Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolation og Time-Lapse Imaging af primær mus embryonale Palatal Mesenchyme Celler til at analysere kollektive bevægelse attributter

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol for isolering og kultur af primære mus embryonale palatal mesenchymale celler for time-lapse billeddannelse af to-dimensionelle (2D) vækst og sår-reparation assays. Vi leverer også metoden til analyse af time-lapse imaging data til at bestemme celle-stream dannelse og retningsbestemt motilitet.

Abstract

Udvikling af ganen er en dynamisk proces, som indebærer vertikal vækst af bilaterale palatal hylder ved siden af tungen efterfulgt af elevation og fusion over tungen. Defekter i denne proces fører til ganespalte, en almindelig fødselsdefekt. Nylige undersøgelser har vist, at palatal hylde elevation indebærer en remodeling proces, der forvandler orienteringen af hylden fra en lodret til en vandret. Den rolle, som palatal hylde mesenchymal celler i denne dynamiske remodeling har været vanskeligt at studere. Time-lapse-imaging-baseret kvantitativ analyse er for nylig blevet brugt til at vise, at primære mus embryonale palatal mesenchymale (MEPM) celler kan selv-organisere sig i en kollektiv bevægelse. Kvantitative analyser kan identificere forskelle i mutante MEPM-celler fra en musemodel med ganehøjdefejl. Dette papir beskriver metoder til at isolere og kultur MEPM celler fra E13.5 embryoner-specifikt for time-lapse imaging-og til at bestemme forskellige cellulære attributter af kollektiv bevægelse, herunder foranstaltninger for strøm dannelse, form justering, og vedholdenhed i retning. Det postulerer, at MEPM-celler kan tjene som en proxymodel til at studere rollen som palatal hylde mesenchyme under den dynamiske elevationsproces. Disse kvantitative metoder vil gøre det muligt for efterforskere i kraniofacial område at vurdere og sammenligne kollektive bevægelse attributter i kontrol og mutant celler, som vil øge forståelsen af mesenchymal remodeling under palatal hylde elevation. Desuden giver MEPM-celler en sjælden mesenkymal cellemodel til undersøgelse af kollektiv cellebevægelse generelt.

Introduction

Gane udvikling er blevet undersøgt udførligt som defekter i palatogenese føre til ganespalte-en fælles fødselsdefekt, der opstår i isolerede tilfælde eller som en del af hundredvis af syndromer1,2. Udviklingen af den embryonale gane er en dynamisk proces, der involverer bevægelse og fusion af embryonalt væv. Denne proces kan opdeles i fire store trin: 1) induktion af palatale hylder, 2) lodret vækst af palatal hylderne ved siden af tungen, 3) højde af palatal hylder over tungen, og 4) fusion af palatal hylder i midten af1,3,4. I løbet af de sidste mange årtier er mange musemutanter blevet identificeret, at åbenbar ganespalte5,6,7,8. Karakterisering af disse modeller har angivet fejl i palatal hylde induktion, spredning, og fusion trin; Det har dog været sjældent, at der er ophøjet en palatal hylde. Således er forståelse af dynamikken i palatal hyldehøjde et spændende forskningsområde.

Omhyggelig analyse af nogle musemutanter med palatal hylde elevation defekter har ført til den nuværende model viser, at den meget forreste region af palatal hylde synes at vende op, mens en lodret til vandret bevægelse eller "remodeling" af palatal hylder forekommer i midten til posterior regioner i ganen1,3,4, 9,10,11. Den mediale kant epitel af palatal hylden sandsynligvis indleder signalering kræves for denne ombygning, som derefter drives af palatal hylde mesenchyme. For nylig har mange forskere identificeret palatal hylde elevation forsinkelse i musemodeller, der viste forbigående mundtlige vedhæftninger involverer palatal hylder12,13. Den mesenchymale remodeling indebærer reorganisering af cellerne for at skabe en bule i vandret retning, samtidig med at den palatale hylde trækkes tilbage i lodret retning9,10,14. Blandt de mange mekanismer , der foreslås at påvirke palatal hyldehøjde og den underliggende mesenkymale remodeling, er cellespredning15,16,17, chemotactic gradienter18og ekstracellulære matrixkomponenter19,20. Et vigtigt spørgsmål opstod: er palatal hylde elevation forsinkelse observeret i Specc1l-mangelfuldmus også delvis på grund af en defekt i palatal hylde remodeling, og kunne denne remodeling defekt manifestere sig i en iboende defekt i adfærd primære MEPM celler21?

Primære MEPM-celler er blevet anvendt i kraniofacialområdet til mange undersøgelser, der involverer genekspression22,23,24,25,26,27,28,29og nogle få, der involverer spredning30,31 og migration25,31,32 , men ingen til analyse af kollektiv cellefunktionsmåde. Time-lapse imaging af MEPM celler blev udført i 2D-kultur og sår-reparation assays at vise, at MEPM celler vises retningsbestemt bevægelse og dannede tæthed-afhængige celle streams-attributter af kollektiv bevægelse21. Desuden dannede Specc1l mutantceller smallere cellestrømme og viste meget variable cellemigrationsbaner. Denne mangel på koordineret motilitet anses for at bidrage til den gane elevation forsinkelse i Specc1l mutant embryoner13,21. Således kan disse relativt enkle analyser ved hjælp af primære MEPM-celler tjene som en proxy for at studere mesenkymal remodeling under palatal hylde elevation. Dette papir beskriver isolation og kultur af primære MEPM celler, samt time-lapse billeddannelse og analyse, for 2D og sår-reparation assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med dyr blev udført med en protokol, der blev godkendt af KUMC Institutional Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med deres retningslinjer og bestemmelser (protokolnummer: 2018-2447).

1. Høst E13.5 embryoner

  1. Aflive gravide hunmus ved hjælp af et CO 2-inhalationskammer eller efter en procedure, der er godkendt af udvalget for institutionel dyrepleje og -anvendelse. Gå straks videre til dissektion.
  2. Eksponer den ringere halvdel af bughulen ved at fjerne huden og bughinden. Punktafgifter begge horn i livmoderen, som indeholder E13.5 embryoner.
  3. Anbring kortvarigt livmoderen i præwarmed 37 °C steril fosfat-buffered saltvand (PBS) for at skylle overskydende blod, hår eller andet snavs. Placer livmoderen i en steril 10 cm skål fyldt med steril PBS.
  4. Ved hjælp af lille saks skæres gennem livmodervæggen langs livmoderens længde for at udsætte hvert embryo, stadig i sin æggeblomme sac. Fjern æggeblommesækken omkring embryoet, men gem den til genotyping, hvis det er nødvendigt. Når embryonerne fjernes, placeres hvert embryo i sin egen brønd af en 12-brønds plade fyldt med PBS.

2. Dissektion af palatale hylder fra embryoner (Figur 1)

BEMÆRK: Sterilisere dissektionsinstrumenterne i rustfrit stål (se materialetabellen)efter behandling af hvert embryo ved først at placere instrumenterne i et bæger på 100% ethylalkohol (EtOH), derefter i et instrumentsterilizer ved 350 °C i 10 s, og derefter afkøle dem i et andet bæger på 100% EtOH.

  1. Ved hjælp af en steriliseret perforeret ske skal embryoet placeres i en ny 10 cm skål fyldt med MEPM-kulturmedium bestående af Dulbeccos minimum af essentielle medium (DMEM), der indeholder 10% fosterkvægserum (FBS), L-glutamin (4 mM L-Glu) og antibiotika-penicillin og streptomycin (50 enheder / mL).
  2. Halshugning embryoet lige under kæbelinjen ved hjælp af steril saks(Figur 1A, rød prikket linje). Fjern underkæben ved at indsætte et punkt af den steriliserede fine # 5 sammentrækninger i munden, holde det lige inde i kinden. Skub punktet af de indsatte sammentakkerne igennem, indtil det forlader ud af bagsiden af kraniet.
  3. Orienter sammenkværnene langs den gule linje i figur 1B, så den anden side af sammenkværnene (som stadig er uden for embryoet) svæver lige over øregangen og derefter klemmer de lukkede sammentrækninger for at skære vævet. Hvis det er nødvendigt, køre en anden fin kraft langs sømmen af de nu lukkede sammentakter til at skære gennem ethvert væv, der ikke var helt afskåret af knivspidsen.
  4. Gentag det foregående trin for den anden side af embryohovedet. Fortsæt pinch-cut proceduren for fuldt ud at fjerne underkæben, tungen og ringere del af kraniet og udsætte palatal hylder.
  5. Fjern kraniets kranium ved at skære lige over øjnene, som vist i figur 1C (grøn linje). Gør dette ved at placere hovedet på venstre eller højre side og placere punkterne i den lille rustfri stål saks foran og bag kraniet lige over embryoets øjenhøjde. Skær toppen af kraniet af med et hurtigt klip af saksen, hvilket skaber en flad overflade, der vil være vigtig for stabilitet i senere trin, og som skal ligne figur 1D, når den ses fra siden.
  6. Placer den resterende del af hovedet på hovedet, med det overlegne aspekt af hovedet (kranium fjernet) hviler fladt på bunden af fadet, hvilket vil give en stabil overflade til palatal hylde fjernelse. Brug et øjeblik på at identificere de palatale hylder, som nu er eksponeret og vender op og vises som to hævede kamme på hver side af en central rille i den forreste halvdel af hovedet (Figur 1E).
  7. Fastgør den resterende del af hovedet til fadet for at immobilisere det, mens hylderne fjernes. Gør dette ved at indsætte et punkt af en fin sammentak gennem vævet nær næseregionen af hovedet, forreste til palatal hylderne, og indsætte det andet punkt af sammentrækninger gennem bunden af kraniet, posterior til palatal hylder. Hold disse på plads, mens du udfører udskillelsen af palatalhylderne.
    1. Immobilisering hovedet med den ene hånd, skal du vælge en af de to hylder til at fjerne først, og indsætte begge punkter i et andet par fine sammentak ind i vævet i bunden af den laterale overflade af hylden, og knivspids at skære vævet (Figur 1F). Gentag dette langs bunden af den mediale overflade af hylden og derefter på både de forreste og bageste ender af hylden for at løsne sig fra hovedet.
  8. Løft forsigtigt hylden, hvilket gør yderligere klemmer efter behov for helt at frigøre hylden fra det omgivende væv.
  9. Gentag de to foregående trin for at fjerne den anden palatal hylde.
  10. Med palatal hylder nu befriet fra det omgivende væv og placeret i PBS (Figur G), bruge en steril plast pære overførsel-pipette til at tegne hylderne i pipetten, og overføre dem til en 1,5 mL mikrocentrifuge rør sammen med ca 500 μL af PBS. Hold rørene, der indeholder palatal hylder på is som resten af kuldet behandles på samme måde.
    BEMÆRK: Alternativt kan hylder placeres i et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder præwarmed trypsin (0,25%) umiddelbart efter dissektion (i stedet for at placere dem på is). Prøverne vil være friskere, men der skal udvises omhu for at tage alle procedureforanstaltningerne for hver enkelt prøve i stedet for at behandle prøverne kollektivt.

3. Kulturen i MEPM-celler

BEMÆRK: Under de forhold, der er beskrevet her, overlever gane epitelcellerne ikke den første passage, hvilket resulterer i en ren gane mesenkymal cellekultur. Brug steril teknik til at udføre alle trin i en vævskultur hætte.

  1. Aspirere og kassér PBS fra 1,5 mL-røret, idet det passes ikke at kassere hylderne i processen. Tilsæt straks 200 μL forvarm (37 °C) trypsin (0,25%) til hvert rør, der indeholder palatale hylder. Kort pipet hylderne op og ned i trypsin ved hjælp af en 1000 μL pipette tip til at fremskynde trypsinisering.
  2. Inkuberes rørene i 5 min ved 37 °C, og rør derefter hver prøve op og ned igen for at hjælpe med at bryde vævet op. Inkuberes rørene i yderligere 5 min ved 37 °C, og pipet op og ned igen for at fuldføre dissociation af vævet.
    BEMÆRK: Hylderne skal være helt eller næsten helt adskilt og suspenderet i trypsin uden synlige bidder af væv tilbage.
  3. Der tilsættes 800 μL mepm-kulturmedium (trin 2.1) til hvert 1,5 mL rør. Centrifugere 1,5 mL rør ved 200 × g i 5 min at pellet cellerne. Fjern supernatanten, og genbrug cellepillen i 1 minut mepm kulturmedium.
  4. Pladen MEPM celler i en 6-brønd væv kultur-behandlet plade, der indeholder MEPM kultur medium. Lad cellerne klæbe til plastoverfladen i 12 timer ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
    BEMÆRK: Efter inkubation natten over vil langt de fleste (~ 90%) af cellerne vedhæfte. På dette tidspunkt vil de klæbede celler se ret homogene ud med en trekantet eller lidt langstrakt form.
  5. Skift mediet hver dag ved forsigtigt at aspirere det gamle medium og straks erstatte det med 1 mL varm steril PBS uden calcium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirere PBS, og erstatte med 3 mL af præwarmed MEPM kultur medium.
  6. Passage cellerne, når de bliver 100% sammenflyttet.
    BEMÆRK: MEPM-celler bør formere sig ved at fordoble antallet næsten dagligt.
    1. For at passere cellerne, forsigtigt aspirere det gamle medium, og straks erstatte det med varm PBS uden calcium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirere PBS, og erstatte det med 0,5 mL af præwarmed 0,25% trypsin.
    2. Inkuberes ved 37 °C i ~5 min, eller indtil cellerne løsnes fra fadets overflade, når de forsigtigt vugges frem og tilbage i hånden. Når cellerne er løsnet, straks tilføje 5 mL af præwarmed MEPM kultur medium til trypsiniserede celler.
    3. Ved hjælp af en 10 mL serologisk pipet, forsigtigt indsamle cellerne i en 15 mL koniske rør, og centrifuge røret på 200 × g i 5 minutter at pellet cellerne. Aspirere trypsin og medium, og resuspend cellerne i 3 mL af præwarmed MEPM kultur medium. Rør forsigtigt 1 mL celler ind i en enkelt brønd af en 6-brønds skål, og tilsæt 2 mL MEPM kulturmedium for at bringe det samlede volumen til 3 mL.
      BEMÆRK: Dette udgør en 1:3 opdeling af celler. Mep'er kan passeres op til tre gange. Såingstætheden af MEP'er er noget fleksibel, og antallet af celler, der er til stede, varierer afhængigt af dyrkningsbeholderen. Mep'erne formerer sig imidlertid ikke ordentligt, når de deles for sparsomt, og bør være mindst 20-25 % sammenflyttede i deres nye ret, når de overholder dem.

4. Kryopræservering af MEPM-celler

  1. Når trypsiniserede MEPM-celler er pelleted, genbruge cellerne i MEPM kulturmedium for at opnå en koncentration på ~ 1 × 106 celler / mL. Pipet cellerne i cryovials, og tilsæt en endelig koncentration på 5% dimethylsulfoxid i cellebestanden. Hætten kryovial, kort blandes ved invertering, og straks placere hætteglass i en frysende beholder, der køler med en hastighed på 1 °C/min.
  2. Sæt køleren i en fryser på -80 °C natten over. På den næste dag skal du flytte cryovials til en flydende nitrogentank til langtidsopbevaring.
  3. Optøning cryopreserved MEPM celler
    1. Fjern cryovials fra den flydende nitrogentank, og optø ved stuetemperatur, indtil indholdet begynder at blive flydende. Tøm indholdet i et 15 mL konisk rør, der indeholder 9 mL af præwarmed MEPM kulturmedium.
    2. Centrifuge røret ved 200 × g for at pille cellerne. Resuspend cellerne i 1 mL af MEPM kultur medium, og pipet cellerne i en enkelt brønd af en 6-brønd plade. Tilføj 2 mL varm MEPM kultur medium til at bringe det samlede volumen til 3 mL.
    3. Kulin cellerne ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2. Skift medium dagligt.

5. Live-billeddannelse af MEPM-celler - 2D kollektiv migrationsanalyse (Figur 2)

  1. Forbered en plade til brug for levende billeddannelse.
    1. Brug lille kirurgisk saks eller en skarp skalpel til at forkorte en steril 2-brønd silikoneindsats til en højde på ~ 1 mm. Forbered en indsats for hver prøve, der bruges.
    2. Brug sammentrerne, placer den forkortede 2-brønd silikoneindsats i midten af en brønd af en 6-brønds plade. Tryk ned langs alle kanter for at sikre, at den er helt klæbet.
  2. Optø grædende celler ved at følge trinnene i afsnit 4.3 i denne protokol. Tæl MEPM-celler, og frø 300 celler/mm2 af de forkortede silikoneindsatser i et samlet volumen på 40-50 μL MEPM kulturmedium pr. Brønd. Opdel cellerne natten over ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
  3. På den næste dag skal du forberede dig på levende time-lapse imaging.
    1. Brug et fasekontrastmikroskop med inkubator på scenen og automatisk billedbehandlingsevne. Tilsæt vand til inkubatorbeholderen på scenen for at reducere fordampning af kulturmediet; indstille temperaturen til 37 °C og CO2 til 5 %. Tillad ~ 30 min for fugtigheden til at opbygge, før du placerer 6-brønd skålen i scenen inkubator.
  4. Brug indstillinger svarende til følgende til time-lapse imaging.
    1. Vælg målsætningen 4x for at have store synsfelter og fasekontrastfilter.
      BEMÆRK: Autofokus, Automatisk søgning, z-stack og auto-belysning er normalt ikke nødvendigt.
    2. Vælg to mikroskopiske felter pr. brønd for at fange lumen af de forkortede silikoneindsatser. Sørg for, at alle billedpositioner har det korrekte fokus.
      BEMÆRK: Billedplan kan justeres under billeddannelse, men en sådan justering er normalt ikke nødvendig.
    3. Vælg den ønskede billedoutputfiltype, og vælg eller vælg derefter indstillinger efter billeddannelse, f.eks. Hvis det er relevant, skal du vælge fasekontrast som billedbehandlingstilstand.
      BEMÆRK: Brug af vandmærker kan hæmme efterfølgende billedbehandlingstrin.
    4. Indstil optagelsens varighed til 72 timer. Indstil programmet til at tage billeder hvert 10. minut.
      BEMÆRK: Normalt kræves der kun 48 timers billeddannelse, men billeddannelse kan stoppes når som helst før 72 timers mærket uden at miste billeder, der allerede er taget.
    5. Sørg for, at miljøkammeret er i drift efter behov i 5.3.1. Gem disse indstillinger (rutinen) og begynd at få afbildningen.
  5. Fortsæt billeddannelsen indtil 72 timer (eller det angivne tidspunkt).

6. Live-imaging af MEPM-celler i en sår-reparation assay (Figur 3)

  1. Forbered en plade til brug for live-imaging. Brug sammenkrump, læg en steril 2-brønd silikoneindsats i midten af en brønd af en 6-brønds plade, og tryk ned langs alle kanter for at sikre, at den er fuldt klæbet. Forbered en 2-brønds skær til hver prøve, der bruges.
  2. Optø grædende celler ved at følge trinnene i afsnit 4.3 i denne protokol. Tæl MEPM-celler, og koncentrer cellerne om nødvendigt til mindst 350 celler/μL.
  3. Frø 1400 celler/mm2 i silikoneindsatserne i et volumen på 100 μL MEPM-kulturmedium pr. brønd. Kulin cellerne i 48 timer ved 37 °C i en inkubator med 5% CO2, og skift mediet hver dag.
  4. Efter 48 timer forberede et mikroskop til levende time-lapse imaging som beskrevet i afsnit 5.3 og 5.4. Umiddelbart før du placerer cellerne i inkubatoren på scenen, tilsættes 3 mL af præwarmed MEPM kulturmedium til brønden (men uden for skær), og fjern derefter forsigtigt silikoneindsatserne.
    BEMÆRK: Væggen, der adskiller de 2 kamre, efterlader et hul, der er "såret".
  5. Start time-lapse imaging som beskrevet i punkt 5.4, med følgende forskelle:
    1. Brug en højere forstørrelse (f.eks. 10x) målsætning. Hvis du vil fange sårlukning, skal du vælge 5 synsfelter langs hvert sår, så såret er parallelt med billedets lodrette akse.
  6. Stop billeddannelse efter 72 timer, eller når sårene er helt lukket.

7. Computational analyse af time-lapse billedsekvenser

BEMÆRK: Udfør følgende procedurer på en computer, der er udstyret med standardberegningsværktøjer, f.eks.

  1. Analyse af velstand
    BEMÆRK: Denne procedure kan bruges til at estimere cellespredning inden for en sparsom kultur eller til at kvantificere sårlukningseksperimenter. Hvis du vil registrere områder, der er besat af celler, anvendes der en segmenteringstærskel på den lokale standardafvigelse for billedets lysstyrke. Koden er tidligere blevet beskrevet af Wu et al.33 og Neufeld et al.34 og er tilgængelig på http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Bestem segmenteringstærsklen for billederne. Hvis du f.eks. vil se segmentering med en tærskel 4, skal du udstede kommandoen
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
      og derefter kontrollere outputtet(output.jpg).
      BEMÆRK: Hvis tærsklen er for lav, klassificeres baggrundsområder i mikrografen som celledækkede. Hvis tærsklen derimod er for høj, klassificeres celledækkede områder ikke som sådanne. Den optimale tærskelværdi holder begge fejl på et minimum.
    2. Brug det medfølgende area.sh script til at beregne sammenløbsværdier for en billedsekvens som
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > sammenløb.dat
      BEMÆRK: Forskelsbehandlingstærskelværdien 4 bekræftes i trin 1, og resultaterne gemmes i filkonfluensen.dat. Ved at sortere billederne i relevante mapper kan listen over billedfilnavne erstattes af jokertegn notation:
      area.sh -S4 *.jpg > sammenløb.dat
    3. I sårlukningsforsøg skal sammenløbsdata A(t)-størrelsen af celledækket område udtrykt som en procentdel som funktion af tid-til sår-kant formeringshastighed V som
      Equation 1
      hvor feltets bredde og dA/dt er det tidspunkt, hvor derivat af A(t), dvs.
  2. Kort over cellemotilitet
    1. Udfør en partikelbillede velocimetri (PIV) algoritme til at karakterisere celle motilitet, og udtrække omfanget af lokale bevægelse "optisk flow" mellem billedpar, men ikke at identificere de enkelte celler.
      BEMÆRK: Her anvendes en indledende vinduesstørrelse på 50 μm, som beskrevet i detaljer af Zamir et al.35 og Czirok et al.36, med en indledende vinduesstørrelse på 50 μm. PIV-analysen giver et hastighedsfelt v(x,t) for hver billedramme t og placering (i billedet) x.
    2. Udtræk den gennemsnitlige hastighed for cellemotilitet fra v(x,t) som et rumligt gennemsnit beregnet over det cellebesatte område som bestemt i punkt 7.1.
  3. Manuel cellesporing
    BEMÆRK: Mens PIV-analysen giver en automatisk vurdering af cellemotilitet, kræver det ofte manuel sporing at fokusere på de enkelte cellers adfærd. Mens flere værktøjer giver denne funktionalitet, er det meget nyttigt, hvis de manuelt placerede markører kan ændres efter deres første placering, og hvis sporing kan udføres både frem og tilbage i tiden.
    1. Udfør cellesporing med et specialudviklet pythonværktøj (http://github.com/donnagreta/cm_track), som også indeholder grundlæggende editorfunktioner, såsom sletning af baner.
      BEMÆRK: Dette manuelle sporingsværktøj giver positionerne P(i,t) af celle i på et tidspunkt t i en tekstfil, og påberåbes som
      cm_track.py -i billeder/ -o track.dat
      hvor time-lapse-billederne findes i mappebillederne/ og positionsdataene indsamles i filsporet.dat (Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Analyse af individuelle cellebaner. (A) Mikrografer med fasekontrast er underlagt (B, C) en manuel sporingsprocedure, som markerer celler (grønne prikker). (D) Cellepositioner (x,y) lagres for hver celle, der er kendetegnet ved dens id, og for hver ramme f. (E) kan baner overlejres på mikrograferne og farvekodes for at angive tidsmæssige oplysninger. Som et eksempel i hver bane angiver en blå til rød farvepalet gradvist senere baner, hvor henholdsvis rød og blå markerer de oprindelige og endelige celleplaceringer. (F) Forskellige statistiske egenskaber af baner, såsom den gennemsnitlige kvadratforskydning, kan udvindes og bruges til at karakterisere motiliteten af forskellige cellepopulationer, som i dette eksempel omfatter wildtype (wt, blå) og knockdown (kd, rød) MEPM celler. Skalabjælkerne repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Overlejre baner på billeder ved hjælp af et andet værktøj, der aktiveres som
    visdat.py -d track.dat -i billeder/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2
  2. Saml billederne med baner overlejret i mappen overlay.
    BEMÆRK: I dette eksempel gemmes cellepositionsdata i filsporet.dat, mens billedsekvensen for tid bortfalder er i mappebillederne. Resten af parametrene styrer den maksimale længde af de tegnede baner (-l), størrelsen af symbolerne (-r) og det anvendte farveskema (-C).
  1. Analyse af individuelle celleforløb
    1. Karakterisere baner efter den samlede stilængde
      Equation 2,
      og nettoforskydning mod såret
      Equation 3,
      hvor X betegner P-projektionen i den retning, der er vinkelret på såret: x-koordinaten for positionerne, når såret er parallelt med y-aksen.
    2. Beregn vejledningens effektivitet som Equation 4 for hver celle i og klokkeslæt t37. Karakterisere kulturer efter befolkningsgennemsnittet af disse enkeltcellede foranstaltninger, evalueret på et passende tidspunkt t.
  2. Kollektiv streaming bevægelse af celler
    1. Karakterisere de lokale rumlige korrelationer af cellebevægelser med den gennemsnitlige hastighed af andre celler, der er i nærheden af en bevægelig celle, som beskrevet tidligere38,39.
      BEMÆRK: Beregningskoden er tilgængelig på https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Justere et referencesystem med retninger for, bag, venstre og højre til hver vektor v(x,t) (Figur 5A). Tildel hver af den omgivende celle- eller PIV-hastighedsvektor til referencesystemets relevante rumlige celle (Figur 5B). Gentag proceduren, da hver vektor fungerer som oprindelsen af referencesystemerne (Figur 5C, D), så der tildeles en given hastighedsvektor til flere placeringer.
        BEMÆRK: Et datapunkt kan være foran en vektor og til venstre for en anden.
      2. Rotere referencesystemerne i en fælles retning (Figur 5C, F) og gruppere dem ( Figur5G).
        BEMÆRK: Gennemsnittet af hver placering af de samlede hastighedsdata er en hastighedsvektor (U), der er tegn på rumlig korrelation: gennemsnittet er et mål for en komponent med delt hastighed (Figur 5H).
      3. Tilpas U(x)-flowfelterne med en eksponentiel funktion Equation 5 , hvor a, x0 og U0 passer til parametre. Ud af de tre monteringsparametre skal du fokusere på x0, korrelationslængden (Figur 5I, J), som er den karakteristiske afstand, hvor lokale hastighedskorrelationer forsvinder.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering af strømdannelse af dyrkede celler. (A,D) Fase-kontrast time-lapse billeder fra figur 4A bruges til at identificere cellebevægelser. For hver celle i bevægelse blev en referenceramme (blå) og rumlige placeringer (hvid) justeret sammen for at kategorisere tilstødende celler som værende foran, bag, venstre eller højre. (B,E) Hastigheden af tilstødende celler (sorte vektorer) var relateret til den samme referenceramme (C,F). Denne procedure blev gentaget for hver celle og hvert klokkeslæt. (G) Efter gruppering af disse lokale oplysninger, vil hver bin indeholde flere hastighed vektorer (grå), som kan beregnes i gennemsnit for at bestemme den gennemsnitlige co-moving hastighed (magenta pile) på forskellige steder i forhold til en gennemsnitlig motile celle. (H) Det gennemsnitlige hastighedskort karakteriserer således de typiske cellehastigheder forskellige steder i forhold til en celle i bevægelse. (I, J) Endelig blev der udtaget prøver af dette felt langs den forreste (parallelle) akse og også langs venstre-højre (vinkelret) akse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dissektionen af palatalhylder er illustreret i figur 1. Sekvensen af snit er designet til at minimere skred af vævet. Efter fjernelsen af hovedet (Figur 1A, B), fjernes underkæben ( Figur1B, C). Snittet i den øverste del af hovedet (Figur 1C, D ) gøres for at stabiliserevævet,når det placeres på hovedet (Figur 1E) for at visualisere (Figur 1E, stiplede linjer), klemme ( Figur1F) og punktafgifter (Figur 1G) palatale hylder.

Det udskårne palatalhyldepar fra et enkelt embryo er trypsiniseret og kultiveret i en 35 mm skål eller i en brønd af en 6-brønds skål. Større retter foretrækkes ikke, da celletætheden er for lav til optimal vækst. Ved sammenløb prøves cellerne fra hver brønd og indpasseres i tre 35 mm-ækvivalente brønde (passage # 1). Sammenløbsceller fra passage # 1 kan derefter fryses ned i aliquots af 1 × 106 celler / mL. Frosne aliquots bringes efterfølgende op i en 35 mm-ækvivalent skål og dyrkes til sammenløb. Cellerne er derefter trypsinized (passage # 2) og seedet i henhold til eksperimentet. Oprettelse og brug af frosne aliquots bidraget til at normalisere forholdene, især med hensyn til celletæthed. Brugen af friske MEPM-celler resulterede i mere variation i den endelige celletæthed i eksperimenter, hvilket menes at skyldes en variabel andel af levedygtige eller sub-levedygtige celler i friske kulturer. Derudover var antallet af MEPM-cellepassager strengt begrænset til to (anført ovenfor) for disse eksperimenter.

I betragtning af at a) celletætheden var kritisk, b) MEPM-celler fra et enkelt embryo var begrænsede, og c) billeddannelse var bedre i en stor skål, 2-brønd silikoneindsatser blev brugt (Figur 2 og figur 3). Til sårreparationsanalyser blev MEPM-celler dyrket i 2-brønd silikoneindsatserne, indtil de var høje sammenløb, derefter blev indsatserne fjernet, og såret blev afbildet indtil lukningen (Figur 3). Men for 2D-kultur havde MEPM-cellerne brug for billeddannelse, da de voksede, så de 2-brønd silikoneindsatser blev simpelthen trimmet til 1/3rd af deres højde for at give mulighed for klar billeddannelse (Figur 2C). Små 3D-printede ringe40 i 35 mm retter blev også brugt til 2D motilitetsanalyse (Figur 2D).

MEPM-baner (Figur 4E) er vedholdende: retningen af cellemotilitet opretholdes i flere timer. Den gennemsnitlige forskydning vs. tidsanalyse (Figur 4F) angiver, at vedholdenheden i form af forskydning er proportional med forløbet tid. Den typiske hastighed af MEPM-celler på vævskultur plastoverflade, 10 μm/h, kan også bruges til kvalitetskontrol af cellekulturen. Flowanalyse af motilitetsdata viser, at de sammenkørende klynger af MEPM-celler er ~300 μm i størrelse (Figur 5I, J). De repræsentative resultater indikerer også en dyb motilitetsforskel mellem vilde og mutante MEPM-celler. Ud over wildtype og mutant sammenligning, både 2D og sår-reparation assays kan kombineres med forskellige biokemiske behandlinger. Pi3K-AKT-stiaktivatorer er f.eks.

Figure 1
Figur 1: Dissektion af embryonale palatale hylder for at isolere mesenkymale celler. (A) Et E13.5 musefoster fjernes ved at skære langs halsen (rød linje). (B) Dernæst fjernes underkæben og tungen med snit langs mundhulen mellem over- og underkæberne (gul linje). (C) For at stabilisere vævet til fjernelse af palatal hylde fjernes toppen af hovedet (grøn linje). (D) Det resulterende dissekerede overkæbeområde placeres (E) på hovedet for at visualisere de palatale hylder (sorte stiplede linjer). (F) Udskillelsen af individuelle palatale hylder er afbildet skematisk, hvor individuelle fremspringende hylder (gul) er klemt ud fra maxilla (blå). (G) Udskårne par palatale hylder fra et enkelt embryon, som derefter kan prøves og dyrkes i en 35 mm skål eller i en 6-brønds plade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel opsætning af 2D MEPM-cellekultur. (A) Optø en frossen aliquot af MEPM-celler, og (B) kultur cellerne i en 35 mm skål eller en 6-brønds plade. Når cellerne er sammenløbet, afprøves cellerne og sås som beskrevet i protokollen i en 35 mm skål enten med (C) 2-brønd silikoneindsatser, der er blevet trimmet eller (D) med 3D-printede ringe. Et lille kulturrum minimerer behovet for et stort antal MEPM-celler. Den lave profil af de trimmede silikoneindsatser eller de 3D-printede ringe giver mulighed for direkte billeddannelse uden en halo-effekt. Time-lapse imaging kan fortsætte, indtil den ønskede celletæthed er opnået, hvilket kan være op til 72 timer. Repræsentative billeder vises på (E) 0 h, (F) 24 h og (G) 45 h tidspunkter. Billederne blev taget ved hjælp af en 4x mål. Vægtstængerne for E, F, G = 300 μm. Forkortelser: 2D = todimensionelle; MEPM = musefoymememe; 3D = tredimensionel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentel opsætning af sårlukningsanalyse ved hjælp af MEPM-celler. (A) Optø en frossen aliquot af MEPM-celler og(B)kulturceller i en 35 mm skål eller en 6-brønds plade. Når de er sammenløbet, trypsinize cellerne og (C) frø dem i 2-brønd silikone skær i en 35 mm skål. Kultur cellerne i indsatsen, indtil den ønskede sammenløb er opnået (~ 48 h), derefter fjerne silikone indsætte og billede. Der vises repræsentative billeder (D) umiddelbart efter fjernelse af indsatsen, (E) efter 24 timer og (F) efter 40 timer. Sårlukning tager omkring 36 timer. Billederne blev taget ved hjælp af en 10x mål. Skalabaren repræsenterer 300 μm. Forkortelser: MEPM = mus embryonale palatal mesenchyme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Palatal hyldehøjde udgør en lodret til vandret ombygningshændelse1,3,4,9,11. Det er postuleret, at denne remodeling proces kræver palatal hylde mesenchymale celler til at opføre sig koordinat. Analyserne med jokertegn MEPM-celler viser, at denne cellefunktion er iboende og kan kvantificeres21. Således kan disse analyser bruges til at afdække primære palatal hylde elevation fejl i nye og eksisterende musemodeller af ganespalte. De metoder, der er beskrevet i afsnit 1 og 2, bør gøre det muligt for efterforskere at isolere, kultur og fryse aliquots af primære MEPM-celler. Disse celler kan derefter bruges til en bred vifte af applikationer, herunder 2D-kultur og sår-reparation assays beskrevet her. 2D-kulturen, når den kombineres med time-lapse imaging, præsenterer en enkel metode til at bestemme grundlæggende celleattributter over en række celletætheder. Præsenteret her er en metode til at vurdere cellejustering og cellestrømsdannelse, som er attributter for kollektiv cellebevægelse (Figur 4). Sårlukningsanalyser anvendes ofte til at vurdere cellemigration41,42,43. Den cellefri region af "såret" giver en cue for retningsbestemt bevægelse af celler i periferien. Time-lapse imaging af denne proces gjorde det muligt at fastlægge og vurdere cellebaner under migration. Disse cellebaner bestemmer igen cellemigreringshastighed og retningsbestemthed (Figur 5).

Det er vigtigt først at optimere betingelserne for kultur og analyser ved hjælp af kun wildtype MEPM celler. Efter palatal hylder er blevet afprøvet med succes og den resulterende enkeltcellede suspension forgyldt natten over, vil langt de fleste (~ 90%) af cellerne let vedhæfte til vækstoverfladen af skålen. Hvis cellerne ikke umiddelbart klæber, kan der være noget galt med kulturforholdene. I første omgang vil de klæbede celler se ret homogene ud med en trekantet eller lidt langstrakt form, men når de vokser til en høj densitet, bliver de mere spindelformede og aflange (figur 2). Hvis cellerne bliver dramatisk store i størrelse eller multinukleated, bør de ikke bruges til eksperimenter. Denne optimering vil også etablere grundlæggende wildtype parametre for vellykket vækst (tid til sammenløb) og sår-reparation (tid til lukning). Cellerne bør formere sig ved at fordoble i antal næsten dagligt og i time-lapse billeder, viser motilitet ~ 5-10 μm / h. Hvis disse grundlæggende parametre i et efterfølgende forsøg, der involverer en wildtype-mutant sammenligning, ikke opfyldes af wildtypeceller, kan det være nødvendigt at udelukke eksperimentet fra analyse. For eksempel tager wildtype MEPM-celler 36-40 timer for helt at lukke såret ved hjælp af 2-brønd silikoneindsatserne. Hvis det i et eksperiment tager betydeligt længere tid end 40 timer at lukke såret, ville hele eksperimentet være mistænkeligt. Dårlig ydeevne fra MEPM celler kan skyldes 1) dårlig frossen aliquot kvalitet, 2) dårlig genoplivning, eller 3) overdreven differentiering. Differentierede eller senescerende celler kan detekteres visuelt, da de vokser sig meget store og ikke deler sig. En kultur med et stort antal af sådanne celler bør undgås. Generelt bør der ikke være unormale celler i synsfeltet af et 10x-mål (figur 3); en celle eller to uden for synsfeltet bør ikke påvirke analysen væsentligt. Begrænsning af analyse til kun to cellepassager (ovenfor) hjælper i høj grad med at opretholde kvaliteten af MEPM-celler.

For både 2D-kultur og sår-reparation assays ved hjælp af primære MEPM celler, det centrale krav for succes var en høj indledende celletæthed. Dette krav blev først bestemt under optimering af sår-reparation assay, hvor celler blev seedet på >1400 celler / mm2. Tætheden af celler migrerer ind i såret blev derefter brugt som såning tæthed i 2D kultur assays. En såningstæthed på ~ 300 celler / mm2 dannede cellestrømme, mens der stadig giver mulighed for automatiseret analyse af cellebaner. Tætheder højere end 300 celler / mm2 tendens til at danne mere levende vandløb, der kan visualiseres af øjet, men gør de enkelte celle tracking vanskeligt. Ved sammenligning af primære MEPM-celler fra wildtype- og mutantembryoner, selv om sårlukningsforsinkelsen kan vurderes uden beregningsanalyse, kan strømdannelse og retningsforskelle muligvis ikke ses med øjet. Hvis celletætheden er for høj, eller billedkvaliteten er dårlig/sløret, for eksempel på grund af tab af fokus, kan automatiseret cellesporing være vanskelig. I et sådant tilfælde er det muligt at bruge manuel cellesporing til at bestemme cellebaner i sårreparationsanalyser ved hjælp af ImageJ. En meget lav koncentration af Hoechst-atomplet (3 μL/mL 20 mM opløsning i MEPM-kulturmediet) kan også bruges til at lette cellesporing; Fluorescerende lasertoksicitet kan dog være et problem med udvidet brug.

Til manuel sporing var det lettere at spore celler i bakgear fra slutningen af sårlukning baglæns så vidt muligt, indtil høj celletæthed tilslørede yderligere sporing. Selv delvise cellebaner, når de kombineres for en cellepopulation, var informative. I modsætning til sår-reparation assays, automatiseret celle tracking er påkrævet for 2D celle kultur analyse, hvilket er en af grundene til, at mellemliggende celle tætheder blev valgt. Endelig kan følsomme primære MEPM-baserede analyser bruges til at identificere forbindelser og veje, der kan påvirke ganens højde. Tidligere undersøgelser viste , at aktiveringen af PI3K-AKT-stien forbedrede både cellehastigheden og retningsretningen af Specc1l mutant MEPM-cellerne21. Andre MEPM-undersøgelser har også anvendt forskellige vækstfaktor - eller lægemiddelbehandlinger til at stimulere downstream-signalkaskader eller til at vurdere spredning22,29,30,44,45. Mepm-baserede analyser tilbyder således en hurtig metode til at identificere mange flere positive eller negative reguleringsmæssige faktorer, som derefter kan valideres in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette projekt blev delvist støttet af National Institutes of Health Grants DE026172 (I.S.) og GM102801 (A.C.). I.S. blev også delvist støttet af Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) tilskud (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) og Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) grant (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

Udviklingsbiologi Udgave 168 Palæserose Ganespalte Ganese Elevation Primære mesenkymale celler Celle migration Sår-reparation Time-lapse imaging Cell stream dannelse Kollektiv celle bevægelse Koordineret celle motilitet
Isolation og Time-Lapse Imaging af primær mus embryonale Palatal Mesenchyme Celler til at analysere kollektive bevægelse attributter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter