Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Изоляция и покадровая визуализация первичных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши для анализа коллективных атрибутов движения

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Мы представляем протокол выделения и культивации первичных эмбриональных небных мезенхимальных клеток мыши для покадровой визуализации двумерного (2D) роста и ран-восстановительных анализов. Мы также предоставляем методологию анализа данных покадровой визуализации для определения образования клеточного потока и направленной подвижности.

Abstract

Развитие неба – это динамичный процесс, который включает в себя вертикальный рост двусторонних небных полок рядом с языком с последующим возвышением и сращинием над языком. Дефекты в этом процессе приводят к расщелине неба, распространенному врожденному дефекту. Недавние исследования показали, что поднятие небной полки включает в себя процесс реконструкции, который преобразует ориентацию полки из вертикальной в горизонтальную. Роль мезенхимальных клеток небной полки в этом динамическом ремоделирование было трудно изучить. Количественный анализ на основе покадровой визуализации недавно был использован, чтобы показать, что первичные эмбриональные небные мезенхимальные клетки мыши (MEPM) могут самоорганизовываться в коллективное движение. Количественный анализ может выявить различия в мутантных клетках MEPM из мышиной модели с дефектами высоты неба. В этой статье описываются методы выделения и культивирования клеток MEPM из эмбрионов E13.5, специально для покадровой визуализации, и определения различных клеточных атрибутов коллективного движения, включая меры по формированию потока, выравниванию формы и сохранению направления. В нем утверждается, что клетки MEPM могут служить прокси-моделью для изучения роли мезенхимы небной полки во время динамического процесса подъема. Эти количественные методы позволят исследователям в черепно-лицевой области оценивать и сравнивать коллективные атрибуты движения в контрольных и мутантных клетках, что расширит понимание ремоделирования мезенхимальных мешков во время подъема небного шельфа. Кроме того, клетки MEPM обеспечивают редкую модель мезенхимальных клеток для исследования коллективного движения клеток в целом.

Introduction

Развитие неба было широко изучено, поскольку дефекты небного генеза приводят к расщелине неба - распространенному врожденном дефекту, который возникает в единичных случаях или как часть сотен синдромов1,2. Развитие эмбрионального неба является динамическим процессом, который включает в себя движение и слияние эмбриональной ткани. Этот процесс можно разделить на четыре основных этапа: 1) индукция небных полок, 2) вертикальный рост небных полок рядом с языком, 3) возвышение небных полок над языком и 4) слияние небных полок на средней линии1,3,4. За последние несколько десятилетий у многих мышиных мутантов были выявлены проявления расщелины неба5,6,7,8. Характеристика этих моделей показала дефекты на этапах индукции, пролиферации и слияния небной полки; однако дефекты высоты небных шельфов были редкими. Таким образом, понимание динамики возвышения небного шельфа является интригующей областью исследований.

Тщательный анализ некоторых мышиных мутантов с дефектами высоты небной полки привел к текущей модели, показывающей, что сама передняя область небной полки, по-видимому, переворачивается вверх, в то время как вертикальное к горизонтальному движению или «ремоделирование» небных полок происходит в средней и задней областях неба1,3,4, 9,10,11. Эпителий медиальной кромки небной полки, вероятно, инициирует передачу сигналов, необходимую для этого ремоделирования, которое затем приводится в действие мезенхимой небной полки. В последнее время многие исследователи выявили задержку подъема небной полки в мышиных моделях, которые показали преходящие пероральные спайки с участием небных полок12,13. Мезенхимальное ремоделирование предполагает реорганизацию клеток для создания выпуклости в горизонтальном направлении, одновременно втягивая небную полку в вертикальном направлении9,10,14. Среди нескольких механизмов, предложенных для воздействия на высоту небной полки и лежащее в основе мезенхимальное ремоделирование, - пролиферация клеток15,16,17,хемотаксические градиенты18и компоненты внеклеточного матрикса19,20. Возник важный вопрос: наблюдается ли задержка подъема небной полки у мышей с дефицитом Specc1l такжечастично из-за дефекта ремоделирования небной полки, и может ли этот дефект ремоделирования проявляться во внутреннем дефекте поведения первичных клеток MEPM21?

Первичные клетки MEPM использовались в черепно-лицевой области для многих исследований, включающих экспрессию генов22,23,24,25,26,27,28,29,и несколько, включающих пролиферацию30,31 и миграцию25,31,32 , но не для коллективного анализа поведения клеток. Покадровую визуализацию клеток MEPM проводили в 2D-культуре и раневосточных анализах, чтобы показать, что клетки MEPM демонстрируют направленное движение и формируют зависящие от плотности клеточные потоки-атрибуты коллективного движения21. Кроме того, мутантные клетки Specc1l образовывали более узкие клеточные потоки и демонстрировали сильно изменчивые траектории миграции клеток. Считается, что это отсутствие скоординированной подвижности способствует задержке подъема неба у мутантных эмбрионов Specc1l 13,21. Таким образом, эти относительно простые анализы с использованием первичных клеток MEPM могут служить прокси для изучения ремоделирования мезенхимальных веществ во время подъема небного шельфа. В этой статье описывается изоляция и культура первичных клеток MEPM, а также покадровая визуализация и анализ для 2D и ран-восстановительных анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с участием животных проводились с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных KUMC, в соответствии с их руководящими принципами и правилами (Номер протокола: 2018-2447).

1. Соберите эмбрионы E13.5

  1. Усыпляйте беременных самок мышей с помощью ингаляционной камерыCO2 или по процедуре, одобренной Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Немедленно приступайте к рассечению.
  2. Обнажить нижнюю половину брюшной полости путем удаления кожи и брюшины. Иссечение обоих рогов матки, которые содержат эмбрионы Е13.5.
  3. Кратковременно поместите матку в предварительно распавленный 37 °C стерильный фосфат-буферный физиологический раствор (PBS), чтобы смыть избыток крови, волос или другого мусора. Поместите матку в стерильную 10 см посуду, наполненную стерильным PBS.
  4. Используя небольшие ножницы, прорежьте стенку матки по всей длине матки, чтобы обнажить каждый эмбрион, все еще на свою желтковую мешок. Удалите желточный мешок, окружающий эмбрион, но сохраните его для генотипирования, если это необходимо. По мере удаления эмбрионов поместите каждый эмбрион в свой собственный колодец из 12-скважинной пластины, заполненной PBS.

2. Рассечение небных полок из эмбрионов(Рисунок 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте инструменты для рассечения нержавеющей стали (см. Таблицу материалов)после обработки каждого эмбриона, помещая инструменты сначала в замок со 100% этиловым спиртом (EtOH), затем в инструментальный стерилизатор при 350 °C в течение 10 с, а затем охлаждая их во втором якере 100% EtOH.

  1. Используя стерилизованную перфорированную ложку, поместите эмбрион в новую 10-сантиметровую посуду, наполненную питательной средой MEPM, состоящей из минимальной необходимой среды Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной бычий сыворотки (FBS), L-глутамина (4 мМ L-Glu) и антибиотиков-пенициллина и стрептомицина (50 единиц / мл).
  2. Обезглавить эмбрион прямо под линией челюсти стерильными ножницами(рисунок 1А,красная пунктирная линия). Удалите нижнюю челюсть, вставив одну точку стерилизованных тонких щипцов No 5 в рот, удерживая ее только внутри щеки. Протолкните точку вставленных щипцов до тех пор, пока она не выйдет из задней части черепа.
  3. Наведите щипцы вдоль желтой линии на рисунке 1Bтак, чтобы другая сторона щипцов (которая все еще находится вне эмбриона) парила прямо над ушным каналом, затем зажмите щипцы, чтобы разрезать ткань. При необходимости провести еще один тонкий щипц по шву теперь уже закрытых щипцов, чтобы разрезать любую ткань, которая не была полностью разорвана щепоткой.
  4. Повторите предыдущий шаг для другой стороны головки эмбриона. Продолжайте процедуру щипки, чтобы полностью удалить нижнюю челюсть, язык и нижнюю часть черепа и обнажить небные полки.
  5. Удалите череп черепа, разрезав чуть выше глаз, как показано на рисунке 1C (зеленая линия). Сделайте это, поместив голову на левую или правую сторону и расположив точки небольших ножниц из нержавеющей стали перед и позади черепа чуть выше уровня глаз эмбриона. Отрежьте верхнюю часть черепа одним быстрым ножницами, создав плоскую поверхность, которая будет важна для стабильности на последующих этапах и которая должна выглядеть как рисунок 1D при взгляде сбоку.
  6. Поместите оставшуюся часть головы вверх ногами, при этом верхний аспект головы (череп удален) лежит ровно на дне тарелки, что обеспечит стабильную поверхность для удаления небной полки. Найдите минутку, чтобы определить небные полки, которые теперь выставлены и обращены вверх и будут выглядеть как два приподнятых гребня по обе стороны от центральной канавки в передней половине головы(рисунок 1E).
  7. Прикрепить оставшуюся часть головки к блюду, чтобы обездвижить ее, пока полки удалены. Сделайте это, вставив одну точку тонкого щипца через ткань около носовой области головы, с передней стороны к небным полкам, а другую точку щипцов вставьте через основание черепа, с задней части небных полок. Держите их на месте во время выполнения иссечения небных полок.
    1. Обездвижив головку одной рукой, выберите любую из двух полок для удаления первой, и вставьте обе точки второй пары тонких щипцов в ткань у основания боковой поверхности полки и защемление, чтобы разрезать ткань(рисунок 1F). Повторите это вдоль основания медиаль-поверхности полки, а затем на переднем и заднем концах полки, чтобы отсоедиться от головки.
  8. Аккуратно приподнимите полку, сделав дополнительные щипки, по мере необходимости, чтобы полностью освободить полку от окружающих тканей.
  9. Повторите предыдущие два шага, чтобы удалить вторую небную полку.
  10. Теперь, когда небные полки освобождены от окружающих тканей и помещены в PBS(рисунок G),используйте стерильную пластиковую лампу-переноску-пипетку, чтобы вытянуть полки в пипетке и перенести их в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл вместе с примерно 500 мкл PBS. Держите трубки, содержащие небные полки, на льду, так как остальная часть подстилки обрабатывается таким же образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, полки могут быть помещены в микроцентрифужную трубку 1,5 мл, содержащую предварительно расплавленный трипсин (0,25%) сразу после рассечения (вместо того, чтобы помещать их на лед). Образцы будут более свежими, но необходимо позаботиться о том, чтобы вовремя выполнить все дальнейшие шаги для каждого отдельного образца, а не обрабатывать образцы коллективно.

3. Культура клеток MEPM

ПРИМЕЧАНИЕ: В условиях, описанных здесь, эпителиальные клетки неба не выживают при первом прохождении, что приводит к чистой культуре мезенхимальных клеток неба. Используйте стерильную технику для выполнения всех шагов в вытяжке культуры тканей.

  1. Аспирировать и выбросить PBS из трубки 1,5 мл, заботясь о том, чтобы не выбросить полки в процессе. Немедленно добавьте 200 мкл предварительного (37 °C) трипсина (0,25%) в каждую трубку, содержащую небные полки. Кратковременно пипеткой полок вверх и вниз в трипсине, используя наконечник пипетки 1000 мкл, чтобы ускорить трипсинизацию.
  2. Инкубировать пробирки в течение 5 мин при 37 °C, затем пипетировать каждый образец вверх и вниз снова, чтобы помочь разрушить ткань. Инкубируют трубки еще 5 мин при 37 °C и еще раз пипетируют вверх и вниз, чтобы завершить диссоциацию ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полки должны быть полностью или почти полностью диссоциированы и взвешены в трипсине без видимых кусков ткани.
  3. Добавляйте 800 мкл мкл питательной среды MEPM (этап 2.1) в каждую пробирку 1,5 мл. Центрифугируют пробирку 1,5 мл при 200 × г в течение 5 мин для гранулирования клеток. Удалите супернатант и повторно суспендируют гранулу клеток в 1 мл питательной среды MEPM.
  4. Налечите клетки MEPM в 6-скважинную тканевую культурную пластину, содержащую культурную среду MEPM. Дайте клеткам прилипать к пластиковой поверхности в течение 12 ч при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После ночной инкубации подавляющее большинство (~ 90%) клеток прикрепляются. В этот момент прилипшения клеток будут выглядеть достаточно однородно, с треугольной или слегка вытянутой формой.
  5. Меняйте среду каждый день, осторожно аспирируя старую среду и немедленно заменяя ее 1 мл теплого стерильного PBS без кальция или магния в течение ~ 1 мин. Аспирировать PBS и заменить 3 мл досовой питательной среды MEPM.
  6. Проходит клетки, как только они становятся 100% сливаются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки MEPM должны размножаться, удваивая их количество почти ежедневно.
    1. Чтобы пройти клетки, аккуратно аспирируйте старую среду и немедленно замените ее теплым PBS без кальция или магния в течение ~ 1 мин. Аспирировать PBS и заменить его 0,5 мл предварительного 0,25% трипсина.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение ~5 мин или до тех пор, пока клетки не отсоедут от поверхности чашки при осторожном раскачиваниях вперед и назад вручную. Как только клетки отделятся, немедленно добавьте 5 мл предварительной культуральной среды MEPM к трипсинизированным клеткам.
    3. Используя серологический пипеток 10 мл, аккуратно соберите клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугируйте трубку при 200 × г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. Аспирировать трипсин и среду и повторно суспендировать клетки в 3 мл предварительной питательной среды MEPM. Осторожно пипетируйте 1 мл клеток в одну скважину 6-скважинной чашки и добавьте 2 мл культуральной среды MEPM, чтобы довести общий объем до 3 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это представляет собой разделение клеток 1:3. MEPM могут быть проезжаемы до трех раз. Плотность посева MEPM несколько гибкая, а количество присутствующих клеток варьируется в зависимости от культурного сосуда. Тем не менее, MEPM не размножаются должным образом, когда они разделены слишком редко, и должны быть по крайней мере на 20-25% влиты в их новое блюдо, как только они прилипают.

4. Криоконсервация клеток MEPM

  1. После того, как трипсинизированные клетки MEPM гранулированы, повторно суспендируют клетки в культурально-питательной среде MEPM для получения концентрации ~ 1 ×10 6 клеток / мл. Пипетка клеток в криовиалы и добавление конечной концентрации 5% диметилсульфоксида в клеточный запас. Колпачок криовиала, ненадолго перемешайте путем инвертирования и немедленно поместите флаконы в морозильную емкость, которая охлаждается со скоростью 1 °C/мин.
  2. Поместите охладитель в морозильную камеру при -80 °C на ночь. На следующий день переместите криовиалы в резервуар для жидкого азота для длительного хранения.
  3. Оттаивание криоконсервных клеток MEPM
    1. Удалите криовиалы из резервуара с жидким азотом и разморозьте при комнатной температуре, пока содержимое не начнет становиться жидким. Опорожните содержимое в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл предварительной питательной среды MEPM.
    2. Центрифугирование трубки при 200 × г для гранулирования клеток. Повторно суспендировали клетки в 1 мл питательной среды MEPM и пипетировали клетки в одну скважину из 6-скважинной пластины. Добавьте 2 мл теплой питательной среды MEPM, чтобы довести общий объем до 3 мл.
    3. Культивьку клеток при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2. Меняйте среду ежедневно.

5. Живая визуализация клеток MEPM - 2D коллективный миграционный анализ(рисунок 2)

  1. Подготовьте пластину для использования в реальном времени.
    1. Используйте небольшие хирургические ножницы или острый скальпель, чтобы укоротить стерильную 2-х скважинную силиконовую вставку до высоты ~1 мм. Подготовьте вставку для каждого используемого образца.
    2. Используя щипцы, поместите укороченную 2-скважинную силиконовую вставку в центр колодца 6-скважинной пластины. Прижмите по всем краям, чтобы убедиться, что он полностью приклеен.
  2. Оттаивайте криоконсервные клетки, следуя шагам, описанным в разделе 4.3 настоящего протокола. Подсчитайте клетки MEPM и посыпяйте300 клеток/мм2 укороченной силиконовой вставки в общем объеме 40-50 мкл культуральной среды MEPM на скважину. Культивь на ночь при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2.
  3. На следующий день подготовьтесь к покадровой съемке в реальном времени.
    1. Используйте фазово-контрастный микроскоп с инкубатором на сцене и возможностью автоматической визуализации. Добавить воду в резервуар инкубатора на сцене для уменьшения испарения питательной среды; установить температуру на 37 °C и CO2 на 5%. Дайте ~30 мин, чтобы влажность нарасти, прежде чем поместить 6-скважинную посуду в инкубатор на сцене.
  4. Используйте параметры, эквивалентные приведенным ниже, для покадровой визуализации.
    1. Выберите цель 4x, чтобы иметь большие поля зрения и фильтр фазовой контрастности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автофокус, образец автоматического поиска, z-стек и автоматическое освещение обычно не нужны.
    2. Выберите два микроскопических поля на лунку, чтобы захватить просвет укороченного силиконового вставок. Убедитесь, что все положения изображения имеют правильную фокусировку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плоскости изображения могут быть отрегулированы во время визуализации, но такая настройка обычно не требуется.
    3. Выберите нужный тип выходного файла изображения, затем выберите или откажитесь от выбора параметров после создания изображения, таких как автоматическое создание видео и водяные знаки, по желанию. Если применимо, выберите фазовый контраст в качестве режима визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование водяных знаков может препятствовать последующим этапам обработки изображения.
    4. Установите продолжительность записи на 72 ч. Настройте программу на захват изображений каждые 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется только 48 ч визуализации, но визуализация может быть остановлена в любой момент до отметки 72 ч без потери изображений, которые уже были сделаны.
    5. Убедитесь, что экологическая камера функционирует в соответствии с требованиями, предусмотренными в разделе 5.3.1. Сохраните этинастройки (рутину)и начните создание образа.
  5. Продолжайте съемку до 72 ч (или указанного времени).

6. Живая визуализация клеток MEPM в анализе восстановления ран(рисунок 3)

  1. Подготовьте пластину для использования в реальном времени. Используя щипцы, поместите стерильную силиконовую вставку из 2 скважин в центр колодца 6-скважинной пластины и прижмите по всем краям, чтобы она полностью приклеилась. Подготовьте одну 2-скважинную вставку для каждого используемого образца.
  2. Оттаивайте криоконсервные клетки, следуя шагам, описанным в разделе 4.3 настоящего протокола. Подсчитайте клетки MEPM и при необходимости сконцентрируйте клетки по меньшей мере до 350 клеток/мкл.
  3. Посейте 1400 клеток/мм2 в силиконовые вставки в объеме 100 мкл питательной среды MEPM на скважину. Культививляйте клетки в течение 48 ч при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2и меняйте среду каждый день.
  4. Через 48 ч подготовьте микроскоп для покадровой визуализации в реальном времени, как описано в разделах 5.3 и 5.4. Непосредственно перед помещением клеток в инкубатор на сцене добавьте в колодец (но вне вкладыш) 3 мл предварительно распохлоенной культурального носителя MEPM, а затем аккуратно удалите силиконовые вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стенка, разделяющая 2 камеры, оставляет щель, которая является «раной».
  5. Начните покадровую визуализацию, как описано в 5.4, со следующими отличиями:
    1. Используйте объектив с более высоким увеличением (например, 10x). Чтобы запечатлеть закрытие раны, выберите 5 полей зрения вдоль каждой раны, чтобы рана была параллельна вертикальной оси изображения.
  6. Прекратить визуализацию через 72 ч или когда раны полностью закрылись.

7. Вычислительный анализ покадровых последовательностей изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры на компьютере, оснащенном стандартными вычислительными инструментами, такими как интерпретатор python, компилятор C и оболочка (см. Таблицу материалов).

  1. Анализ слияний
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть использована для оценки пролиферации клеток в разреженной культуре или для количественной оценки экспериментов по закрытию ран. Для обнаружения областей, занимаемых ячейками, к локальному стандартному отклонению яркости изображения применяется порог сегментации. Код был описан ранее Wu et al.33 и Neufeld et al.34 и доступен по адресу http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Определите порог сегментации для изображений. Например, чтобы увидеть сегментацию с пороговым значением 4, выполните команду
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -тестовый выход.jpg
      а затем проверьте вывод (output.jpg).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если порог слишком низкий, фоновые области на микрофотографии классифицируются как покрытые ячейками. Напротив, если порог слишком высок, области, покрытые ячейками, не классифицируются как таковые. Оптимальное пороговое значение сводит обе ошибки к минимуму.
    2. Используйте предоставленный сценарий area.sh для вычисления значений слияния последовательности изображений как
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > слияние.dat
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение дискриминации 4 проверяется на шаге 1, и результаты сохраняются в файле слияния.dat. Сортируя изображения по соответствующим папкам, список имен файлов изображений можно заменить подстановочными знаками:
      слияние area.sh -S4 *.jpg >.dat
    3. Для экспериментов по закрытию раны преобразуйте данные о слиянии A(t)-размер площади, покрытой клетками, выраженный в процентах как функция времени- в скорость распространения раневой кромки V как
      Equation 1
      где w обозначает ширину поля, а dA/dt — производную по времени от A(t), т. е. скорость расширения площади, покрытой ячейкой.
  2. Карта подвижности клеток
    1. Выполнение алгоритма велоциметрии изображения частиц (PIV) для характеристики подвижности клеток и извлечения степени локального движения «оптического потока» между парами изображений, но не для идентификации отдельных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется начальный размер окна 50 мкм, как подробно описано Zamir et al.35 и Czirok et al.36,с начальным размером окна 50 мкм. Анализ PIV дает поле скорости v(x,t) для каждого кадра изображения t и местоположения (внутри изображения) x.
    2. Извлеките среднюю скорость подвижности клеток из v(x,t) как пространственное среднее, рассчитанное по занимаемой клетке площади, как определено в разделе 7.1.
  3. Ручное отслеживание ячеек
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как анализ PIV обеспечивает автоматическую оценку подвижности клеток, чтобы сосредоточиться на поведении отдельных клеток, часто требуется ручное отслеживание. Хотя несколько инструментов предоставляют эту функциональность, очень полезно, если маркеры, расположенные вручную, могут быть изменены после их первоначального размещения, и если отслеживание может быть выполнено как вперед, так и назад во времени.
    1. Выполняйте отслеживание ячеек с помощью специально разработанного инструмента python (http://github.com/donnagreta/cm_track), который также предоставляет основные функции редактора, такие как удаление сегментов траектории.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент ручного отслеживания выдает позиции P(i,t) ячейки i в момент времени t в текстовом файле и вызывается как
      cm_track.py -i изображения/ -o трек.dat
      где покадровые изображения находятся в папке images/, а данные о положении собираются в дорожке файла.dat (рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4:Анализ отдельных траекторий клеток. (A) Фазово-контрастные покадровые микроснимки подвергаются (B, C) ручной процедуре отслеживания, которая маркирует клетки (зеленые точки). (D) Положения ячеек (x,y) сохраняются для каждой ячейки, отличающейся ее идентификатором, и для каждого кадра f.(E)Траектории могут быть наложены на микроснимки и обозначены цветом для указания временной информации. Например, в каждой траектории сине-красная цветовая палитра указывает на постепенно более поздние сегменты траектории, причем красный и синий обозначают начальное и конечное расположение ячеек соответственно. (F)Различные статистические свойства траекторий, такие как среднее квадратное смещение, могут быть извлечены и использованы для характеристики подвижности различных клеточных популяций, которые в этом примере включают клетки дикого типа (wt, синий) и нокдаун (kd, красный) MEPM. Шкала представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Наложение траекторий на изображения с помощью второго инструмента, вызываемого как
    visdat.py -d трек.dat -i изображения/ -o наложение/ -l999 -r3 -C2
  2. Соберите изображения с траекториями, наложенными в папку наложения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере данные о положении ячейки хранятся в дорожке файла.dat, в то время как последовательность покадровых изображений находится в папке изображений. Остальные параметры управляют максимальной длиной нарисованных траекторий (-l), размером символов (-r) и используемой цветовой схемой (-C).
  1. Анализ индивидуальных траекторий клеток
    1. Характеристика траекторий по общей длине пути
      Equation 2,
      и смещение сетки к ране
      Equation 3,
      где X обозначает проекцию P в направлении, перпендикулярном ране: координата x положений, когда рана параллельна оси y.
    2. Рассчитайте эффективность наведения как Equation 4 для каждой ячейки i, так и по времени t37. Охарактеризуйте культуры по популяции среднего значения этих одноклеточных мер, оцененных в подходящую точку времени t.
  2. Коллективное потоковое движение клеток
    1. Охарактеризуйте локальные пространственные корреляции движений клеток средней скоростью других клеток, которые находятся в непосредственной близости от движущейся клетки, как описаноранее 38,39.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислительный код доступен по адресу https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Выровняйте систему отсчета с направлениями спереди, сзади, влево и вправо к каждому вектору v(x,t) (рисунок 5A). Назначьте каждую из окружающих ячеек или вектор скорости PIV соответствующей пространственной ячейке системы отсчета(рисунок 5B). Повторите процедуру, так как каждый вектор служит источником систем отсчета(рисунок 5C, D), так что данный вектор скорости назначается нескольким бункерам.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Точка данных может находиться перед вектором и слева от другого.
      2. Поверните системы отсчета в общую ориентацию(рисунок 5C,F)и объедините их(рисунок 5G).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение каждого контейнера объединенных данных о скорости представляет собой вектор скорости(U),который указывает на пространственную корреляцию: среднее значение является мерой общей составляющей скорости(рисунок 5H).
      3. Подогнать поля потока U(x) с экспоненциальной Equation 5 функцией , где a, x0 и U0 являются параметрами соответствия. Из трех параметров подгонки сосредоточьтесь на x0, длине корреляции(рисунок 5I,J),которая является характерным расстоянием, на котором исчезают локальные корреляции скорости и скорости.

Figure 5
Рисунок 5:Характеристика формирования потока культивированных клеток. (A,D) Фазоконтрастные покадровые изображения с рисунка 4А используются для идентификации движений клеток. Для каждой движущейся ячейки система отсчета (синий) и пространственные бункеры (белый) были выровнены, чтобы классифицировать соседние ячейки как на передние, задние, левые или правые. (Б,Э) Скорость соседних ячеек (черных векторов) была связана с одной и той же системой отсчета(C,F). Эта процедура повторялась для каждой клетки и точки времени. (G) После объединения этой локальной информации каждый бункер будет содержать несколько векторов скорости (серый), которые могут быть усреднены для определения средней скорости совместного перемещения (пурпурные стрелки) в различных местах относительно средней подвижной клетки. Такимобразом, карта средних скоростей характеризует типичные скорости ячейки в различных местах относительно движущейся ячейки. (I,J) Наконец, это поле было отобрано вдоль передне-задней (параллельной) оси, а также вдоль оси левый-правый (перпендикулярный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рассечение небных полок проиллюстрировано на рисунке 1. Последовательность разрезов предназначена для минимизации проскальзывания ткани. После удаления головы(Фиг.1А,В)нижняя челюсть удаляется(Фиг.1В,С). Разрез верхней части головки(Рисунок 1С,D)делается для стабилизации ткани при размещении вверх ногами(Рисунок 1Е)для визуализации(Рисунок 1Е,пунктирные линии),защемления(Рисунок 1F)и акциза(Рисунок 1G)небных полок.

Иссеченная пара небной полки из одного эмбриона трипсинизируется и культивируется в посуде 35 мм или в колодец из 6-ю скважинной посуды. Большие блюда не являются предпочтительными, так как плотность клеток слишком низкая для оптимального роста. При слиянии клетки из каждой скважины трипсинизируются и проходят в три 35-мм эквивалентные скважины (проход No1). Затем слившиеся клетки из прохода No1 могут быть заморожены в аликвоты размером 1 × 106 клеток/мл. Замороженные аликвоты впоследствии выращивают в 35-миллиметровом эквиваленте блюда и выращивают до слияния. Затем клетки трипсинизируют (проход No 2) и засеивают в соответствии с экспериментом. Создание и использование замороженных аликвот помогло нормализовать условия, особенно в отношении плотности клеток. Использование свежих клеток MEPM привело к большей изменчивости конечной плотности клеток в экспериментах, что, как полагают, связано с переменной долей жизнеспособных или субжизоривных клеток в свежих культурах. Кроме того, количество проходов клеток MEPM было строго ограничено двумя (перечисленными выше) для этих экспериментов.

Учитывая, что а) плотность клеток была критической, б) клетки MEPM из одного эмбриона были ограничены, и в) визуализационные оптики были лучше в большой тарелке, использовались силиконовые вставки из 2 скважин(Рисунок 2 и Рисунок 3). Для анализа заживки ран клетки MEPM выращивали в 2-скважинных силиконовых вставках до высокого слияния, затем вставки удаляли, а рану визуалировали до закрытия(рисунок 3). Однако для 2D-культуры клетки MEPM нуждались в визуализации по мере их роста, поэтому 2-скважинные силиконовые вставки были просто обрезаны до1/3 их высоты, чтобы обеспечить четкую визуализацию(рисунок 2C). Небольшие 3D-печатные кольца40 в 35 мм тарелки также использовались для 2D-анализа подвижности(рисунок 2D).

Траектории MEPM(рисунок 4E)являются постоянными: направление подвижности клеток сохраняется в течение нескольких часов. Анализ среднего смещения ивремени (рисунок 4F)указывает на то, что стойкость в виде смещения пропорциональна прошедшему времени. Типичная скорость клеток MEPM на пластической поверхности тканевой культуры, 10 мкм/ч, также может быть использована для контроля качества клеточной культуры. Анализ потока данных о подвижности показывает, что ко-движущиеся кластеры клеток MEPM имеют размер ~300 мкм(рисунок 5I,J). Репрезентативные результаты также указывают на глубокую разницу подвижности между клетками дикого типа и мутантными клетками MEPM. В дополнение к сравнению диких типов и мутантов, как 2D, так и ранерезвещание могут быть объединены с различными биохимическими методами лечения. Например, активаторы пути PI3K-AKT использовались с клетками MEPM, как описано ранее 21.

Figure 1
Рисунок 1:Рассечение эмбриональных небных полок для выделения мезенхимальных клеток. (A)Головка эмбриона мыши E13.5 удаляется путем разрезания вдоль шеи (красная линия). (B)Далее нижняя челюсть и язык удаляются с разрезами вдоль ротовой полости, между верхней и нижней челюстями (желтая линия). (C) Для стабилизации ткани для удаления небной полки верхняя часть головки иссекается (зеленая линия). (D) Полученная рассеченная область верхней челюсти помещаетсявверхногами для визуализации небных полок (черные пунктирные линии). (F)Иссечение отдельных небных полок изображено схематично, где отдельные выступающие полки (желтый) отщепываются от верхней челюсти (синий). (G) Иссеченная пара небных полок из одного эмбриона, которую затем можно трипсинизировать и культивируем в 35-миллиметровой посуде или в 6-колодезной тарелке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Экспериментальная установка культуры клеток 2D MEPM. (A)Разморозить замороженную аликвоту клеток MEPM и(B)культивировать клетки в 35-миллиметровой чашке или 6-скважинной пластине. При слиянии попробуйте клетки и засыпьте их, как описано в протоколе, в 35-миллиметровую посуду либо с(C)2-скважинными силиконовыми вставками, которые были обрезаны, либо(D)с 3D-печатными кольцами. Небольшое пространство для культивируемых культур сводит к минимуму потребность в большом количестве клеток MEPM. Низкий профиль обрезанных силиконовых вставок или 3D-печатных колец позволяет получать прямые изображения без эффекта ореола. Покадровая визуализация может продолжаться до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток, которая может составлять до 72 ч. Репрезентативные изображения показаны в точках(E)0 ч,(F)24 ч и(G)45 ч. Снимки были сделаны с использованием 4-кратного объектива. Шкалы для E, F, G = 300 мкм. Сокращения: 2D = двумерный; MEPM = эмбриональная мезенхима небной области мыши; 3D = трехмерный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Экспериментальная установка анализа закрытия раны с использованием клеток MEPM. (A)Разморозить замороженную аликвоту клеток MEPM и(B)культуральной клетки в 35-миллиметровой чашке или 6-скважинной пластине. При слиянии трипсинизируют клетки и(С)засевают их в 2-х скважинные силиконовые вставки в посуде 35 мм. Культивирование клеток во вставке до достижения желаемого слияния (~48 ч), затем удалите силиконовую вставку и изображение. Репрезентативные изображения показываются(D)сразу после снятия вставки,(E)через 24 ч и(F)через 40 ч. Закрытие раны занимает около 36 ч. Снимки были сделаны с использованием 10-кратного объектива. Шкала представляет 300 мкм. Сокращения: MEPM = эмбриональная небная мезенхима мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Возвышение небного шельфа представляет собой вертикальное и горизонтальное событиереконструкции 1,3,4,9,11. Постулируется, что этот процесс ремоделирования требует, чтобы клетки мезенхимального ложа небной полки вели себя координированно. Анализы с клетками MEPM дикого типа показывают, что это поведение клеток является внутренним и может быть количественно определено21. Таким образом, эти анализы могут быть использованы для выявления первичных дефектов высоты небной полки в новых и существующих мышиных моделях расщелины неба. Методы, описанные в разделах 1 и 2, должны позволить исследователям изолировать, культивировать и замораживать аликвоты первичных клеток MEPM. Эти клетки затем могут быть использованы для широкого спектра применений, включая 2D-культуру и анализы восстановления ран, описанные здесь. 2D-культура в сочетании с покадровой визуализацией представляет собой простой метод определения основных атрибутов клеток в диапазоне плотностей клеток. Здесь представлен метод оценки выравнивания клеток и формирования клеточного потока, которые являются атрибутами коллективного движения клеток(рисунок 4). Анализы закрытия раны обычно используются для оценки миграции клеток41,42,43. Бесклеточная область «раны» обеспечивает сигнал для направленного движения клеток на периферии. Покадровая визуализация этого процесса позволила определить и оценить траектории клеток во время миграции. Эти траектории клеток, в свою очередь, определяют скорость и направленность миграции клеток(рисунок 5).

Важно сначала оптимизировать условия для культуры и анализов, используя только клетки MEPM дикого типа. После того, как палатальные полки были успешно трипсинизированы и полученная одноклеточная суспензия покрыта в течение ночи, подавляющее большинство (~ 90%) клеток легко прикрепляются к поверхности роста тарелки. Если клетки не легко прилипают, то может быть что-то не так с условиями культивировки. Изначально прилипшные клетки будут выглядеть достаточно однородными, с треугольной или слегка вытянутой формой, но по мере роста до высокой плотности они становятся более веретенообразными и вытянутыми(рисунок 2). Если клетки становятся резко большими по размеру или многоядерными, их не следует использовать для экспериментов. Эта оптимизация также установит основные параметры wildtype для успешного роста (время слияния) и восстановления раны (время до закрытия). Клетки должны размножаться, удваиваясь в количестве почти ежедневно и на покадровых изображениях, показывают подвижность ~ 5-10 мкм / ч. Аналогичным образом, если в любом последующем эксперименте, включающем сравнение дикого типа и мутанта, эти основные параметры не удовлетворяются клетками дикого типа, эксперимент, возможно, потребуется исключить из анализа. Например, клеткам MEPM дикого типа потребуется 36-40 ч, чтобы полностью закрыть рану с помощью 2-х скважинных силиконовых вставок. Если в эксперименте клеткам дикого типа потребуется значительно больше 40 ч, чтобы закрыть рану, весь эксперимент будет подозрительным. Плохая производительность клеток MEPM может быть вызвана 1) плохим качеством замороженной аликвоты, 2) плохим оживлением или 3) чрезмерной дифференцировки. Дифференцированные или стареющие клетки могут быть обнаружены визуально, поскольку они растут очень большими и не делятся. Культуры с большим количеством таких клеток следует избегать. В общем, в поле зрения 10-кратного объектива не должно быть аномальных клеток(рисунок 3); или две клетки вне поля зрения не должны существенно влиять на анализ. Ограничение анализа только двумя клеточными проходами (выше) значительно помогает поддерживать качество клеток MEPM.

Как для 2D-культуры, так и для анализов восстановления ран с использованием первичных клеток MEPM ключевым требованием для успеха была высокая начальная плотность клеток. Это требование было впервые определено при оптимизации ранеоремонтного анализа, в котором клеткибыли засеяны при >1400 клеток/мм2. Плотность клеток, мигрирующих в рану, затем использовалась в качестве плотности посева в анализах 2D-культуры. Плотность посева ~ 300 клеток / мм2 сформировала клеточные потоки, в то же время позволяя автоматически анализировать траектории клеток. Плотность выше 300 клеток /мм2, как правило, образует более яркие потоки, которые могут быть визуализированы глазом, но затрудняют отслеживание отдельных клеток. При сравнении первичных клеток MEPM из эмбрионов дикого типа и мутантных эмбрионов, хотя задержка закрытия раны может быть оценена без вычислительного анализа, различия в образовании потока и направленности могут быть не различимы глазом. Если плотность ячеек слишком высока или качество изображения плохое / размытое, например, из-за потери фокуса, автоматическое отслеживание клеток может быть затруднено. В таком случае можно использовать ручное отслеживание клеток для определения траекторий клеток в анализах восстановления ран с использованием ImageJ. Очень низкая концентрация ядерного пятна Hoechst (3 мкл/мл раствора 20 мМ в культуральная среда MEPM) также может быть использована для облегчения отслеживания клеток; однако флуоресцентная лазерная токсичность может быть проблемой при длительном использовании.

Для ручного отслеживания было легче отслеживать клетки в обратном направлении от конца закрытия раны назад, насколько это возможно, пока высокая плотность клеток не заслонит дальнейшее отслеживание. Даже частичные траектории клеток, в сочетании с клеточной популяцией, были информативными. В отличие от анализов восстановления ран, автоматизированное отслеживание клеток требуется для 2D-анализа клеточной культуры, что является одной из причин, по которой были выбраны промежуточные плотности клеток. Наконец, чувствительные первичные анализы на основе MEPM могут быть использованы для выявления соединений и путей, которые могут повлиять на повышение неба. Предыдущие исследования показали, что активация пути PI3K-AKT улучшила как скорость клеток, так и направленность мутантных клеток MePM Specc1l 21. В других исследованиях MEPM также использовались различные факторы роста или медикаментозное лечение для стимуляции нисходящих сигнальных каскадов или для оценки пролиферации22, 29,30,44,45. Таким образом, анализ на основе MEPM предлагает быстрый метод выявления многих других положительных или отрицательных регуляторных факторов, которые затем могут быть проверены in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Этот проект был частично поддержан грантами Национальных институтов здравоохранения DE026172 (I.S.) и GM102801 (A.C.). I.S. также частично поддерживался грантом Центра передовых биомедицинских исследований (COBRE) (Национальный институт общих медицинских наук P20 GM104936), грантом Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (Национальный институт общих медицинских наук P20 GM103418) и грантом Канзасского исследовательского центра интеллектуальных нарушений и нарушений развития (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

Биология развития Выпуск 168 Палатогенез Расщелина неба Повышение неба Первичные мезенхимальные клетки Миграция клеток Восстановление ран Покадровая визуализация Формирование клеточного потока Коллективное движение клеток Скоординированная подвижность клеток
Изоляция и покадровая визуализация первичных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши для анализа коллективных атрибутов движения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter