Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo per l'imaging time-lapse di test di crescita bidimensionale (2D) e di riparazione delle ferite. Forniamo anche la metodologia per l'analisi dei dati di imaging time-lapse per determinare la formazione del flusso cellulare e la motilità direzionale.

Abstract

Lo sviluppo del palato è un processo dinamico, che comporta la crescita verticale di ripiani palatali bilaterali accanto alla lingua seguita da elevazione e fusione sopra la lingua. I difetti in questo processo portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune. Recenti studi hanno dimostrato che l'elevazione della mensola palatale comporta un processo di rimodellamento che trasforma l'orientamento della mensola da uno verticale a uno orizzontale. Il ruolo delle cellule mesenchimali della mensola palatale in questo rimodellamento dinamico è stato difficile da studiare. L'analisi quantitativa basata sull'imaging time-lapse è stata recentemente utilizzata per dimostrare che le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo (MEPM) possono auto-organizzarsi in un movimento collettivo. Le analisi quantitative potrebbero identificare differenze nelle cellule MEPM mutanti da un modello murino con difetti di elevazione del palato. Questo documento descrive i metodi per isolare e colturare cellule MEPM da embrioni E13.5, in particolare per l'imaging time-lapse, e per determinare vari attributi cellulari del movimento collettivo, comprese le misure per la formazione del flusso, l'allineamento della forma e la persistenza della direzione. Ipotizza che le cellule MEPM possano servire come modello proxy per studiare il ruolo del mesenchima della mensola palatale durante il processo dinamico di elevazione. Questi metodi quantitativi consentiranno ai ricercatori nel campo craniofacciale di valutare e confrontare gli attributi di movimento collettivo nelle cellule di controllo e mutanti, il che aumenterà la comprensione del rimodellamento mesenchimale durante l'elevazione della mensola palatale. Inoltre, le cellule MEPM forniscono un raro modello cellulare mesenchimale per lo studio del movimento cellulare collettivo in generale.

Introduction

Lo sviluppo del palato è stato ampiamente studiato in quanto i difetti della palatogenesi portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune che si verifica in casi isolati o come parte di centinaia di sindromi1,2. Lo sviluppo del palato embrionale è un processo dinamico che coinvolge il movimento e la fusione del tessuto embrionale. Questo processo può essere suddiviso in quattro fasi principali: 1) induzione di ripiani palatali, 2) crescita verticale dei ripiani palatali accanto alla lingua, 3) elevazione dei ripiani palatali sopra la lingua e 4) fusione dei ripiani palatali alla linea mediana1,3,4. Negli ultimi decenni, sono stati identificati molti mutanti di topo che manifestano palatoschisi5,6,7,8. La caratterizzazione di questi modelli ha indicato difetti nelle fasi di induzione, proliferazione e fusione della mensola palatale; tuttavia, i difetti di elevazione della mensola palatale sono stati rari. Pertanto, comprendere le dinamiche dell'elevazione della mensola palatale è un'area di ricerca intrigante.

Un'attenta analisi di alcuni mutanti di topo con difetti di elevazione della mensola palatale ha portato al modello attuale che mostra che la regione molto anteriore della mensola palatale sembra capovolgersi, mentre un movimento da verticale a orizzontale o "rimodellamento" dei ripiani palatali si verifica nelle regioni medio-posteriori del palato1,3,4, 9,10,11. L'epitelio del bordo mediale della mensola palatale probabilmente avvia la segnalazione necessaria per questo rimodellamento, che viene quindi guidato dal mesenchima della mensola palatale. Recentemente, molti ricercatori hanno identificato il ritardo di elevazione della mensola palatale in modelli murini che hanno mostrato aderenze orali transitorie che coinvolgono scaffali palatali12,13. Il rimodellamento mesenchimale comporta la riorganizzazione delle cellule per creare un rigonfiamento in direzione orizzontale, mentre contemporaneamente ritrae la mensola palatale nella direzione verticale9,10,14. Tra i diversi meccanismi proposti per influenzare l'elevazione della mensola palatale e il rimodellamento mesenchimale sottostante ci sono la proliferazione cellulare15,16,17,i gradienti chemiotattici18e i componenti della matrice extracellulare19,20. È sorta una domanda importante: il ritardo di elevazione della mensola palatale osservato nei topi carenti di Specc1lè anche in parte dovuto a un difetto nel rimodellamento della mensola palatale, e questo difetto di rimodellamento potrebbe manifestarsi in un difetto intrinseco nel comportamento delle cellule MEPM primarie21?

Le cellule MEPM primarie sono state utilizzate in campo craniofacciale per molti studi che coinvolgono l'espressione genica22, 23,24,25, 26,27,28,29e alcuni che coinvolgono la proliferazione30,31 e la migrazione25,31,32 , ma nessuno per l'analisi collettiva del comportamento cellulare. L'imaging time-lapse delle cellule MEPM è stato eseguito in coltura 2D e saggi di riparazione delle ferite per dimostrare che le cellule MEPM mostravano movimento direzionale e formavano flussi cellulari dipendenti dalla densità-attributi del movimento collettivo21. Inoltre, le cellule mutanti Specc1l hanno formato flussi cellulari più stretti e hanno mostrato traiettorie di migrazione cellulare altamente variabili. Si ritiene che questa mancanza di motilità coordinata contribuisca al ritardo dell'elevazione del palato negli embrioni mutanti Specc1l 13,21. Pertanto, questi saggi relativamente semplici che utilizzano cellule MEPM primarie possono servire come proxy per studiare il rimodellamento mesenchimale durante l'elevazione della piattaforma palatale. Questo documento descrive l'isolamento e la coltura delle cellule MEPM primarie, nonché l'imaging e l'analisi time-lapse, per i test 2D e di riparazione delle ferite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati condotti con un protocollo approvato dal KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, in conformità con le loro linee guida e regolamenti (numero di protocollo: 2018-2447).

1. Raccogli embrioni E13.5

  1. Eutanasia di topi femmina gravide utilizzando una camera di inalazione di CO2 o con una procedura approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Procedere immediatamente alla dissezione.
  2. Esporre la metà inferiore della cavità addominale rimuovendo la pelle e il peritoneo. Asporta entrambe le corna dell'utero, che contengono gli embrioni E13.5.
  3. Posizionare brevemente l'utero in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) prebellica a 37 °C per risciacquare il sangue, i capelli o altri detriti in eccesso. Metti l'utero in un piatto sterile di 10 cm pieno di PBS sterile.
  4. Usando piccole forbici, taglia la parete uterina lungo la lunghezza dell'utero per esporre ogni embrione, ancora nel suo sacco vitellino. Rimuovere il sacco vitellino che circonda l'embrione, ma salvarlo per la genotipizzazione, se necessario. Quando gli embrioni vengono rimossi, posizionare ogni embrione nel proprio pozzo di una piastra a 12 pozzetti piena di PBS.

2. Dissezione di scaffali palatali da embrioni (Figura 1)

NOTA: Sterilizzare gli strumenti di dissezione in acciaio inossidabile (vedi tabella dei materiali)dopo aver elaborato ogni embrione posizionando gli strumenti prima in un becher di alcol etilico al 100% (EtOH), poi in uno sterilizzatore per strumenti a 350 °C per 10 s, e quindi raffreddandoli in un secondo becher di 100% EtOH.

  1. Utilizzando un cucchiaio perforato sterilizzato, posizionare l'embrione in un nuovo piatto di 10 cm riempito con terreno di coltura MEPM costituito dal mezzo minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), L-glutammina (4 mM L-Glu) e gli antibiotici-penicillina e streptomicina (50 unità / ml).
  2. Decapitare l'embrione proprio sotto la linea della mascella usando forbici sterili (Figura 1A, linea tratteggiata rossa). Rimuovere la mascella inferiore inserendo un punto della pinzed fine #5 sterilizzata in bocca, mantenendolo appena all'interno della guancia. Spingere la punta della pinzaccia inserita attraverso fino a quando non esce dalla parte posteriore del cranio.
  3. Orientare la pinzpa, lungo la linea gialla in Figura 1B, in modo che l'altro lato della pinca (che è ancora al di fuori dell'embrione) sia in bilico appena sopra il condotto uditivo, quindi pizzicare la pinzcola chiusa per tagliare il tessuto. Se necessario, eseguire un'altra pinca fine lungo la cucitura della pinca ora chiusa per tagliare qualsiasi tessuto che non è stato completamente reciso dal pizzico.
  4. Ripeti il passaggio precedente per l'altro lato della testa dell'embrione. Continuare la procedura di taglio a pizzico per rimuovere completamente la mascella inferiore, la lingua e la parte inferiore del cranio ed esporre i ripiani palatali.
  5. Rimuovere il cranio del cranio tagliando appena sopra gli occhi, come mostrato nella Figura 1C (linea verde). Fallo posizionando la testa sul lato sinistro o destro e posizionando i punti delle piccole forbici in acciaio inossidabile davanti e dietro il cranio appena sopra il livello degli occhi dell'embrione. Taglia la parte superiore del cranio con un rapido taglio delle forbici, creando una superficie piana che sarà importante per la stabilità nei passaggi successivi e che dovrebbe assomigliare alla Figura 1D se vista di lato.
  6. Posizionare la parte rimanente della testa a testa in giù, con l'aspetto superiore della testa (cranio rimosso) appoggiato sul fondo del piatto, che fornirà una superficie stabile per la rimozione della mensola palatale. Prenditi un momento per identificare i ripiani palatali, che ora sono esposti e rivolti verso l'alto e appariranno come due creste rialzate su entrambi i lati di una scanalatura centrale nella metà anteriore della testa (Figura 1E).
  7. Fissare la parte rimanente della testa al piatto per immobilizzarlo mentre i ripiani vengono rimossi. Fallo inserendo un punto di una pinna fine attraverso il tessuto vicino alla regione nasale della testa, anteriore ai ripiani palatali, e inserisci l'altro punto della pinna attraverso la base del cranio, posteriore ai ripiani palatali. Tenerli in posizione durante l'esecuzione dell'escissione degli scaffali palatali.
    1. Immobilizzando la testa con una mano, scegliere uno qualsiasi dei due ripiani da rimuovere per primi e inserire entrambi i punti di una seconda coppia di pinna fine nel tessuto alla base della superficie laterale del ripiano e pizzicare per tagliare il tessuto (Figura 1F). Ripeti questo lungo la base della superficie mediale del ripiano e poi alle estremità anteriore e posteriore del ripiano per staccarti dalla testa.
  8. Sollevare delicatamente lo scaffale, facendo pizzichi aggiuntivi, se necessario, per liberare completamente il ripiano dal tessuto circostante.
  9. Ripetere i due passaggi precedenti per rimuovere il secondo ripiano palatale.
  10. Con i ripiani palatali ora liberati dal tessuto circostante e collocati in PBS (Figura G), utilizzare una pipetta di trasferimento a bulbo di plastica sterile per disegnare i ripiani nella pipetta e trasferirli in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml insieme a circa 500 μL di PBS. Tenere i tubi contenenti ripiani palatali sul ghiaccio mentre il resto della lettiera viene elaborato nello stesso modo.
    NOTA: In alternativa, i ripiani possono essere collocati in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente tripsina preriscalata (0,25%) immediatamente dopo la dissezione (invece di metterli sul ghiaccio). I campioni saranno più freschi, ma bisogna fare attenzione a cronomestrare tutte le fasi del procedimento per ogni singolo campione invece di trattare i campioni collettivamente.

3. Coltura di cellule MEPM

NOTA: Nelle condizioni qui descritte, le cellule epiteliali del palato non sopravvivono al primo passaggio, risultando in una coltura cellulare mesenchimale del palato puro. Utilizzare la tecnica sterile per eseguire tutte le fasi in un cappuccio di coltura tissutale.

  1. Aspirare e scartare il PBS dal tubo da 1,5 ml, facendo attenzione a non scartare i ripiani nel processo. Aggiungere immediatamente 200 μL di tripsina preriscalata (37 °C) (0,25%) a ciascun tubo che contiene ripiani palatali. Pipettare brevemente i ripiani su e giù nella tripsina usando una punta della pipetta da 1000 μL per accelerare la tripsinizzazione.
  2. Incubare le provette per 5 minuti a 37 °C, quindi pipettare ogni campione su e giù di nuovo per aiutare a rompere il tessuto. Incubare i tubi per altri 5 minuti a 37 °C e pipettare su e giù ancora una volta per completare la dissociazione del tessuto.
    NOTA: I ripiani devono essere completamente o quasi completamente dissociati e sospesi nella tripsina senza che rimangano pezzi visibili di tessuto.
  3. Aggiungere 800 μL di terreno di coltura MEPM (fase 2.1) a ciascun tubo da 1,5 ml. Centrifugare il tubo da 1,5 ml a 200 × g per 5 minuti per pellettizzare le celle. Rimuovere il surnatante e risuspenare il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura MEPM.
  4. Placcare le cellule MEPM in una piastra trattata con coltura tissutale a 6 pozzetti contenente terreno di coltura MEPM. Lasciare che le celle aderiscano alla superficie plastica per 12 ore a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2.
    NOTA: Dopo l'incubazione notturna, la stragrande maggioranza (~ 90%) delle cellule si attaccherà. A questo punto, le cellule aderenti appariranno abbastanza omogenee, con una forma triangolare o leggermente allungata.
  5. Cambiare il mezzo ogni giorno aspirando delicatamente il vecchio mezzo e sostituendolo immediatamente con 1 mL di PBS sterile caldo senza calcio o magnesio per ~ 1 min. Aspirare il PBS e sostituirlo con 3 ml di terreno di coltura MEPM prebellico.
  6. Passare le cellule una volta che diventano confluenti al 100%.
    NOTA: le cellule MEPM dovrebbero proliferare raddoppiando il numero quasi ogni giorno.
    1. Per passare le cellule, aspirare delicatamente il vecchio mezzo e sostituirlo immediatamente con PBS caldo senza calcio o magnesio per ~ 1 minuto. Aspirare il PBS e sostituirlo con 0,5 ml di tripsina allo 0,25% preriscalata.
    2. Incubare a 37 °C per ~ 5 minuti, o fino a quando le cellule si staccano dalla superficie del piatto quando delicatamente oscillate avanti e indietro a mano. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere immediatamente 5 ml di terreno di coltura MEPM preriscaldato alle cellule tripsinizzate.
    3. Utilizzando un pipetto sierologico da 10 mL, raccogliere delicatamente le cellule in un tubo conico da 15 mL e centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti per pellettare le celle. Aspirare la tripsina e il mezzo e risospezionare le cellule in 3 ml di terreno di coltura MEPM prebellico. Pipettare delicatamente 1 mL di cellule in un singolo pozzetto di un piatto a 6 pozzetto e aggiungere 2 mL di terreno di coltura MEPM per portare il volume totale a 3 mL.
      NOTA: questo costituisce una divisione 1:3 delle celle. I MEPM possono essere sostituiti fino a tre volte. La densità di semina dei MEPM è alquanto flessibile e il numero di cellule presenti varia a seconda del recipiente di coltivazione. Tuttavia, i MEPM non proliferano correttamente quando sono divisi troppo scarsamente e dovrebbero essere confluenti almeno al 20-25% nel loro nuovo piatto una volta aderiti.

4. Crioconservazione delle cellule MEPM

  1. Una volta che le cellule MEPM tripsinizzate sono state pellettate, risuscievole le cellule nel terreno di coltura MEPM per ottenere una concentrazione di ~ 1 × 106 cellule / ml. Pipettare le cellule in crioviali e aggiungere una concentrazione finale del 5% di dimetilsolfossido nel ceppo cellulare. Chiudere il crioviale, mescolare brevemente invertendo e posizionare immediatamente i flaconcini in un contenitore di congelamento che si raffredda ad una velocità di 1 °C/min.
  2. Posizionare il refrigeratore in un congelatore a -80 °C durante la notte. Il giorno successivo, spostare i crioviali in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  3. Scongelamento delle cellule MEPM crioconservate
    1. Rimuovere i crioviali dal serbatoio dell'azoto liquido e scongelare a temperatura ambiente fino a quando il contenuto inizia a diventare liquido. Svuotare il contenuto in un tubo conico da 15 ml contenente 9 mL di terreno di coltura MEPM preriscaldato.
    2. Centrifugare il tubo a 200 × g per pellettare le celle. Risuspenare le cellule in 1 mL di terreno di coltura MEPM e convogliare le cellule in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura MEPM caldo per portare il volume totale a 3 ml.
    3. Colturare le cellule a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2. Cambia il mezzo ogni giorno.

5. Live-imaging di cellule MEPM - Saggio di migrazione collettiva 2D (Figura 2)

  1. Preparare una piastra da utilizzare per l'imaging dal vivo.
    1. Utilizzare piccole forbici chirurgiche o un bisturi affilato per accorciare un inserto sterile in silicone a 2 pozzetti ad un'altezza di ~ 1 mm. Preparare un inserto per ogni campione utilizzato.
    2. Usando la pinica, posizionare l'inserto in silicone a 2 pozzetti accorciato al centro di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Premere verso il basso lungo tutti i bordi per assicurarsi che sia completamente aderente.
  2. Scongelare le cellule crioconservate seguendo i passaggi descritti al paragrafo 4.3 di questo protocollo. Contare le cellule MEPM e seminare 300 celle/mm2 degli inserti in silicone accorciati in un volume totale di 40-50 μL di terreno di coltura MEPM per pozzetto. Coltura le cellule durante la notte a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2.
  3. Il giorno successivo, preparati per l'imaging time-lapse dal vivo.
    1. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con un incubatore sul palco e capacità di imaging automatico. Aggiungere acqua al serbatoio dell'incubatore sul palco per ridurre l'evaporazione del terreno di coltura; impostare la temperatura a 37 °C e CO2 al 5%. Lasciare ~ 30 minuti affinché l'umidità si accumuli prima di posizionare il piatto a 6 pozzedi nell'incubatrice sul palco.
  4. Utilizzare impostazioni equivalenti alle seguenti per l'imaging time-lapse.
    1. Selezionare l'obiettivo 4x per avere ampi campi di visualizzazione e filtro di contrasto di fase.
      NOTA: la messa a fuoco automatica, il campione di ricerca automatica, lo z-stack e l'illuminazione automatica di solito non sono necessari.
    2. Selezionare due campi microscopici per pozzo per catturare il lume degli inserti in silicone accorciati. Assicurarsi che tutte le posizioni di imaging abbiano la messa a fuoco corretta.
      NOTA: i piani immagine possono essere regolati durante l'imaging, ma tale regolazione di solito non è necessaria.
    3. Selezionare il tipo di file di output dell'immagine desiderato, quindi selezionare o deselezionare le opzioni di post-imaging, come la creazione automatica di video e filigrane, come desiderato. Se applicabile, selezionare il contrasto di fase come modalità di imaging.
      NOTA: l'utilizzo di filigrane può impedire le successive fasi di elaborazione delle immagini.
    4. Impostare la durata della registrazione su 72 h. Imposta il programma per catturare immagini ogni 10 minuti.
      NOTA: di solito sono necessarie solo 48 ore di imaging, ma l'imaging può essere interrotto in qualsiasi momento prima del segno di 72 h senza perdere le immagini che sono già state scattate.
    5. Assicurarsi che la camera ambientale sia operativa come richiesto al 5.3.1. Salvare queste impostazioni(la routine)e iniziare l'imaging.
  5. Continuare l'imaging fino a 72 ore (o il tempo specificato).

6. Live-imaging di cellule MEPM in un test di riparazione della ferita (Figura 3)

  1. Preparare una piastra da utilizzare per l'imaging dal vivo. Usando una pinica, posizionare un inserto sterile in silicone a 2 pozzetti al centro di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e premere verso il basso lungo tutti i bordi per assicurarsi che sia completamente aderente. Preparare un inserto a 2 fori per ogni campione utilizzato.
  2. Scongelare le cellule crioconservate seguendo i passaggi descritti al paragrafo 4.3 di questo protocollo. Contare le cellule MEPM e, se necessario, concentrare le cellule ad almeno 350 cellule/μL.
  3. Semina 1400 cellule/mm2 negli inserti in silicone in un volume di 100 μL di terreno di coltura MEPM per pozzetto. Colturare le cellule per 48 ore a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2e cambiare il mezzo ogni giorno.
  4. Dopo 48 ore preparare un microscopio per l'imaging time-lapse dal vivo come descritto nei sezioni 5.3 e 5.4. Immediatamente prima di posizionare le cellule nell'incubatore sul palco, aggiungere 3 ml di terreno di coltura MEPM preriscaldato al pozzo (ma all'esterno degli inserti), quindi rimuovere con cura gli inserti in silicone.
    NOTA: La parete che separa le 2 camere lascia uno spazio che è la "ferita".
  5. Avviare l'imaging time-lapse come descritto al punto 5.4, con le seguenti differenze:
    1. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento più elevato (ad esempio, 10x). Per acquisire la chiusura della ferita, selezionare 5 campi di vista lungo ogni ferita, in modo che la ferita sia parallela all'asse verticale dell'immagine.
  6. Interrompere l'imaging dopo 72 ore o quando le ferite sono completamente chiuse.

7. Analisi computazionale di sequenze di immagini time-lapse

NOTA: eseguire le procedure seguenti su un computer dotato di strumenti di calcolo standard, ad esempio l'interprete python, il compilatore C e una shell (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Analisi della confluenza
    NOTA: Questa procedura può essere utilizzata per stimare la proliferazione cellulare all'interno di una coltura sparsa o per quantificare esperimenti di chiusura della ferita. Per rilevare le aree occupate dalle celle, viene applicata una soglia di segmentazione alla deviazione standard locale della luminosità dell'immagine. Il codice è stato descritto in precedenza da Wu et al.33 e Neufeld et al.34 ed è disponibile presso http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Determinare la soglia di segmentazione per le immagini. Ad esempio, per visualizzare la segmentazione con una soglia 4, eseguire il comando
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
      e quindi controllare l'output (output.jpg).
      NOTA: se la soglia è troppo bassa, le aree di sfondo nella micrografia vengono classificate come coperte da celle. Al contrario, se la soglia è troppo alta, le aree coperte da celle non sono classificate come tali. Il valore di soglia ottimale mantiene entrambi gli errori al minimo.
    2. Utilizzare lo script di area.sh fornito per calcolare i valori di confluenza per una sequenza di immagini come
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > confluenza.dat
      Nota : il valore della soglia di discriminazione 4 viene verificato nel passaggio 1 e i risultati vengono memorizzati nella confluenzadel file.dat . Ordinando le immagini in cartelle appropriate, l'elenco dei nomi dei file di immagine può essere sostituito dalla notazione con caratteri jolly:
      area.sh -S4 *.jpg > confluenza.dat
    3. Per gli esperimenti di chiusura della ferita, trasformare i dati di confluenza A(t)-la dimensione dell'area coperta da cellule espressa in percentuale in funzione del tempo-in velocità di propagazione del bordo della ferita V come
      Equation 1
      dove w denota la larghezza del campo e dA/dt è la derivata temporale di A(t), cioè il tasso di espansione dell'area coperta dalla cella.
  2. Mappa della motilità cellulare
    1. Eseguire un algoritmo di velocimetria dell'immagine delle particelle (PIV) per caratterizzare la motilità cellulare ed estrarre l'estensione del "flusso ottico" di movimento locale tra le coppie di immagini, ma non per identificare le singole cellule.
      NOTA: Qui, viene utilizzata una dimensione iniziale della finestra di 50 μm, come descritto in dettaglio da Zamir et al.35 e Czirok et al.36, con una dimensione iniziale della finestra di 50 μm. L'analisi PIV produce un campo di velocità v(x,t) per ogni fotogramma dell'immagine t e posizione (all'interno dell'immagine) x.
    2. Estrarre la velocità media della motilità cellulare da v(x,t) come media spaziale calcolata sull'area occupata dalla cellula, come determinato nel paragrafo 7.1.
  3. Tracciamento manuale delle cellule
    NOTA: mentre l'analisi PIV fornisce una valutazione automatica della motilità cellulare, concentrarsi sul comportamento delle singole cellule richiede spesso il tracciamento manuale. Sebbene diversi strumenti forniscano questa funzionalità, è molto utile se i marcatori posizionati manualmente possono essere modificati dopo il loro posizionamento iniziale e se il tracciamento può essere eseguito sia in avanti che indietro nel tempo.
    1. Esegui il tracciamento delle celle con uno strumento python sviluppato su misura (http://github.com/donnagreta/cm_track), che fornisce anche funzioni di base dell'editor come l'eliminazione dei segmenti di traiettoria.
      NOTA: questo strumento di rilevamento manuale produce le posizioni P(i,t) della cella i al tempo t in un file di testo e viene richiamato come
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      dove le immagini time-lapse si trovano nella cartella images/ e i dati di posizione vengono raccolti nella traccia del file.dat (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Analisi delle traiettorie delle singole cellule. (A) Le micrografie time-lapse a contrasto di fase sono sottoposte a (B, C) una procedura di tracciamento manuale, che contrassegna le celle (punti verdi). (D) Le posizioni delle celle (x,y) sono memorizzate per ogni cella distinta dal suo ID e per ogni fotogramma f. (E) Le traiettorie possono essere sovrapposte alle micrografie e codificate a colori per indicare informazioni temporali. Ad esempio, in ogni traiettoria, una tavolozza di colori da blu a rosso indica progressivamente i segmenti di traiettoria successivi, con il rosso e il blu che contrassegnano rispettivamente la posizione iniziale e quella finale della cella. (F) Varie proprietà statistiche delle traiettorie, come lo spostamento quadrato medio, possono essere estratte e utilizzate per caratterizzare la motilità di varie popolazioni cellulari, che in questo esempio includono cellule MEPM wildtype (wt, blu) e knockdown (kd, rosso). Le barre di scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Sovrapporre traiettorie sulle immagini utilizzando un secondo strumento, richiamato come
    visdat.py traccia -d.dat -i immagini/ -o sovrapposizione/ -l999 -r3 -C2
  2. Raccogliete le immagini con le traiettorie sovrapposte nella sovrapposizione della cartella.
    NOTA: in questo esempio, i dati sulla posizione della cella vengono memorizzati nella traccia del file.dat, mentre la sequenza di immagini time-lapse si trova all'interno delle immagini della cartella. Il resto dei parametri controlla la lunghezza massima delle traiettorie disegnate (-l), la dimensione dei simboli (-r) e la combinazione di colori (-C) utilizzata.
  1. Analisi delle traiettorie delle singole cellule
    1. Caratterizzare le traiettorie in modo dalla lunghezza totale del tracciato
      Equation 2,
      e spostamento netto verso la ferita
      Equation 3,
      dove X denota la proiezione di P nella direzione perpendicolare alla ferita: la coordinata x delle posizioni quando la ferita è parallela all'asse y.
    2. Calcolare l'efficienza di guida Equation 4 come per ogni cella i e punto temporale t37. Caratterizzare le colture in base alla media di popolazione di queste misure a singola cellula, valutate in un punto temporale adatto t.
  2. Movimento di flusso collettivo delle cellule
    1. Caratterizzare le correlazioni spaziali locali dei movimenti cellulari dalla velocità media di altre cellule che si trovano nelle vicinanze di una cellula in movimento, come descritto in precedenza38,39.
      NOTA: il codice computazionale è disponibile all'https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Allineare un sistema di riferimento con le direzioni anteriore, posteriore, sinistra e destra a ciascun vettore v(x,t) (Figura 5A). Assegnare ciascuna delle celle circostanti o del vettore di velocità PIV alla cella spaziale appropriata del sistema di riferimento (Figura 5B). Ripetere la procedura in quanto ogni vettore funge da origine dei sistemi di riferimento (Figura 5C,D) in modo che un dato vettore velocità sia assegnato a più bin.
        NOTA: un punto dati potrebbe trovarsi davanti a un vettore e a sinistra di un altro.
      2. Ruotare i sistemi di riferimento in un orientamento comune (Figura 5C, F) e metterli in comune ( Figura5G).
        NOTA: La media di ogni bin dei dati di velocità raggruppati è un vettore di velocità (U) che è indicativo di correlazione spaziale: la media è una misura di una componente di velocità condivisa (Figura 5H).
      3. Adatta i campi di flusso U(x) con una funzione esponenziale Equation 5 , dove a, x0 e U0 sono parametri di adattamento. Dei tre parametri di adattamento, concentrati su x0, la lunghezza di correlazione (Figura 5I, J), che è la distanza caratteristica in cui scompaiono le correlazioni velocità-velocità locale.

Figure 5
Figura 5: Caratterizzazione della formazione di flussi di cellule in coltura. (A,D) Le immagini time-lapse a contrasto di fase della Figura 4A sono utilizzate per identificare i movimenti cellulari. Per ogni cella in movimento, un sistema di riferimento (blu) e contenitori spaziali (bianco) sono stati co-allineati per classificare le celle adiacenti come se fossero nella parte anteriore, posteriore, sinistra o destra. (B,E) La velocità delle celle adiacenti (vettori neri) era correlata allo stesso sistema di riferimento (C,F). Questa procedura è stata ripetuta per ogni cella e punto temporale. (G) Dopo aver raggruppato queste informazioni locali, ogni bin conterrà più vettori di velocità (grigio), che possono essere mediati per determinare la velocità media co-mobile (frecce magenta) in varie posizioni rispetto a una cellula mobile media. (H) La mappa della velocità media caratterizza quindi le velocità tipiche delle cellule in varie posizioni rispetto a una cella in movimento. (I,J) Infine, questo campo è stato campionato lungo l'asse anteriore-posteriore (parallelo) e anche lungo l'asse sinistra-destra (perpendicolare). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La dissezione degli scaffali palatali è illustrata nella Figura 1. La sequenza di incisioni è progettata per ridurre al minimo lo slittamento del tessuto. Dopo la rimozione della testa (Figura 1A,B), la mascella inferiore viene rimossa (Figura 1B,C). L'incisione della parte superiore della testa (Figura 1C, D) viene eseguita per stabilizzare il tessuto quando viene posizionato a testa in giù ( Figura1E) per visualizzare (Figura 1E, linee tratteggiate), pizzicare (Figura 1F) e asportare (Figura 1G) i ripiani palatali.

La coppia di ripiani palatali asportati da un singolo embrione viene tripsinata e coltivata in un piatto da 35 mm o in un pozzo di un piatto a 6 pozzene. I piatti più grandi non sono preferiti in quanto la densità cellulare è troppo bassa per una crescita ottimale. Alla confluenza, le cellule di ciascun pozzo vengono tripsinite e passaggiate in tre pozzi equivalenti a 35 mm (passaggio n. 1). Le cellule confluenti del passaggio #1 possono quindi essere congelate in aliquote di 1 × 106 cellule / mL. Le aliquote congelate vengono successivamente allevate in un piatto equivalente a 35 mm e coltivate fino alla confluenza. Le cellule vengono quindi tripsinizzate (passaggio #2) e seminate secondo l'esperimento. La creazione e l'utilizzo di aliquote congelate ha contribuito a normalizzare le condizioni, specialmente per quanto riguarda la densità cellulare. L'uso di cellule MEPM fresche ha portato a una maggiore variabilità nella densità cellulare finale negli esperimenti, che si ritiene sia dovuta a una proporzione variabile di cellule vitali o sub-vitali in colture fresche. Inoltre, il numero di passaggi cellulari MEPM era strettamente limitato a due (elencati sopra) per questi esperimenti.

Considerando che a) la densità cellulare era critica, b) le cellule MEPM di un singolo embrione erano limitate e c) l'ottica di imaging era migliore in un piatto grande, sono stati utilizzati inserti in silicone a 2 pozzetti (Figura 2 e Figura 3). Per i saggi di riparazione delle ferite, le cellule MEPM sono state coltivate negli inserti in silicone a 2 pozzetti fino all'elevata confluenza, quindi gli inserti sono stati rimossi e la ferita è stata ettata fino alla chiusura (Figura 3). Tuttavia, per la coltura 2D, le cellule MEPM avevano bisogno di imaging man mano che crescevano, quindi gli inserti in silicone a 2 pozzetti sono stati semplicemente tagliati a 1/3 della loro altezza per consentire immagini chiare (Figura 2C). Piccoli anelli stampati in 3D40 in 35 mm sono stati utilizzati anche per l'analisi della motilità 2D (Figura 2D).

Le traiettorie MEPM (Figura 4E) sono persistenti: la direzione della motilità cellulare viene mantenuta per diverse ore. L'analisi dello spostamento medio rispetto al tempo (Figura 4F) indica che la persistenza sotto forma di spostamento è proporzionale al tempo trascorso. La velocità tipica delle cellule MEPM sulla superficie plastica della coltura tissutale, 10 μm/h, può essere utilizzata anche per il controllo di qualità della coltura cellulare. L'analisi del flusso dei dati di motilità rivela che i cluster co-mobili di cellule MEPM hanno una dimensione di ~ 300 μm (Figura 5I, J). I risultati rappresentativi indicano anche una profonda differenza di motilità tra cellule MEPM wild-type e mutanti. Oltre al confronto tra wildtype e mutanti, sia i test 2D che i test di riparazione delle ferite possono essere combinati con vari trattamenti biochimici. Ad esempio, gli attivatori di percorso PI3K-AKT sono stati utilizzati con le cellule MEPM, come descritto in precedenza 21.

Figure 1
Figura 1: Dissezione di ripiani palatali embrionali per isolare le cellule mesenchimali. (A) Una testa embrionale di topo E13.5 viene rimossa tagliando lungo il collo (linea rossa). (B) Successivamente, la mascella inferiore e la lingua vengono rimosse con incisioni lungo la cavità orale, tra la mascella superiore e inferiore (linea gialla). (C) Per stabilizzare il tessuto per la rimozione del ripiano palatale, la parte superiore della testa viene asportata (linea verde). (D) La regione della mascella superiore sezionata risultante viene posizionata (E) capovolta per visualizzare i ripiani palatali (linee tratteggiate nere). (F) L'escissione dei singoli ripiani palatali è raffigurata schematicamente, dove i singoli ripiani sporgenti (giallo) sono pizzicati dalla mascella (blu). (G) Coppia di ripiani palatali asportati da un singolo embrione, che può quindi essere tripsinato e coltivato in un piatto da 35 mm o in un piatto a 6 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione sperimentale di colture cellulari MEPM 2D. (A) Scongelare un'aliquota congelata di cellule MEPM e (B) colturare le cellule in un piatto da 35 mm o in una piastra a 6 pozzetti. Quando confluenti, tripsinizzare le cellule e seminarle come descritto nel protocollo in un piatto da 35 mm con (C) inserti in silicone a 2 pozzetti che sono stati tagliati o (D) con anelli stampati in 3D. Un piccolo spazio di coltura riduce al minimo la necessità di un gran numero di celle MEPM. Il basso profilo degli inserti in silicone tagliati o degli anelli stampati in 3D consente l'imaging diretto senza effetto alone. L'imaging time-lapse può continuare fino a raggiungere la densità cellulare desiderata, che può arrivare fino a 72 ore. Le immagini rappresentative sono mostrate a (E) 0 h, (F) 24 h e (G) 45 h timepoints. Le immagini sono state scattate utilizzando un obiettivo 4x. Le barre di scala per E, F, G = 300 μm. Abbreviazioni: 2D = bidimensionale; MEPM = mesenchima palatale embrionale di topo; 3D = tridimensionale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Configurazione sperimentale del test di chiusura della ferita utilizzando cellule MEPM. (A) Scongelare un'aliquota congelata di cellule MEPM e (B) cellule di coltura in un piatto da 35 mm o in una piastra a 6 pozzetti. Quando confluenti, tripsinizzare le cellule e(C)seminarle negli inserti in silicone a 2 pozzetti in un piatto da 35 mm. Coltura le cellule nell'inserto fino a raggiungere la confluenza desiderata (~ 48 h), quindi rimuovere l'inserto in silicone e l'immagine. Le immagini rappresentative sono mostrate (D) immediatamente dopo la rimozione dell'inserto, (E) dopo 24 h, e (F) dopo 40 h. La chiusura della ferita dura circa 36 ore. Le immagini sono state scattate utilizzando un obiettivo 10x. La barra della scala rappresenta 300 μm. Abbreviazioni: MEPM = mesenchima palatale embrionale di topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L'elevazione della mensola palatale costituisce un evento di rimodellamento da verticale a orizzontale1,3,4,9,11. Si ipotizza che questo processo di rimodellamento richieda che le cellule mesenchimali della mensola palatale si comportino in modo coordinato. Le analisi con cellule MEPM wildtype mostrano che questo comportamento cellulare è intrinseco e può essere quantizzato21. Pertanto, questi saggi possono essere utilizzati per scoprire difetti primari di elevazione della mensola palatale in modelli murini nuovi ed esistenti di palatoschisi. I metodi descritti nelle sezioni 1 e 2 dovrebbero consentire agli sperimentatori di isolare, coltura e congelare aliquote di cellule MEPM primarie. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per un'ampia varietà di applicazioni, tra cui i saggi di coltura 2D e di riparazione delle ferite descritti qui. La coltura 2D, se combinata con l'imaging time-lapse, presenta un metodo semplice per determinare gli attributi cellulari di base su una gamma di densità cellulari. Qui viene presentato un metodo per valutare l'allineamento cellulare e la formazione del flusso cellulare, che sono attributi del movimento cellulare collettivo (Figura 4). I saggi di chiusura della ferita sono comunemente usati per valutare la migrazione cellulare41,42,43. La regione priva di cellule della "ferita" fornisce uno spunto per il movimento direzionale delle cellule alla periferia. L'imaging time-lapse di questo processo ha permesso la determinazione e la valutazione delle traiettorie cellulari durante la migrazione. Queste traiettorie cellulari, a loro volta, determinano la velocità e la direzionalità della migrazione cellulare (Figura 5).

È importante innanzitutto ottimizzare le condizioni per la coltura e i saggi utilizzando solo cellule MEPM wildtype. Dopo che i ripiani palatali sono stati tripsinizzati con successo e la conseguente sospensione unicellulare placcata durante la notte, la stragrande maggioranza (~ 90%) delle cellule si attaccherà facilmente alla superficie di crescita del piatto. Se le cellule non aderiscono prontamente, allora potrebbe esserci qualcosa di sbagliato nelle condizioni di coltura. Inizialmente, le cellule aderenti appariranno abbastanza omogenee, con una forma triangolare o leggermente allungata, ma man mano che crescono ad alta densità, diventano più a forma di fuso e allungate (Figura 2). Se le cellule diventano drammaticamente grandi o multinucleate, non dovrebbero essere utilizzate per esperimenti. Questa ottimizzazione stabilirà anche parametri wildtype di base per una crescita di successo (tempo di confluenza) e la riparazione della ferita (tempo di chiusura). Le cellule dovrebbero proliferare raddoppiando il numero quasi ogni giorno e nelle immagini time-lapse, mostrare una motilità di ~ 5-10 μm / h. Allo stesso modo, se in qualsiasi esperimento successivo che coinvolge un confronto wildtype-mutant, questi parametri di base non sono soddisfatti dalle cellule wildtype, l'esperimento potrebbe dover essere escluso dall'analisi. Ad esempio, le cellule MEPM wildtype impiegano 36-40 ore per chiudere completamente la ferita utilizzando gli inserti in silicone a 2 fori. Se in un esperimento, le cellule wildtype impiegano molto più di 40 ore per chiudere la ferita, l'intero esperimento sarebbe sospetto. Le scarse prestazioni delle cellule MEPM possono essere dovute a 1) scarsa qualità dell'aliquota congelata, 2) scarsa ripresa o 3) eccessiva differenziazione. Le cellule differenziate o senescenti possono essere rilevate visivamente man mano che crescono molto grandi e non si dividono. Una coltura con un gran numero di tali cellule dovrebbe essere evitata. In generale, non dovrebbero esserci cellule anomale nel campo visivo di un obiettivo 10x (Figura 3); una o due celle al di fuori del campo visivo non dovrebbero influenzare materialmente l'analisi. Limitare l'analisi a soli due passaggi cellulari (sopra) aiuta notevolmente a mantenere la qualità delle cellule MEPM.

Sia per la coltura 2D che per i saggi di riparazione delle ferite utilizzando cellule MEPM primarie, il requisito chiave per il successo era un'elevata densità cellulare iniziale. Questo requisito è stato determinato per la prima volta durante l'ottimizzazione del test di riparazione della ferita in cui le cellule sono state seminate a >1400 cellule / mm2. La densità delle cellule che migrano nella ferita è stata quindi utilizzata come densità di semina nei test di coltura 2D. Una densità di semina di ~ 300 celle / mm2 ha formato flussi di cellule, pur consentendo l'analisi automatizzata delle traiettorie cellulari. Densità superiori a 300 celle/mm2 tendono a formare flussi più vividi che possono essere visualizzati a occhio, ma rendono difficile il tracciamento delle singole cellule. Quando si confrontano cellule MEPM primarie da embrioni wildtype e mutanti, sebbene il ritardo di chiusura della ferita possa essere valutato senza analisi computazionale, la formazione del flusso e le differenze di direzionalità potrebbero non essere distinguibili a occhio. Se la densità della cella è troppo alta o la qualità dell'immagine è scarsa/sfocata, ad esempio a causa della perdita di messa a fuoco, il tracciamento automatico delle cellule può essere difficile. In tal caso, è possibile utilizzare il tracciamento manuale delle cellule per determinare le traiettorie cellulari nei saggi di riparazione delle ferite utilizzando ImageJ. Una concentrazione molto bassa di colorazione nucleare di Hoechst (3 μL/mL di soluzione da 20 mM in terreno di coltura MEPM) può anche essere utilizzata per facilitare il tracciamento cellulare; tuttavia, la tossicità del laser fluorescente può essere un problema con l'uso prolungato.

Per il tracciamento manuale, è stato più facile tracciare le cellule al contrario dalla fine della chiusura della ferita all'indietro il più lontano possibile fino a quando l'alta densità cellulare ha oscurato l'ulteriore tracciamento. Anche le traiettorie cellulari parziali, quando combinate per una popolazione cellulare, erano informative. A differenza dei saggi di riparazione delle ferite, il tracciamento automatico delle cellule è necessario per l'analisi della coltura cellulare 2D, motivo per cui sono state scelte densità cellulari intermedie. Infine, le analisi sensibili basate su MEPM primarie possono essere utilizzate per identificare composti e percorsi che possono influenzare l'elevazione del palato. Studi precedenti hanno indicato che l'attivazione della via PI3K-AKT ha migliorato sia la velocità cellulare che la direzionalità delle cellule MEPM mutanti Specc1l 21. Altri studi MEPM hanno anche utilizzato vari fattori di crescita o trattamenti farmacologici per stimolare le cascate di segnalazione a valle o per valutare la proliferazione22,29,30,44,45. Pertanto, le analisi basate su MEPM offrono un metodo rapido per identificare molti più fattori regolatori positivi o negativi, che possono quindi essere convalidati in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo progetto è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DE026172 (I.S.) e GM102801 (A.C.). I.S. è stato anche sostenuto in parte dalla sovvenzione del Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), dalla sovvenzione Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) e dalla sovvenzione del Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

Biologia dello sviluppo Numero 168 Palatogenesi Palatoschisi Elevazione del palato Cellule mesenchimali primarie Migrazione cellulare Riparazione della ferita Imaging time-lapse Formazione del flusso cellulare Movimento cellulare collettivo Motilità cellulare coordinata
Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter