a 37 °C, luego pipetear cada muestra hacia arriba y hacia abajo nuevamente para ayudar a romper el tejido. Incubar los tubos durante otros 5 min a 37 °C, y pipetear hacia arriba y hacia abajo una vez más para completar la disociación del tejido.
NOTA: Los estantes deben estar completamente o casi completamente disociados y suspendidos en la tripsina sin que quede trozos visibles de tejido. - Añadir 800 μL de medio de cultivo MEPM (paso 2.1) a cada tubo de 1,5 ml. Centrifugar el tubo de 1,5 ml a 200 × g durante 5 min para peletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet celular en 1 ml de medio de cultivo MEPM.
- Placa las células MEPM en una placa tratada con cultivo de tejidos de 6 pozos que contiene medio de cultivo MEPM. Deje que las células se adhieran a la superficie plástica durante 12 h a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
NOTA: Después de la incubación nocturna, la gran mayoría (~ 90%) de las células se unirán. En este punto, las células adheridas se verán bastante homogéneas, con una forma triangular o ligeramente alargada. - Cambie el medio todos los días aspirando suavemente el medio viejo y reemplazándolo inmediatamente con 1 ml de PBS estéril caliente sin calcio o magnesio durante ~ 1 min. Aspirar el PBS, y sustituirlo por 3 mL de medio de cultivo MEPM precalentado.
- Pasa las células una vez que se vuelven 100% confluentes.
NOTA: Las células MEPM deben proliferar duplicando su número casi a diario.- Para pasar las células, aspire suavemente el medio viejo e inmediatamente reemplácelo con PBS caliente sin calcio ni magnesio durante ~ 1 min. Aspire el PBS y reemplácelo con 0.5 ml de tripsina al 0.25% precalentado.
- Incubar a 37 °C durante ~5 min, o hasta que las células se desprendan de la superficie del plato cuando se balanceen suavemente hacia adelante y hacia atrás a mano. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue inmediatamente 5 ml de medio de cultivo MEPM precalentado a las células tripsinizadas.
- Usando una pipeta serológica de 10 ml, recoja suavemente las células en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga el tubo a 200 × g durante 5 minutos para peletizar las células. Aspirar la tripsina y el medio, y resuspend las células en 3 ml de medio de cultivo MEPM precalentado. Pipetee suavemente 1 ml de células en un solo pozo de un plato de 6 pozos y agregue 2 ml de medio de cultivo MEPM para llevar el volumen total a 3 ml.
NOTA: Esto constituye una división de celdas 1:3. Los MEPM pueden ser aprobados hasta tres veces. La densidad de siembra de los MEPM es algo flexible, y el número de células presentes varía según el recipiente de cultivo. Sin embargo, los MEPM no proliferan adecuadamente cuando se dividen demasiado escasamente y deben ser al menos 20-25% confluentes en su nuevo plato una vez que se adhieren.
4. Criopreservación de células MEPM
- Una vez que las células MEPM tripsinizadas se peletizan, vuelva a sususpend las células en el medio de cultivo MEPM para obtener una concentración de ~ 1 × 106 células / ml. Pipetear las células en crioviales y agregar una concentración final de dimetilsulfóxido al 5% en el stock celular. Tapa el criovial, mezcla brevemente invirtiendo e inmediatamente coloca los viales en un recipiente de congelación que se enfríe a una velocidad de 1 °C/min.
- Coloque el refrigerador en un congelador de -80 °C durante la noche. Al día siguiente, mueva los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
- Descongelación de células MEPM criopreservadas
- Retire los crioviales del tanque de nitrógeno líquido y descongele a temperatura ambiente hasta que el contenido comience a convertirse en líquido. Vacíe el contenido en un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medio de cultivo MEPM precalentado.
- Centrifugar el tubo a 200 × g para peletizar las células. Resuspend las células en 1 ml de medio de cultivo MEPM y pipetear las células en un solo pozo de una placa de 6 pozos. Agregue 2 ml de medio de cultivo MEPM caliente para llevar el volumen total a 3 ml.
- Culta las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Cambia el medio diariamente.
5. Imágenes en vivo de células MEPM - Ensayo de migración colectiva 2D (Figura 2)
- Prepare una placa para usar para imágenes en vivo.
- Use tijeras quirúrgicas pequeñas o un bisturí afilado para acortar un inserto de silicona estéril de 2 pozos a una altura de ~ 1 mm. Prepare un inserto para cada muestra que se esté utilizando.
- Usando forzadores, coloque el inserto de silicona acortado de 2 pomos en el centro de un pozo de una placa de 6 pomos. Presione hacia abajo a lo largo de todos los bordes para asegurarse de que esté completamente adherido.
- Descongele las células criopreservadas siguiendo los pasos de la sección 4.3 de este protocolo. Cuente las células MEPM y sise 300 células/mm2 de los insertos de silicona acortados en un volumen total de 40-50 μL de medio de cultivo MEPM por pozo. Culta las células durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
- Al día siguiente, prepárese para las imágenes de lapso de tiempo en vivo.
- Utilice un microscopio de contraste de fase con una incubadora en el escenario y capacidad de imagen automática. Agregue agua al depósito de la incubadora en el escenario para reducir la evaporación del medio de cultivo; ajuste la temperatura a 37 °C y el CO2 al 5%. Espere ~ 30 minutos para que la humedad se acumule antes de colocar el plato de 6 pozos en la incubadora en el escenario.
- Utilice una configuración equivalente a la siguiente para las imágenes de lapso de tiempo.
- Seleccione el objetivo 4x para tener grandes campos de visión y filtro de contraste de fase.
NOTA: El enfoque automático, la muestra de detección automática, la pila z y la iluminación automática no suelen ser necesarios. - Seleccione dos campos microscópicos por pozo para capturar la luz de los insertos de silicona acortados. Asegúrese de que todas las posiciones de imagen tengan el enfoque correcto.
NOTA: Los planos de imagen se pueden ajustar durante la toma de imágenes, pero dicho ajuste no suele ser necesario. - Seleccione el tipo de archivo de salida de imagen deseado y, a continuación, seleccione o deseleccione las opciones posteriores a la creación de imágenes, como la creación automática de vídeo y las marcas de agua, según desee. Si procede, seleccione contraste de fase como modo de imagen.
NOTA: El uso de marcas de agua puede impedir los pasos posteriores de procesamiento de imágenes. - Establezca la duración de la grabación en 72 h. Configure el programa para capturar imágenes cada 10 minutos.
NOTA: Por lo general, solo se requieren 48 h de imágenes, pero las imágenes se pueden detener en cualquier punto antes de la marca de 72 h sin perder las imágenes que ya se han tomado. - Asegúrese de que la cámara ambiental esté operativa como se requiere en el 5.3.1. Guarde esta configuración(la rutina)y comience a obtener imágenes.
- Seleccione el objetivo 4x para tener grandes campos de visión y filtro de contraste de fase.
- Continúe con las imágenes hasta las 72 h (o la hora especificada).
6. Imágenes en vivo de células MEPM en un ensayo de reparación de heridas (Figura 3)
- Prepare una placa para usar para imágenes en vivo. Usando forzadores, coloque un inserto de silicona estéril de 2 pomos en el centro de un pozo de una placa de 6 pomos y presione hacia abajo a lo largo de todos los bordes para asegurarse de que esté completamente adherido. Prepare un inserto de 2 pozos para cada muestra que se esté utilizando.
- Descongele las células criopreservadas siguiendo los pasos de la sección 4.3 de este protocolo. Cuente las células MEPM y, si es necesario, concentre las células en al menos 350 células/μL.
- Sembrar 1400 células/mm2 en los insertos de silicona en un volumen de 100 μL de medio de cultivo MEPM por pozo. Culta las células durante 48 h a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2,y cambie el medio todos los días.
- Después de 48 h, prepare un microscopio para obtener imágenes de lapso de tiempo en vivo como se describe en las secciones 5.3 y 5.4. Inmediatamente antes de colocar las células en la incubadora en el escenario, agregue 3 ml de medio de cultivo MEPM precalentado al pozo (pero fuera de los insertos) y luego retire cuidadosamente los insertos de silicona.
NOTA: La pared que separa las 2 cámaras deja un hueco que es la "herida". - Inicie las imágenes de lapso de tiempo como se describe en 5.4, con las siguientes diferencias:
- Utilice un objetivo de aumento más alto (por ejemplo, 10x). Para capturar el cierre de la herida, seleccione 5 campos de visión a lo largo de cada herida, de modo que la herida sea paralela al eje vertical de la imagen.
- Suspenda la obtención de imágenes después de 72 h o cuando las heridas se hayan cerrado por completo.
7. Análisis computacional de secuencias de imágenes time-lapse
Nota : realice los siguientes procedimientos en un equipo equipado con herramientas computacionales estándar, como el intérprete de Python, el compilador de C y un shell (consulte la Tabla de materiales).
- Análisis de confluencia
NOTA: Este procedimiento se puede utilizar para estimar la proliferación celular dentro de un cultivo escaso o para cuantificar los experimentos de cierre de heridas. Para detectar áreas ocupadas por celdas, se aplica un umbral de segmentación a la desviación estándar local del brillo de la imagen. El código ha sido descrito previamente por Wu et al.33 y Neufeld et al.34 y está disponible en http://github.com/aczirok/cellconfluency.- Determine el umbral de segmentación para las imágenes. Como ejemplo, para ver la segmentación con un umbral 4, emita el comando
segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
y, a continuación, compruebe la salida (output.jpg).
NOTA: Si el umbral es demasiado bajo, las áreas de fondo en la micrografía se clasifican como cubiertas de células. Por el contrario, si el umbral es demasiado alto, las áreas cubiertas de células no se clasifican como tales. El valor umbral óptimo mantiene ambos errores al mínimo. - Utilice el script de area.sh proporcionado para calcular los valores de confluencia de una secuencia de imágenes como
area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > confluencia.dat
NOTA: El valor de umbral de discriminación 4 se verifica en el paso 1 y los resultados se almacenan en la confluenciadel archivo.dat . Al ordenar las imágenes en las carpetas apropiadas, la lista de nombres de archivo de imagen se puede reemplazar por notación comodín:
area.sh -S4 *.jpg > confluencia.dat - Para experimentos de cierre de heridas, transforme los datos de confluencia A(t)-el tamaño del área cubierta de células expresada como porcentaje en función del tiempo en la velocidad de propagación del borde de la herida V como
donde w denota el ancho del campo y dA/dt es la derivada temporal de A(t), es decir, la tasa de expansión del área cubierta por celdas.
- Determine el umbral de segmentación para las imágenes. Como ejemplo, para ver la segmentación con un umbral 4, emita el comando
- Mapa de motilidad celular
- Ejecute un algoritmo de velocimetría de imagen de partículas (PIV) para caracterizar la motilidad celular y extraer el alcance del movimiento local "flujo óptico" entre pares de imágenes, pero no para identificar células individuales.
NOTA: Aquí, se utiliza un tamaño de ventana inicial de 50 μm, como se describe en detalle por Zamir et al.35 y Czirok et al.36,con un tamaño de ventana inicial de 50 μm. El análisis PIV arroja un campo de velocidad v(x,t) para cada fotograma de imagen t y ubicación (dentro de la imagen) x. - Extraer la velocidad media de la motilidad celular de v(x,t) como media espacial calculada sobre el área ocupada por la celda, según se determina en la sección 7.1.
- Ejecute un algoritmo de velocimetría de imagen de partículas (PIV) para caracterizar la motilidad celular y extraer el alcance del movimiento local "flujo óptico" entre pares de imágenes, pero no para identificar células individuales.
- Seguimiento manual de celdas
NOTA: Si bien el análisis PIV proporciona una evaluación automática de la motilidad celular, centrarse en el comportamiento de las células individuales a menudo requiere un seguimiento manual. Si bien varias herramientas proporcionan esta funcionalidad, es muy útil si los marcadores colocados manualmente se pueden modificar después de su colocación inicial, y si el seguimiento se puede realizar tanto hacia adelante como hacia atrás en el tiempo.- Realice el seguimiento de celdas con una herramienta python desarrollada a medida (http://github.com/donnagreta/cm_track), que también proporciona funciones básicas de editor, como eliminar segmentos de trayectoria.
NOTA: Esta herramienta de seguimiento manual arroja las posiciones P(i,t) de la celda i en el momento t en un archivo de texto, y se invoca como
cm_track.py -i images/ -o track.dat
donde las imágenes de lapso de tiempo están en la carpeta imágenes / y los datos de posición se recopilan en la pista de archivos.dat (Figura 4).
- Realice el seguimiento de celdas con una herramienta python desarrollada a medida (http://github.com/donnagreta/cm_track), que también proporciona funciones básicas de editor, como eliminar segmentos de trayectoria.
Figura 4: Análisis de trayectorias celulares individuales. (A) Las micrografías de lapso de tiempo de contraste de fase se someten a (B, C) un procedimiento de seguimiento manual, que marca las células (puntos verdes). (D) Las posiciones de las celdas (x,y) se almacenan para cada celda distinguida por su ID y para cada fotograma f. (E) Las trayectorias se pueden superponer en las micrografías y codificarse por colores para indicar información temporal. Como ejemplo, en cada trayectoria, una paleta de colores azul a rojo indica progresivamente segmentos de trayectoria posteriores, con rojo y azul marcando las ubicaciones de celda inicial y final, respectivamente. (F) Varias propiedades estadísticas de las trayectorias, como el desplazamiento cuadráculo medio, se pueden extraer y utilizar para caracterizar la motilidad de varias poblaciones celulares, que en este ejemplo incluyen células MEPM de tipo salvaje (wt, azul) y knockdown (kd, rojo). Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Trayectorias superpuestas en imágenes usando una segunda herramienta, invocada como
visdat.py -d track.dat -i images/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2 - Recopile las imágenes con las trayectorias superpuestas en la superposición de carpetas.
Nota : en este ejemplo, los datos de posición de la celda se almacenan en la pista de archivo.dat, mientras que la secuencia de imágenes de lapso de tiempo se encuentra dentro de las imágenes de la carpeta. El resto de los parámetros controlan la longitud máxima de las trayectorias trazadas (-l), el tamaño de los símbolos (-r) y el esquema de color (-C) utilizado.
- Análisis de trayectorias celulares individuales
- Caracterizar trayectorias por la longitud total de la ruta
,
y desplazamiento neto hacia la herida
,
donde X denota la proyección de P en la dirección perpendicular a la herida: la coordenada x de las posiciones cuando la herida es paralela al eje y. - Calcule la eficiencia de guía como
para cada celda i y punto de tiempo t37. Caracterizar los cultivos por el promedio poblacional de estas medidas unicelulares, evaluadas en un punto de tiempo adecuado t.
- Caracterizar trayectorias por la longitud total de la ruta
- Movimiento de transmisión colectiva de las células
- Caracterizar las correlaciones espaciales locales de los movimientos celulares por la velocidad media de otras células que se encuentran en las proximidades de una célula en movimiento, como se describió anteriormente38,39.
NOTA: El código computacional está disponible en https://github.com/aczirok/flowfield.- Alinee un sistema de referencia con las direcciones delantera, trasera, izquierda y derecha a cada vector v(x,t) (Figura 5A). Asigne cada una de las celdas circundantes o vector de velocidad PIV a la celda espacial apropiada del sistema de referencia (Figura 5B). Repita el procedimiento ya que cada vector sirve como origen de los sistemas de referencia (Figura 5C,D) de modo que un vector de velocidad dado se asigna a múltiples contenedores.
NOTA: Un punto de datos podría estar delante de un vector, y a la izquierda de otro. - Girar los sistemas de referencia en una orientación común (Figura 5C,F) y agruparlos (Figura 5G).
NOTA: El promedio de cada contenedor de los datos de velocidad agrupados es un vector de velocidad (U) que es indicativo de correlación espacial: el promedio es una medida de un componente de velocidad compartida (Figura 5H). - Ajuste los campos de flujo U(x) con una función
exponencial, donde a, x0 y U0 son parámetros de ajuste. De los tres parámetros de ajuste, concéntrese en x0, la longitud de correlación(Figura 5I,J),que es la distancia característica donde desaparecen las correlaciones locales velocidad-velocidad.
- Alinee un sistema de referencia con las direcciones delantera, trasera, izquierda y derecha a cada vector v(x,t) (Figura 5A). Asigne cada una de las celdas circundantes o vector de velocidad PIV a la celda espacial apropiada del sistema de referencia (Figura 5B). Repita el procedimiento ya que cada vector sirve como origen de los sistemas de referencia (Figura 5C,D) de modo que un vector de velocidad dado se asigna a múltiples contenedores.
- Caracterizar las correlaciones espaciales locales de los movimientos celulares por la velocidad media de otras células que se encuentran en las proximidades de una célula en movimiento, como se describió anteriormente38,39.
,
,
para cada celda i y punto de tiempo t37. Caracterizar los cultivos por el promedio poblacional de estas medidas unicelulares, evaluadas en un punto de tiempo adecuado t.
exponencial, donde a, x0 y U0 son parámetros de ajuste. De los tres parámetros de ajuste, concéntrese en x0, la longitud de correlación(Figura 5I,J),que es la distancia característica donde desaparecen las correlaciones locales velocidad-velocidad.
Figura 5: Caracterización de la formación de corrientes de células cultivadas. (A,D) Las imágenes de lapso de tiempo de contraste de fase de la Figura 4A se utilizan para identificar los movimientos celulares. Para cada celda en movimiento, un marco de referencia (azul) y contenedores espaciales (blanco) se alinearon para categorizar las celdas adyacentes como delanteras, traseras, izquierdas o derechas. (B,E) La velocidad de las celdas adyacentes (vectores negros) se relacionó con el mismo marco de referencia(C,F). Este procedimiento se repitió para cada celda y punto de tiempo. (G) Después de agrupar esta información local, cada contenedor contendrá múltiples vectores de velocidad (gris), que se pueden promediar para determinar la velocidad media de co-movimiento (flechas magenta) en varios lugares en relación con una celda móvil promedio. (H) El mapa de velocidad media caracteriza así las velocidades típicas de las células en varios lugares en relación con una célula en movimiento. (I,J) Finalmente, este campo se muestreó a lo largo del eje delantero-trasero (paralelo) y también a lo largo del eje izquierda-derecha (perpendicular). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
La disección de los estantes palatales se ilustra en la Figura 1. La secuencia de incisiones está diseñada para minimizar el deslizamiento del tejido. Después de la extracción de la cabeza (Figura 1A,B), se retira la mandíbula inferior ( Figura1B, C). La incisión de la parte superior de la cabeza (Figura 1C,D) se realiza para estabilizar el tejido cuando se coloca boca abajo ( Figura1E) para visualizar (Figura 1E, líneas punteadas), pellizcar (Figura 1F) e excise (Figura 1G) los estantes palatales.
El par de estantes palatales extirpados de un solo embrión se tripsiniza y se cultiva en un plato de 35 mm o en un pozo de un plato de 6 pozos. No se prefieren platos más grandes ya que la densidad celular es demasiado baja para un crecimiento óptimo. Tras la confluencia, las células de cada pozo se tripsinizan y se pasan a tres pozos equivalentes a 35 mm (pasaje # 1). Las células confluentes del pasaje #1 se pueden congelar en alícuotas de 1 × 106 células/ml. Las alícuotas congeladas se cultivan posteriormente en un plato equivalente a 35 mm y se cultivan hasta la confluencia. Las células se tripsinizan (pasaje # 2) y se siembran de acuerdo con el experimento. La creación y el uso de alícuotas congeladas ayudaron a normalizar las condiciones, especialmente con respecto a la densidad celular. El uso de células MEPM frescas resultó en una mayor variabilidad en la densidad celular final en los experimentos, lo que se cree que se debe a una proporción variable de células viables o subs viables en cultivos frescos. Además, el número de pasajes celulares MEPM se limitó estrictamente a dos (enumerados anteriormente) para estos experimentos.
Teniendo en cuenta que a) la densidad celular era crítica, b) las células MEPM de un solo embrión eran limitadas, y c) la óptica de imágenes era mejor en un plato grande, se utilizaron insertos de silicona de 2 pozos(Figura 2 y Figura 3). Para los ensayos de reparación de heridas, las células MEPM se cultivaron en los insertos de silicona de 2 pozos hasta la alta confluencia, luego se retiraron los insertos y se fotografió la herida hasta el cierre(Figura 3). Sin embargo, para el cultivo 2D, las células MEPM necesitaban imágenes a medida que crecían, por lo que los insertos de silicona de 2 pomos simplemente se recortaron a 1/3 de su altura para permitir imágenes claras(Figura 2C). También se utilizaron pequeños anillos impresos en 3D de40 en platos de 35 mm para el análisis de motilidad 2D(Figura 2D).
Las trayectorias de MEPM(Figura 4E)son persistentes: la dirección de la motilidad celular se mantiene durante varias horas. El análisis de desplazamiento medio vs. tiempo (Figura 4F) indica que la persistencia en forma de desplazamiento es proporcional con el tiempo transcurrido. La velocidad típica de las células MEPM en la superficie plástica de cultivo de tejidos, 10 μm / h, también se puede utilizar para el control de calidad del cultivo celular. El análisis de flujo de los datos de motilidad revela que los grupos co-móviles de las células MEPM tienen un tamaño de ~ 300 μm(Figura 5I,J). Los resultados representativos también indican una profunda diferencia de motilidad entre las células MEPM de tipo salvaje y mutantes. Además de la comparación de tipos salvajes y mutantes, tanto los ensayos 2D como los de reparación de heridas se pueden combinar con varios tratamientos bioquímicos. Por ejemplo, se han utilizado activadores de la vía PI3K-AKT con células MEPM, como se describió anteriormente 21.
Figura 1: Disección de estantes palatales embrionarios para aislar células mesenquimales. ( A ) Se extraeunacabeza embrionaria de ratón E13.5 cortando a lo largo del cuello (línea roja). (B) A continuación, la mandíbula inferior y la lengua se extraen con incisiones a lo largo de la cavidad oral, entre las mandíbulas superior e inferior (línea amarilla). (C) Para estabilizar el tejido para la eliminación de la plataforma palatal, se extirpa la parte superior de la cabeza (línea verde). (D) La región de la mandíbula superior diseccionada resultante se coloca (E) al revés para visualizar los estantes palatales (líneas punteadas negras). (F) La escisión de estantes palatales individuales se representa esquemáticamente, donde los estantes sobresalientes individuales (amarillo) se pellizcan del maxilar (azul). (G) Se extirpan un par de estantes palatales de un solo embrión, que luego se pueden tripsinizar y cultivar en un plato de 35 mm o en un plato de 6 pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración experimental del cultivo celular 2D MEPM. (A) Descongelar una alícuota congelada de células MEPM, y (B) cultivar las células en un plato de 35 mm o una placa de 6 pozos. Cuando sea confluente, tripsinizar las células y sembrarlas como se describe en el protocolo en un plato de 35 mm, ya sea con insertos de silicona de 2 pozos(C)que hayan sido recortados o(D)con anillos impresos en 3D. Un espacio de cultivo pequeño minimiza la necesidad de un gran número de células MEPM. El perfil bajo de los insertos de silicona recortados o los anillos impresos en 3D permite obtener imágenes directas sin un efecto de halo. Las imágenes de lapso de tiempo pueden continuar hasta que se logre la densidad celular deseada, que puede ser de hasta 72 h. Las imágenes representativas se muestran en los puntos de tiempo (E) 0 h, (F) 24 h y (G) 45 h. Las imágenes fueron tomadas usando un objetivo 4x. Las barras de escala para E, F, G = 300 μm. Abreviaturas: 2D = bidimensional; MEPM = mesénquima palatal embrionario de ratón; 3D = tridimensional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración experimental del ensayo de cierre de heridas utilizando células MEPM. (A) Descongelar una alícuota congelada de células MEPM, y (B) células de cultivo en un plato de 35 mm o en un plato de 6 pozos. Cuando estén confluentes, tripsinizar las células y(C)sembrarlas en los insertos de silicona de 2 pozos en un plato de 35 mm. Culta las células en el inserto hasta que se logre la confluencia deseada (~ 48 h), luego retire el inserto de silicona y la imagen. Las imágenes representativas se muestran (D) inmediatamente después de la extracción del inserto, (E) después de 24 h, y (F) después de 40 h. El cierre de la herida tarda alrededor de 36 h. Las imágenes fueron tomadas usando un objetivo 10x. La barra de escala representa 300 μm. Abreviaturas: MEPM = mesénquima palatal embrionario de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La elevación de la plataforma palatal constituye un evento de remodelación vertical a horizontal1,3,4,9,11. Se postula que este proceso de remodelación requiere que las células mesenquimales de la plataforma palatal se comporten coordinadamente. Los análisis con células MEPM de tipo salvaje muestran que este comportamiento celular es intrínseco y puede ser cuantificado21. Por lo tanto, estos ensayos se pueden utilizar para descubrir defectos primarios de elevación de la plataforma palatina en modelos de ratón nuevos y existentes de paladar hendido. Los métodos descritos en las secciones 1 y 2 deben permitir a los investigadores aislar, cultivar y congelar alícuotas de células MEPM primarias. Estas células se pueden utilizar para una amplia variedad de aplicaciones, incluido el cultivo 2D y los ensayos de reparación de heridas descritos aquí. El cultivo 2D, cuando se combina con imágenes de lapso de tiempo, presenta un método simple para determinar los atributos básicos de las células en un rango de densidades celulares. Aquí se presenta un método para evaluar la alineación celular y la formación de corrientes celulares, que son atributos del movimiento celular colectivo(Figura 4). Los ensayos de cierre de heridas se utilizan comúnmente para evaluar la migración celular41,42,43. La región libre de células de la "herida" proporciona una señal para el movimiento direccional de las células en la periferia. Las imágenes de lapso de tiempo de este proceso permitieron la determinación y evaluación de las trayectorias celulares durante la migración. Estas trayectorias celulares, a su vez, determinan la velocidad de migración celular y la direccionalidad(Figura 5).
Es importante optimizar primero las condiciones para el cultivo y los ensayos utilizando solo células MEPM de tipo salvaje. Después de que los estantes palatales se hayan tripsinizado con éxito y la suspensión de una sola célula resultante se haya plateado durante la noche, la gran mayoría (~ 90%) de las células se unirán fácilmente a la superficie de crecimiento del plato. Si las células no se adhieren fácilmente, entonces puede haber algo mal con las condiciones de cultivo. Inicialmente, las células adheridas se verán bastante homogéneas, con una forma triangular o ligeramente alargada, pero a medida que crecen a una alta densidad, se vuelven más en forma de huso y alargadas(Figura 2). Si las células se vuelven dramáticamente grandes en tamaño o multinucleadas, no deben usarse para experimentos. Esta optimización también establecerá parámetros básicos de tipo salvaje para un crecimiento exitoso (tiempo hasta la confluencia) y la reparación de heridas (tiempo hasta el cierre). Las células deben proliferar duplicándose en número casi diariamente y en imágenes de lapso de tiempo, mostrar motilidad de ~ 5-10 μm / h. Del mismo modo, si en cualquier experimento posterior que implique una comparación de wildtype-mutant, estos parámetros básicos no son cumplidos por las células wildtype, el experimento puede necesitar ser excluido del análisis. Por ejemplo, las células MEPM de tipo salvaje tardan 36-40 h en cerrar completamente la herida utilizando los insertos de silicona de 2 pozos. Si en un experimento, las células de tipo salvaje tardan significativamente más de 40 h en cerrar la herida, todo el experimento sería sospechoso. El bajo rendimiento de las células MEPM puede deberse a 1) mala calidad de la alícuota congelada, 2) mala reactivación o 3) diferenciación excesiva. Las células diferenciadas o senescentes se pueden detectar visualmente a medida que crecen mucho y no se dividen. Se debe evitar un cultivo con un gran número de tales células. En general, no debe haber células anormales en el campo de visión de un objetivo 10x (Figura 3); una o dos celdas fuera del campo de visión no deben afectar materialmente al análisis. Restringir el análisis a solo dos pasajes celulares (arriba) ayuda en gran medida a mantener la calidad de las células MEPM.
Tanto para el cultivo 2D como para los ensayos de reparación de heridas utilizando células MEPM primarias, el requisito clave para el éxito fue una alta densidad celular inicial. Este requisito se determinó por primera vez durante la optimización del ensayo de reparación de heridas en el que se sembraron células a >1400 células/mm2. La densidad de las células que migran a la herida se utilizó como densidad de siembra en ensayos de cultivo 2D. Una densidad de siembra de ~ 300 células / mm2 formó corrientes celulares, al tiempo que permite el análisis automatizado de las trayectorias celulares. Las densidades superiores a 300 células/mm2 tienden a formar corrientes más vívidas que pueden visualizarse a simple vista, pero dificultan el seguimiento celular individual. Al comparar células MEPM primarias de embriones de tipo salvaje y mutantes, aunque el retraso en el cierre de la herida se puede evaluar sin un análisis computacional, la formación de corrientes y las diferencias de direccionalidad pueden no ser discernibles a simple vista. Si la densidad celular es demasiado alta o la calidad de la imagen es pobre / borrosa, por ejemplo, debido a la pérdida de enfoque, el seguimiento automatizado de la célula puede ser difícil. En tal caso, es posible utilizar el seguimiento manual de células para determinar las trayectorias celulares en ensayos de reparación de heridas utilizando ImageJ. También se puede utilizar una concentración muy baja de tinción nuclear de Hoechst (3 μL/ml de solución de 20 mM en el medio de cultivo MEPM) para facilitar el seguimiento celular; sin embargo, la toxicidad del láser fluorescente puede ser un problema con el uso prolongado.
Para el seguimiento manual, era más fácil rastrear las células a la inversa desde el final del cierre de la herida hacia atrás en la medida de lo posible hasta que la alta densidad celular oscurecía el seguimiento adicional. Incluso las trayectorias celulares parciales, cuando se combinan para una población celular, fueron informativas. A diferencia de los ensayos de reparación de heridas, se requiere un seguimiento celular automatizado para el análisis de cultivo celular 2D, que es una de las razones por las que se eligieron las densidades celulares intermedias. Por último, se pueden utilizar análisis primarios sensibles basados en MEPM para identificar compuestos y vías que pueden afectar la elevación del paladar. Estudios previos indicaron que la activación de la vía PI3K-AKT mejoró tanto la velocidad celular como la direccionalidad de las células MEPM mutantes Specc1l 21. Otros estudios de MEPM también han utilizado diversos tratamientos con factor de crecimiento o farmacológicos para estimular las cascadas de señalización aguas abajo o para evaluar la proliferación22,29,30,44,45. Por lo tanto, los análisis basados en MEPM ofrecen un método rápido para identificar muchos más factores reguladores positivos o negativos, que luego pueden validarse in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado en parte por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DE026172 (I.S.) y GM102801 (A.C.). I.S. también fue apoyado en parte por la subvención del Centro de Excelencia en Investigación Biomédica (COBRE) (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM104936), la subvención de la Red IDeA de Kansas para la Excelencia en Investigación Biomédica (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM103418) y la subvención del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo intelectual y del desarrollo (KIDDRC) de Kansas (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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