Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

العزلة والتصوير الفاصل الزمني لخلايا ميسنشيم الجنينية للفأر الأولي لتحليل سمات الحركة الجماعية

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

نحن نقدم بروتوكولا لعزل وثقافة الخلايا الميكنشية الجنينية الأولية للفأرة للتصوير الفاصل الزمني للنمو ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) ويقيس إصلاح الجروح. كما نقدم منهجية تحليل بيانات التصوير الفاصل الزمني لتحديد تكوين تيار الخلية والحركة الاتجاهية.

Abstract

تطوير الحنك هو عملية ديناميكية ، والتي تنطوي على النمو الرأسي للرفوف الفخمة الثنائية بجوار اللسان تليها الارتفاع والانصهار فوق اللسان. تؤدي العيوب في هذه العملية إلى الحنك المشقوق ، وهو عيب خلقي شائع. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ارتفاع الجرف الفخم ينطوي على عملية إعادة عرض تحول اتجاه الرف من عمودي إلى أفقي. كان من الصعب دراسة دور الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي في هذا إعادة عرض ديناميكية. وقد استخدم مؤخرا التحليل الكمي القائم على الفاصل الزمني للتصوير لإظهار أن خلايا الفأرة الجنينية الأولية يمكن أن تنظم نفسها بنفسها في حركة جماعية. يمكن للتحليلات الكمية تحديد الاختلافات في خلايا MEPM المتحولة من نموذج الماوس مع عيوب ارتفاع الحنك. تصف هذه الورقة أساليب عزل واستزراع خلايا MEPM من الأجنة E13.5 على وجه التحديد للتصوير بفارق زمني وتحديد السمات الخلوية المختلفة للحركة الجماعية ، بما في ذلك تدابير تكوين التيار ، ومحاذاة الشكل ، واستمرار الاتجاه. فإنه يفترض أن خلايا MEPM يمكن أن تكون بمثابة نموذج وكيل لدراسة دور mesenchyme الجرف الحنكي خلال عملية ديناميكية من الارتفاع. وستسمح هذه الأساليب الكمية للمحققين في مجال القحف الوجهي بتقييم ومقارنة سمات الحركة الجماعية في الخلايا المسيطرة والمتحولة، مما سيزيد من فهم إعادة عرض الميكنشيمال أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. وعلاوة على ذلك، توفر خلايا MEPM نموذج خلايا حساسة نادرة للتحقيق في حركة الخلايا الجماعية بشكل عام.

Introduction

وقد درس تطوير الحنك على نطاق واسع كما عيوب في palatogenesis يؤدي إلى شق الحنك - عيب خلقي شائع يحدث في حالات معزولة أو كجزء من مئات المتلازمات1،2. تطور الحنك الجنيني هو عملية ديناميكية تنطوي على حركة وانصهار الأنسجة الجنينية. ويمكن تقسيم هذه العملية إلى أربع خطوات رئيسية: 1) التعريفي من الرفوف الفخمة, 2) النمو الرأسي للرفوف فخمة بجانب اللسان, 3) ارتفاع الرفوف الفخمة فوق اللسان, و 4) الانصهار من الرفوف الفخمة في خط الوسط1,3,4. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تحديد العديد من المسوخ الماوس التي تظهر الحنك المشقوق5،6،7،8. وقد أشار توصيف هذه النماذج إلى وجود عيوب في خطوات التعريفي والانتشار والانصهار على الرف الفخم؛ ومع ذلك، كانت عيوب ارتفاع الجرف الحنكي نادرة. وبالتالي ، فإن فهم ديناميات ارتفاع الجرف الفخم هو مجال مثير للاهتمام من البحث.

تحليل دقيق لبعض المسوخ الماوس مع عيوب ارتفاع الجرف الحنكي أدى إلى النموذج الحالي تبين أن المنطقة الأمامية جدا من الرف الفخم يبدو أن الوجه، في حين أن حركة عمودية إلى أفقية أو "إعادة عرض" من الرفوف الفخمة يحدث في المناطق الوسطى إلى الخلفية من الحنك1،3،4، 9،10،11. ظهارة حافة وسيطة من الرف الفخم من المرجح أن يبدأ الإشارات المطلوبة لإعادة عرض هذا، الذي هو ثم مدفوعة mesenchyme الجرف الفخم. في الآونة الأخيرة, وقد حددت العديد من الباحثين تأخير ارتفاع الجرف الفخم في نماذج الماوس التي أظهرت الالتصاقات الشفوية العابرة التي تنطوي على رفوففخمة 12,13. ينطوي إعادة عرض mesenchymal على إعادة تنظيم الخلايا لخلق انتفاخ في الاتجاه الأفقي ، مع التراجع في نفس الوقت عن الرف الحنكي في الاتجاه الرأسي9و10و14. من بين العديد من الآليات المقترحة للتأثير على ارتفاع الجرف الحنكي وإعادة عرض mesenchymal الكامنة هي انتشار الخلايا15،16،17، التدرجات الكيميائية18، ومكونات مصفوفة خارج الخلية19،20. نشأ سؤال مهم: هل تأخر ارتفاع الرف الحنكي الملاحظ في الفئران الناقصة Specc1l -يرجع جزئيا أيضا إلى عيب في إعادة عرض الرف الحنكي ، ويمكن أن يظهر هذا العيب في إعادة العرض في عيب جوهري في سلوك خلايا MEPM الأولية21؟

وقد استخدمت الخلايا MEPM الأولية في مجال القحف الوجهي لكثير من الدراسات التي تنطوي على التعبير الجيني22،23،24،25،26،27،28،29، وعدد قليل منها التي تنطوي على انتشار30،31 والهجرة25،31،32 ، ولكن لا شيء لتحليل سلوك الخلية الجماعية. تم إجراء التصوير الفاصل الزمني لخلايا MEPM في الثقافة ثنائية الأبعاد و مقايسات إصلاح الجروح لإظهار أن خلايا MEPM أظهرت حركة اتجاهية وشكلت تيارات الخلايا المعتمدة على الكثافة - سمات الحركة الجماعية21. وعلاوة على ذلك، شكلت الخلايا المتحولة Specc1l تيارات خلايا أضيق وأظهرت مسارات هجرة الخلايا متغيرة للغاية. ويعتبر هذا النقص في حركية منسقة للمساهمة في تأخير ارتفاع الحنك في الأجنة متحولة Specc1l 13,21. وهكذا، فإن هذه المقايسات البسيطة نسبيا باستخدام خلايا MEPM الأولية قد تكون بمثابة وكيل لدراسة إعادة عرض mesenchymal أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. تصف هذه الورقة عزلة وثقافة خلايا MEPM الأولية ، وكذلك التصوير والتحليل الفاصل الزمني ، للمقاايسات 2D وإصلاح الجروح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي شملت الحيوانات ببروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كومك، وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة بها (رقم البروتوكول: 2018-2447).

1. حصاد E13.5 الأجنة

  1. قتل الفئران الإناث الحوامل باستخدام غرفةاستنشاق ثاني أكسيد الكربون أو عن طريق إجراء وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه. المتابعة فورا إلى تشريح.
  2. كشف النصف السفلي من تجويف البطن عن طريق إزالة الجلد والغشاء الصفاق. استئصال كلا قرني الرحم، والتي تحتوي على الأجنة E13.5.
  3. ضع الرحم لفترة وجيزة في ملحية معقمة بكمية الفوسفات قبل الحرب 37 درجة مئوية (PBS) لشطف الدم الزائد أو الشعر أو غيرها من الحطام. ضع الرحم في طبق معقم 10 سم مملوءة برنامج تلفزيوني معقم.
  4. باستخدام مقص صغير، وقطع من خلال جدار الرحم على طول الرحم لفضح كل جنين، لا يزال في كيس صفار له. إزالة كيس صفار المحيطة الجنين، ولكن حفظه ل genotyping، إذا لزم الأمر. كما تتم إزالة الأجنة، ضع كل جنين في بئر الخاصة به من لوحة 12 جيدا مليئة برنامج تلفزيوني.

2. تشريح رفوف فخمة من الأجنة (الشكل 1)

ملاحظة: تعقيم أدوات تشريح الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد)بعد معالجة كل جنين عن طريق وضع الأدوات أولا في كوب من الكحول الإيثيلي 100٪ (EtOH)، ثم في جهاز تعقيم الأدوات عند 350 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، ومن ثم تبريدها في كوب ثان من 100٪ EtOH.

  1. باستخدام ملعقة مثقبة معقمة، ضع الجنين في طبق جديد طوله 10 سم مليء بوسيلة زراعة MEPM تتكون من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي لدولبيكو (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) ، L-glutamine (4 mM L-Glu) ، والمضادات الحيوية البنسلين والستريبتوميسين (50 وحدة / مل).
  2. قطع رأس الجنين الحق تحت خط الفك باستخدام مقص معقم (الشكل 1A، خط منقط أحمر). إزالة الفك السفلي عن طريق إدراج نقطة واحدة من المعقمة غرامة # 5 ملقط في الفم، والاحتفاظ بها فقط داخل الخد. دفع نقطة من ملقط إدراجها من خلال حتى يخرج من الجزء الخلفي من الجمجمة.
  3. توجيه ملقط، على طول الخط الأصفر في الشكل 1B،بحيث الجانب الآخر من ملقط (الذي لا يزال خارج الجنين) تحوم فقط فوق قناة الأذن، ثم قرصة ملقط مغلقة لقطع الأنسجة. إذا لزم الأمر، تشغيل ملقط غرامة أخرى على طول التماس من ملقط مغلقة الآن لقطع من خلال أي الأنسجة التي لم يتم قطعها تماما من قبل قرصة.
  4. كرر الخطوة السابقة للجانب الآخر من رأس الجنين. مواصلة الإجراء قرصة قطع لإزالة الفك السفلي واللسان، وجزء أدنى من الجمجمة وفضح الرفوف الفخمة.
  5. إزالة الجمجمة عن طريق قطع فقط فوق العينين، كما هو مبين في الشكل 1C (الخط الأخضر). القيام بذلك عن طريق وضع الرأس على الجانب الأيسر أو الأيمن ووضع نقاط مقص الفولاذ المقاوم للصدأ الصغيرة أمام وخلف الجمجمة فقط فوق مستوى العين الجنين. قطع الجزء العلوي من الجمجمة مع قصاصة واحدة سريعة من مقص، وخلق سطح مستو من شأنها أن تكون مهمة للاستقرار في خطوات لاحقة، وأنه ينبغي أن تبدو وكأنها الشكل 1D عند النظر إليها من الجانب.
  6. ضع الجزء المتبقي من الرأس رأسا على عقب ، مع الجانب المتفوق من الرأس (إزالة الجمجمة) يستريح مسطحا في الجزء السفلي من الطبق ، مما سيوفر سطحا مستقرا لإزالة الرف الحنكي. خذ لحظة لتحديد الرفوف الفخمة ، والتي تتعرض الآن وتواجه ما يصل وسوف تظهر على اثنين من التلال التي أثيرت على جانبي الأخدود المركزي في النصف الأمامي من الرأس(الشكل 1E).
  7. دبوس الجزء المتبقي من الرأس إلى الطبق لشل الحركة في حين تتم إزالة الرفوف. القيام بذلك عن طريق إدراج نقطة واحدة من ملقط غرامة من خلال الأنسجة بالقرب من منطقة الأنف من الرأس, الأمامي إلى الرفوف الفخمة, وإدراج النقطة الأخرى من ملقط من خلال قاعدة الجمجمة, الخلفي إلى الرفوف الفخمة. عقد هذه في مكان أثناء أداء ختان الرفوف الفخمة.
    1. شل الرأس بيد واحدة، واختيار أي واحد من اثنين من الرفوف لإزالة الأولى، وإدراج كل نقطة من زوج الثاني من ملقط غرامة في الأنسجة في قاعدة السطح الجانبي للجرف، وقرصة لقطع الأنسجة (الشكل 1F). كرر هذا على طول قاعدة سطح الوسيطة من الرف ومن ثم في كل من النهايات الأمامية والخلفية للجرف لفصل من الرأس.
  8. ارفع الرف برفق، مما يجعل قرصات إضافية، حسب الحاجة، لتحرير الرف تماما من الأنسجة المحيطة.
  9. كرر الخطوتين السابقتين لإزالة الرف الحنكي الثاني.
  10. مع الرفوف الفخمة تحررت الآن من الأنسجة المحيطة بها ووضعها في برنامج تلفزيوني (الشكل G), استخدام لمبة بلاستيكية معقمة نقل ماصة لوضع الرفوف في ماصة, ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5mL جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على رفوف فخمة على الجليد كما تتم معالجة بقية القمامة في نفس الطريقة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن وضع الرفوف في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل يحتوي على تريبسين قبل الحرب (0.25٪) مباشرة بعد تشريحه (بدلا من وضعها على الجليد). وستكون العينات أعذب، ولكن يجب توخي الحذر في توقيت جميع خطوات الإجراءات لكل عينة على حدة بدلا من معالجة العينات بشكل جماعي.

3. ثقافة خلايا MEPM

ملاحظة: في ظل الظروف الموضحة هنا، لا تنجو الخلايا الظهارية الحنكية من المقطع الأول، مما يؤدي إلى ثقافة الخلايا الميكنشيمالية الحنكية النقية. استخدام تقنية معقمة لتنفيذ جميع الخطوات في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.

  1. أسبيرات والتخلص من برنامج تلفزيوني من أنبوب 1.5 مل, مع الحرص على عدم تجاهل الرفوف في هذه العملية. إضافة فورا 200 ميكرولتر من prewarmed (37 درجة مئوية) تريبسين (0.25٪) إلى كل أنبوب يحتوي على رفوف فخمة. لفترة وجيزة pipet الرفوف صعودا وهبوطا في التريبسين باستخدام تلميح ماصة 1000 ميكرولتر لتسريع المحاولة.
  2. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، ثم ماصة كل عينة صعودا وهبوطا مرة أخرى للمساعدة في تفريق الأنسجة. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق أخرى في 37 درجة مئوية، وماصة صعودا وهبوطا مرة أخرى لإكمال تفكك الأنسجة.
    ملاحظة: يجب أن تكون الرفوف تماما أو ما يقرب من فصل تماما وعلقت في تريبسين مع عدم وجود قطع مرئية من الأنسجة المتبقية.
  3. أضف 800 ميكرولتر من متوسط ثقافة MEPM (الخطوة 2.1) إلى كل أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي أنبوب 1.5 مل في 200 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. إزالة supernatant، وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة ثقافة MEPM.
  4. صفيح خلايا MEPM في لوحة معالجة بزراعة الأنسجة بشكل جيد تحتوي على وسيط ثقافة MEPM. السماح للخلايا بالالتصاق بالسطح البلاستيكي لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، فإن الغالبية العظمى (~ 90٪) من الخلايا نعلق. عند هذه النقطة، فإن الخلايا الملتزم بها تبدو متجانسة إلى حد ما، مع شكل مثلث أو ممدود قليلا.
  5. تغيير المتوسطة كل يوم عن طريق استباقة بلطف المتوسطة القديمة واستبدالها على الفور مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم دافئ دون الكالسيوم أو المغنيسيوم ل ~ 1 دقيقة. يستنشق برنامج تلفزيوني ، واستبدال 3 مل من المتوسطة ثقافة MEPM prewarmed.
  6. مرور الخلايا بمجرد أن تصبح التقاء 100٪.
    ملاحظة: يجب أن تتكاثر خلايا MEPM عن طريق مضاعفة العدد يوميا تقريبا.
    1. لتمرير الخلايا، يستنشق بلطف المتوسطة القديمة، وعلى الفور استبداله مع برنامج تلفزيوني دافئ دون الكالسيوم أو المغنيسيوم ل ~ 1 دقيقة. يستنشق برنامج تلفزيوني، واستبداله مع 0.5 مل من prewarmed 0.25٪ تريبسين.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية ل ~ 5 دقيقة، أو حتى الخلايا تنفصل عن سطح الطبق عندما هزت بلطف ذهابا وإيابا باليد. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف على الفور 5 مل من وسيط ثقافة MEPM قبل الحرب إلى الخلايا المريبة.
    3. باستخدام أنبوب مصلي 10 مل، وجمع بلطف الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي الأنبوب في 200 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. يستنشق التريبسين والمتوسطة، وإعادة إنفاق الخلايا في 3 مل من المتوسط ثقافة MEPM prewarmed. ماصة بلطف 1 مل من الخلايا في بئر واحد من طبق 6-جيدا، وإضافة 2 مل من المتوسطة ثقافة MEPM ليصل إجمالي حجم إلى 3 مل.
      ملاحظة: هذا يشكل انقسام 1:3 من الخلايا. يمكن تمرير MEPMs حتى ثلاث مرات. كثافة البذر من MEPMs مرنة إلى حد ما، وعدد الخلايا الموجودة يختلف تبعا للوعاء زراعة. ومع ذلك ، لا تتكاثر MEPMs بشكل صحيح عند تقسيمها بشكل متفرق للغاية ويجب أن تكون التقاء 20-25٪ على الأقل في طبقها الجديد بمجرد التزامها.

4. التبريد من خلايا MEPM

  1. مرة واحدة يتم بيليه خلايا MEPM جرب، resuspend الخلايا في المتوسطة ثقافة MEPM للحصول على تركيز ~ 1 × 106 خلايا / مل. Pipet الخلايا في cryovials، وإضافة تركيز النهائي من 5٪ dimethylsulfoxide في مخزون الخلية. قم بوضع غطاء للكظر، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق عكس اتجاهه، وضع القنينات على الفور في حاوية تجميد تبرد بمعدل 1 درجة مئوية/دقيقة.
  2. ضع المبرد في ثلاجة -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل cryovials إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  3. ذوبان cryopreserved خلايا MEPM
    1. إزالة cryovials من خزان النيتروجين السائل، وتذوب في درجة حرارة الغرفة حتى تبدأ محتويات لتصبح سائلة. إفراغ المحتويات في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 9 مل من وسيط ثقافة MEPM قبل الحرب.
    2. الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لبيليه الخلايا. Resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسطة ثقافة MEPM، وماصة الخلايا في بئر واحد من لوحة 6-جيدا. أضف 2 مل من متوسط ثقافة MEPM الدافئة ليصل إجمالي الحجم إلى 3 مل.
    3. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2. تغيير المتوسطة يوميا.

5. التصوير الحي للخلايا MEPM -- 2D الهجرة الجماعية المقايسة (الشكل 2)

  1. إعداد لوحة لاستخدامها للتصوير الحي.
    1. استخدام مقص جراحي صغير أو مشرط حاد لتقصير إدخال سيليكون معقم 2-جيدا إلى ارتفاع ~ 1 ملم. قم بإعداد إدراج لكل عينة قيد الاستخدام.
    2. باستخدام ملقط، ضع إدراج السيليكون تقصير 2-جيدا في وسط بئر من لوحة 6-جيدا. اضغط لأسفل على طول جميع الحواف لضمان الالتزام الكامل بها.
  2. تذوب الخلايا المبردة باتباع الخطوات الواردة في القسم 4.3 من هذا البروتوكول. عد MEPM الخلايا، والبذور 300 خلايا / مم2 من إدراج السيليكون تقصير في حجم إجمالي قدره 40-50 ميكرولتر MEPM الثقافة المتوسطة لكل بئر. زراعة الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2.
  3. في اليوم التالي، استعد للتصوير الحي بفاصل زمني.
    1. استخدم مجهر تباين المرحلة مع حاضنة على المسرح وقدرة تصوير تلقائية. إضافة المياه إلى خزان حاضنة على خشبة المسرح للحد من تبخر وسط الثقافة؛ تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وCO 2 إلى 5٪. السماح ~ 30 دقيقة للرطوبة لبناء قبل وضع طبق 6-جيدا في حاضنة على خشبة المسرح.
  4. استخدم إعدادات مساوية لما يلي للتصوير الفاصل الزمني.
    1. حدد الهدف 4x أن يكون حقول كبيرة من العرض ومرشح التباين المرحلة.
      ملاحظة: التركيز البؤري التلقائي، عينة البحث التلقائي، z-المكدس، والإضاءة التلقائية ليست ضرورية عادة.
    2. حدد حقلين مجهريين لكل بئر لالتقاط تجويف إدراج السيليكون المختصر. تأكد من أن جميع مواقع التصوير لديها التركيز الصحيح.
      ملاحظة: يمكن ضبط مستويات الصورة أثناء التصوير، ولكن هذا التعديل ليس ضروريا عادة.
    3. حدد نوع ملف إخراج الصورة المطلوب، ثم حدد خيارات ما بعد التصوير أو قم بإلغاء تحديدها، مثل إنشاء الفيديو التلقائي والعلامات المائية، حسب الرغبة. حدد تباين المرحلة كوضع تصوير إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظة: قد يؤدي استخدام العلامات المائية إلى إعاقة خطوات معالجة الصور اللاحقة.
    4. تعيين مدة التسجيل إلى 72 ساعة. قم بتعيين البرنامج لالتقاط الصور كل 10 دقائق.
      ملاحظة: عادة ما يكون التصوير 48 ساعة فقط مطلوبا، ولكن يمكن إيقاف التصوير في أي وقت قبل علامة 72 ساعة دون فقدان الصور التي تم التقاطها بالفعل.
    5. تأكد من أن الغرفة البيئية تعمل كما هو مطلوب في 5.3.1. حفظ هذهالإعدادات (الروتين)وبدء التصوير.
  5. استمر في التصوير حتى 72 ساعة (أو الوقت المحدد).

6. التصوير الحي للخلايا MEPM في فحص إصلاح الجرح (الشكل 3)

  1. إعداد لوحة لاستخدامها للتصوير الحي. باستخدام ملقط، ضع إدراج السيليكون العقيم 2-جيدا في وسط بئر من لوحة 6-جيدا، واضغط باستمرار على طول جميع الحواف لضمان الالتزام الكامل به. إعداد إدراج واحد 2-جيدا لكل عينة المستخدمة.
  2. تذوب الخلايا المبردة باتباع الخطوات الواردة في القسم 4.3 من هذا البروتوكول. عد خلايا MEPM، وإذا لزم الأمر، ركز الخلايا على ما لا يقل عن 350 خلية/ميكرولتر.
  3. البذور 1400 خلايا / مم2 في إدراج السيليكون في حجم 100 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة MEPM لكل بئر. زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2،وتغيير المتوسطة كل يوم.
  4. بعد 48 ساعة إعداد المجهر للتصوير الحي الفاصل الزمني كما هو موضح في القسمين 5.3 و 5.4. مباشرة قبل وضع الخلايا في حاضنة على خشبة المسرح، إضافة 3 مل من المتوسطة ثقافة MEPM prewarmed إلى البئر (ولكن خارج إدراج)، ومن ثم إزالة بعناية إدراج السيليكون.
    ملاحظة: الجدار الفاصل بين الغرفتين يترك فجوة هي "الجرح".
  5. بدء التصوير الفاصل الزمني كما هو موضح في 5.4، مع الاختلافات التالية:
    1. استخدم هدف تكبير أعلى (على سبيل المثال، 10x). لالتقاط إغلاق الجرح، حدد 5 حقول رؤية على طول كل جرح، بحيث يكون الجرح موازيا للمحور الرأسي للصورة.
  6. توقف عن التصوير بعد 72 ساعة أو عندما تكون الجروح قد أغلقت بالكامل.

7. التحليل الحسابي لتسلسلات الصور الفاصلة زمنيا

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات التالية على جهاز كمبيوتر مجهزة أدوات حسابية قياسية، مثل مترجم بيثون، مترجم C، و shell (راجع جدول المواد).

  1. تحليل الالتقاء
    ملاحظة: يمكن استخدام هذا الإجراء لتقدير انتشار الخلايا ضمن ثقافة متناثرة أو لتحديد تجارب إغلاق الجرح. للكشف عن المناطق التي تشغلها الخلايا، يتم تطبيق عتبة تجزئة على الانحراف المعياري المحلي لسطوع الصورة. وقد سبق وصف المدونة من قبل وو وآخرون33 ونيوفيلد وآخرون34 وهي متاحة في http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. تحديد عتبة التجزئة للصور. كمثال، لرؤية التقسيم مع عتبة 4، إصدار الأمر
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4-إخراج الاختبار.jpg
      ثم تحقق من الإخراج (الإخراج.jpg).
      ملاحظة: إذا كانت العتبة منخفضة جدا، يتم تصنيف مناطق الخلفية في ميكروجراف كخلايا مغطاة. وعلى النقيض من ذلك، إذا كانت العتبة مرتفعة جدا، لا تصنف المناطق المغطاة بالخلايا على هذا النحو. القيمة الحد الأمثل يحتفظ كلا الخطأين في الحد الأدنى.
    2. استخدم النص area.sh المتوفر لحساب قيم الالتقاء لتسلسل الصور ك
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > التقاء.dat
      ملاحظة: يتم التحقق من قيمة عتبة التمييز 4 في الخطوة 1، ويتم تخزين النتائج في التقاء الملف.dat. عن طريق فرز الصور في المجلدات المناسبة، يمكن استبدال قائمة أسماء ملفات الصور ببطاقة البدل:
      area.sh -S4 * .jpg > التقاء.dat
    3. بالنسبة لتجارب إغلاق الجروح، قم بتحويل بيانات الالتقاء A(t)- حجم المنطقة المغطاة بالخلايا المعبر عنها كنسبة مئوية كدالة لسرعة الانتشار V من الوقت إلى حافة الجرح ك
      Equation 1
      حيث يشير w إلى عرض الحقل وdA/dt هو مشتق الوقت ل A(t)، أي معدل توسيع المنطقة المغطاة بالخلايا.
  2. خريطة حركة الخلية
    1. تنفيذ خوارزمية قياس سرعة تصوير الجسيمات (PIV) لتوصيف حركة الخلية، واستخراج مدى الحركة المحلية "التدفق البصري" بين أزواج الصور، ولكن ليس لتحديد الخلايا الفردية.
      ملاحظة: هنا، يتم استخدام حجم نافذة أولية من 50 ميكرومتر، كما هو موضح بالتفصيل من قبل زامير وآخرون35 وCzirokوآخرون. ينتج عن تحليل PIV حقل سرعة v(x,t) لكل إطار صورة t وموقع (داخل الصورة) x.
    2. استخراج متوسط سرعة حركة الخلية من v(x,t) كمتوسط مكاني محسوب فوق المساحة المحتلة للخلية، كما هو محدد في القسم 7.1.
  3. تعقب الخلايا اليدوي
    ملاحظة: بينما يوفر تحليل PIV تقييما تلقائيا لحركية الخلية، فإن التركيز على سلوك الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التتبع اليدوي. في حين توفر العديد من الأدوات هذه الوظيفة، من المفيد جدا إذا كان يمكن تعديل علامات وضعه يدويا بعد موضعها الأولي، وإذا كان يمكن تنفيذ تتبع سواء إلى الأمام والخلف في الوقت المناسب.
    1. قم بإجراء تعقب الخلايا باستخدام أداة python المطورة خصيصا (http://github.com/donnagreta/cm_track) ، والتي توفر أيضا وظائف المحرر الأساسية مثل حذف شرائح المسار.
      ملاحظة: هذه الأداة تتبع اليدوية ينتج المواضع P(i,t) الخلية i في وقت t في ملف نصي، واستدعاء ك
      cm_track.py -i الصور / -o المسار.dat
      حيث الصور الفاصل الزمني في الصور المجلد / ويتم جمع البيانات موقف في مسار الملف.dat (الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4:تحليل مسارات الخلايا الفردية. (أ) يتم عرض صور دقيقة الفاصل الزمني على النقيض من المرحلة إلى ( B، C) إجراء تتبع يدوي ، والذي يميز الخلايا (النقاط الخضراء). (د)يتم تخزين مواقع الخلية (س، ص) لكل خلية تتميز برمزها ولكل إطار f. (E) يمكن تراكب المسارات على الصور الدقيقة وترمز إلى اللون للإشارة إلى المعلومات الزمنية. وكمثال على ذلك، في كل مسار، تشير لوحة الألوان من الأزرق إلى الأحمر إلى شرائح المسار اللاحقة تدريجيا، مع وضع علامة حمراء وزرقاء على مواقع الخلايا الأولية والأخيرة على التوالي. (F)يمكن استخراج الخصائص الإحصائية المختلفة للمسارات، مثل متوسط الإزاحة المربعة، واستخدامها لتوصيف حركة مجموعات الخلايا المختلفة، والتي تشمل في هذا المثال النوع البري (wt، الأزرق)، والضربات القاضية (kd، الأحمر) خلايا MEPM. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. مسارات التراكب على الصور باستخدام أداة ثانية، يتم استدعاؤها ك
    visdat.py -d المسار.dat -i الصور / -س تراكب / -l999 -r3 -C2
  2. جمع الصور مع مسارات مضافا في تراكب المجلد.
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم تخزين بيانات موضع الخلية في مسار الملف.dat،بينما تسلسل الصورة الفاصل الزمني داخل صور المجلد. تتحكم بقية المعلمات في الطول الأقصى للمسارات المرسومة (-l)، وحجم الرموز (-r)، ونظام الألوان (-C) المستخدم.
  1. تحليل مسارات الخلايا الفردية
    1. تميز المسارات بطول المسار الإجمالي
      Equation 2,
      و صافي الإزاحة نحو الجرح
      Equation 3,
      حيث X يدل على إسقاط P في الاتجاه عمودي على الجرح: تنسيق س من المواقف عندما يكون الجرح موازيا لمحور ص.
    2. حساب كفاءة التوجيه كما هو الحال Equation 4 بالنسبة لكل خلية ط والوقت نقطة ر37. تميز الثقافات حسب متوسط عدد السكان لهذه التدابير خلية واحدة، وتقييمها في نقطة زمنية مناسبة ر.
  2. حركة تدفق جماعية للخلايا
    1. تميز الارتباطات المكانية المحلية لحركات الخلايا بمتوسط سرعة الخلايا الأخرى التي تقع بالقرب من خلية متحركة ، كما هو موضح سابقا38،39.
      ملاحظة: يتوفر التعليمات البرمجية الحسابية في https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. محاذاة نظام مرجعي مع الاتجاهات الأمامية والخلفية واليسارية واليمينية لكل متجه v(x,t) (الشكل 5A). تعيين كل من الخلية المحيطة أو PIV متجه السرعة إلى الخلية المكانية المناسبة للنظام المرجعي(الشكل 5B). كرر الإجراء كما يخدم كل متجه كمنشأ النظم المرجعية (الشكل 5C، D) بحيث يتم تعيين متجه سرعة معينة إلى صناديق متعددة.
        ملاحظة: قد تكون نقطة بيانات أمام متجه، و إلى يسار واحد آخر.
      2. تدوير النظم المرجعية في اتجاه مشترك (الشكل 5C، F) وتجمع لهم ( الشكل5G).
        ملاحظة: متوسط كل سلة من بيانات السرعة المجمعة هو متجه السرعة(U)الذي يدل على الارتباط المكاني: المتوسط هو مقياس لمكون السرعة المشتركة(الشكل 5H).
      3. تناسب حقول تدفق U(x) مع دالة Equation 5 أسية ، حيث a و x0 و U0 هي المعلمات المناسبة. من بين المعلمات الثلاثة المناسبة، ركز على x0، طول الارتباط (الشكل 5I، J)، وهي المسافة المميزة التي تختفي فيها الارتباطات بين السرعة والسرعة المحلية.

Figure 5
الشكل 5: يتم استخدامتوصيف تشكيل تيار من الخلايا المستزرعة. (A, D) المرحلة النقيض من الوقت الفاصل الصور من الشكل 4A لتحديد حركات الخلية. لكل خلية متحركة، تم محاذاة إطار مرجعي (أزرق) وصناديق مكانية (بيضاء) لتصنيف الخلايا المجاورة على أنها في الأمام أو الخلف أو اليسار أو اليمين. (B, E) سرعة الخلايا المجاورة (ناقلات سوداء) كانت مرتبطة بنفس الإطار المرجعي(C, F). تم تكرار هذا الإجراء لكل خلية ونقطة زمنية. (G)بعد تجميع هذه المعلومات المحلية، كل سلة سوف تحتوي على ناقلات سرعة متعددة (رمادي)، والتي يمكن أن تكون متوسطة لتحديد متوسط سرعة الحركة المشتركة (أسهم أرجواني) في مواقع مختلفة بالنسبة لخلية متوسطة الحركة. (H)وخريطة السرعة المتوسطة وبالتالي يميز سرعات الخلية النموذجية في مواقع مختلفة بالنسبة لخلية متحركة. (I,J) وأخيرا، تم أخذ عينات من هذا الحقل على طول المحور الأمامي الخلفي (الموازي) وكذلك على طول المحور الأيسر واليميني (المتعامد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتضح تشريح الرفوف الفخمة في الشكل 1. تم تصميم تسلسل الشقوق لتقليل انزلاق الأنسجة. بعد إزالة الرأس (الشكل 1A، B)، تتم إزالة الفك السفلي ( الشكل1B، C). شق الجزء العلوي من الرأس (الشكل 1C, D) يتم لتحقيق الاستقرار في الأنسجة عند وضعها رأسا على عقب ( الشكل1E) لتصور (الشكل 1E, خطوط منقط), قرصة (الشكل 1F), والمكوس (الشكل 1G) الرفوف الفخمة.

يتم تجريب زوج الجرف الحنكي المقتطع من جنين واحد وتثقفه في طبق 35 ملم أو في بئر من طبق من 6 آبار. لا يفضل الأطباق الكبيرة لأن كثافة الخلايا منخفضة جدا للنمو الأمثل. عند التقاء، يتم تجريب الخلايا من كل بئر وتمريرها إلى ثلاثة آبار مكافئة 35 ملم (مرور # 1). يمكن بعد ذلك تجميد الخلايا الالتقاء من مرور # 1 وصولا الى aliquots من 1 × 106 خلايا / مل. يتم إحضارها في وقت لاحق aliquots المجمدة في طبق مكافئ 35 ملم ونمت إلى التقاء. ثم يتم تجريب الخلايا (مرور # 2) وبذر وفقا للتجربة. ساعد إنشاء واستخدام aliquots المجمدة لتطبيع الظروف، وخاصة فيما يتعلق بكثافة الخلية. أدى استخدام خلايا MEPM الطازجة إلى مزيد من التباين في كثافة الخلايا النهائية في التجارب ، والتي يعتقد أنها ترجع إلى نسبة متغيرة من الخلايا القابلة للحياة أو شبه القابلة للحياة في الثقافات الطازجة. بالإضافة إلى ذلك، اقتصر عدد مقاطع الخلية MEPM بشكل صارم على مقطعين (مدرجين أعلاه) لهذه التجارب.

وبالنظر إلى أن أ) كثافة الخلية كانت حرجة، ب) كانت خلايا MEPM من جنين واحد محدودة، و ج) البصريات التصوير كانت أفضل في طبق كبير، واستخدمت إدراج السيليكون 2 جيدا (الشكل 2 والشكل 3). بالنسبة لمقاايسات إصلاح الجروح ، نمت خلايا MEPM في إدراج السيليكون 2-well حتى التقاء عال ، ثم تمت إزالة الإدراجات ، وتم تصوير الجرح حتى الإغلاق(الشكل 3). ومع ذلك ، بالنسبة للثقافة 2D ، احتاجت خلايا MEPM إلى التصوير أثناء نموها ، لذلك تم ببساطة تشذيب إدراج السيليكون 2-well إلى 1/3rd من ارتفاعها للسماح بالتصوير الواضح(الشكل 2C). كما استخدمت حلقات صغيرة مطبوعة ثلاثية الأبعاد40 في أطباق 35 ملم لتحليل الحركة 2D(الشكل 2D).

مسارات MEPM(الشكل 4E)مستمرة: يتم الحفاظ على اتجاه حركة الخلية لعدة ساعات. يشير متوسط الإزاحة مقابل تحليل الوقت(الشكل 4F)إلى أن الثبات في شكل النزوح يتناسب مع الوقت المنقضي. السرعة النموذجية للخلايا MEPM على سطح البلاستيك ثقافة الأنسجة، 10 ميكرومتر / ساعة، ويمكن أيضا أن تستخدم لمراقبة جودة ثقافة الخلية. تحليل تدفق البيانات الحركة يكشف أن مجموعات متحركة مشتركة من خلايا MEPM هي ~ 300 ميكرومتر في الحجم (الشكل 5I، J). وتشير النتائج التمثيلية أيضا إلى وجود فرق عميق في الحركة بين خلايا MEPM البرية والمتحولة. بالإضافة إلى المقارنة بين النوع البري والمتحولة ، يمكن الجمع بين كل من المقايسات 2D وإصلاح الجروح مع العلاجات الكيميائية الحيوية المختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام منشطات مسار PI3K-AKT مع خلايا MEPM، كما هو موضح سابقا 21.

Figure 1
الشكل 1:تشريح الرفوف الحنكية الجنينية لعزل الخلايا الميكنشيمالية. (أ) تتم إزالة رأس جنين فأر E13.5 عن طريق قطع الرقبة (الخط الأحمر). (ب) بعد ذلك، تتم إزالة الفك السفلي واللسان مع شقوق على طول تجويف الفم، بين الفكين العلوي والسفلي (الخط الأصفر). (ج) لتثبيت الأنسجة لإزالة الجرف الحنكي، يتم استئصال الجزء العلوي من الرأس (الخط الأخضر). (D) يتم وضع منطقة الفك العلوي تشريح الناتجة (E) رأسا على عقب لتصور الرفوف الفخمة (خطوط منقط أسود). (F)يتم تصوير استئصال الرفوف الفخمة الفردية تخطيطيا، حيث يتم قرص الرفوف البارزة الفردية (الأصفر) قبالة من maxilla (الأزرق). (G) زوج من الرفوف المقتطعة من جنين واحد ، والتي يمكن بعد ذلك أن تكون جربسينيد ومثقفة في طبق 35 ملم أو في لوحة 6-جيدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الإعداد التجريبي للثقافة الخلية 2D MEPM. (أ) تذوب aliquot المجمدة من خلايا MEPM، و (ب) ثقافة الخلايا في طبق 35 ملم أو لوحة 6-جيدا. عند التقاء، جرب الخلايا والبذور لهم كما هو موضح في البروتوكول في طبق 35 ملم إما مع (C) 2-جيدا إدراج السيليكون التي تم قلصت أو (D) مع حلقات مطبوعة 3D. مساحة صغيرة الثقافة يقلل من الحاجة إلى أعداد كبيرة من خلايا MEPM. يسمح البروز المنخفض لإدراج السيليكون المشذب أو الحلقات المطبوعة ثلاثية الأبعاد بالتصوير المباشر دون تأثير هالة. يمكن أن يستمر التصوير الفاصل الزمني حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة ، والتي يمكن أن تصل إلى 72 ساعة. وتظهر الصور التمثيلية في (E) 0 ساعة، (F) 24 ساعة، و (G) 45 ساعة timepoints. تم التقاط الصور باستخدام هدف 4x. أشرطة المقياس ل E، F، G = 300 ميكرومتر. الاختصارات: 2D = ثنائي الأبعاد؛ MEPM = الماوس الجنينية mesenchyme؛ 3D = ثلاثي الأبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الإعداد التجريبي للجرح إغلاق المقايسة باستخدام خلايا MEPM. (أ) تذوب أكوت المجمدة من الخلايا MEPM، و (ب) خلايا الثقافة في طبق 35 ملم أو لوحة 6-جيدا. عند التقاء، جرب الخلايا و (C) البذور لهم في إدراج السيليكون 2 جيدا في طبق 35 ملم. ثقافة الخلايا في إدراج حتى يتحقق التقاء المطلوب (~ 48 ساعة)، ثم إزالة إدراج السيليكون والصورة. وتظهر الصور التمثيلية(D)مباشرة بعد إزالة إدراج،(ه) بعد 24 ساعة، و (F) بعد 40 ساعة. إغلاق الجرح يستغرق حوالي 36 ساعة. تم التقاط الصور باستخدام هدف 10x. يمثل شريط المقياس 300 ميكرومتر. الاختصارات: MEPM = الماوس الجنينية mesenchyme. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ارتفاع الجرف بالاتال يشكل الرأسي إلى الأفقي إعادة عرض الحدث1،3،4،9،11. ومن المسلم به أن هذه العملية إعادة عرض يتطلب الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي أن تتصرف بشكل تنسيقي. تظهر التحليلات مع خلايا MEPM البرية أن سلوك الخلية هذا جوهري ويمكن أن يكون كمي21. وهكذا، يمكن استخدام هذه المقايسات للكشف عن عيوب ارتفاع الجرف الفخم الأولية في نماذج الماوس الجديدة والقائمة من الحنك المشقوق. يجب أن تسمح الطرق الموضحة في القسمين 1 و 2 للمحققين بعزل الخلايا الأولية MEPM واستزراعها وتجميدها. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الثقافة 2D ومقاايسات إصلاح الجروح الموصوفة هنا. الثقافة 2D، عندما يقترن التصوير الفاصل الزمني، ويقدم طريقة بسيطة لتحديد سمات الخلية الأساسية على مدى مجموعة من كثافات الخلايا. هنا هو وسيلة لتقييم محاذاة الخلية وتشكيل تيار الخلية ، والتي هي سمات حركة الخلية الجماعية(الشكل 4). وتستخدم عادة الجروح إغلاق المقايسات لتقييم هجرة الخلايا41،42،43. توفر المنطقة الخالية من الخلايا من "الجرح" إشارة للحركة الاتجاهية للخلايا في المحيط. وسمح تصوير هذه العملية بفارق زمني بتحديد وتقييم مسارات الخلايا أثناء الهجرة. تحدد مسارات الخلية هذه بدورها سرعة هجرة الخلية واتجاهها (الشكل 5).

من المهم أولا تحسين الظروف للثقافة والمقاولات باستخدام خلايا MEPM البرية فقط. بعد أن تم تجريب الرفوف الفخمة بنجاح وتعليق الخلية الواحدة الناتجة مطلية بين عشية وضحاها، فإن الغالبية العظمى (~ 90٪) من الخلايا نعلق بسهولة على سطح النمو من الطبق. إذا كانت الخلايا لا تلتزم بسهولة، ثم قد يكون هناك شيء خاطئ مع ظروف الثقافة. في البداية ، فإن الخلايا الملتزم بها تبدو متجانسة إلى حد ما ، مع شكل مثلث أو ممدود قليلا ، ولكن مع نموها إلى كثافة عالية ، تصبح أكثر مغزلا على شكل وممدود(الشكل 2). إذا أصبحت الخلايا كبيرة الحجم بشكل كبير أو متعددة النوى ، فلا ينبغي استخدامها للتجارب. هذا التحسين سوف تحدد أيضا المعلمات البرية الأساسية للنمو الناجح (الوقت لالتقاء) وإصلاح الجرح (الوقت لإغلاق). يجب أن تتكاثر الخلايا عن طريق مضاعفة العدد بشكل يومي تقريبا وفي الصور الفاصلة زمنيا ، وإظهار الحركة من ~ 5-10 ميكرومتر / ساعة. وبالمثل، إذا لم يتم الوفاء بهذه المعلمات الأساسية في أي تجربة لاحقة تنطوي على مقارنة بين النوع البري والمتحولة من قبل خلايا النمط البري، فقد تحتاج التجربة إلى استبعادها من التحليل. على سبيل المثال، تستغرق خلايا MEPM البرية 36-40 ساعة لإغلاق الجرح تماما باستخدام إدراج السيليكون 2-جيدا. إذا في تجربة، خلايا البرية يستغرق وقتا أطول بكثير من 40 ساعة لإغلاق الجرح، فإن التجربة بأكملها تكون مشبوهة. قد يكون ضعف الأداء من خلايا MEPM بسبب 1) سوء جودة aliquot المجمدة، 2) انتعاش الفقراء، أو 3) التمايز المفرط. يمكن الكشف عن الخلايا المتمايزة أو الحساسة بصريا لأنها تنمو كبيرة جدا ولا تنقسم. وينبغي تجنب ثقافة مع عدد كبير من هذه الخلايا. بشكل عام، يجب أن لا تكون هناك خلايا غير طبيعية في مجال الرؤية لهدف 10x(الشكل 3)؛ خلية أو اثنتين خارج مجال الرؤية لا ينبغي أن تؤثر ماديا على التحليل. تقييد التحليل إلى مقاطع خلية اثنين فقط (أعلاه) يساعد بشكل كبير في الحفاظ على جودة خلايا MEPM.

بالنسبة لكل من الثقافة 2D و المقايسات إصلاح الجروح باستخدام خلايا MEPM الأولية، كان الشرط الرئيسي للنجاح كثافة الخلايا الأولية عالية. تم تحديد هذا الشرط لأول مرة أثناء تحسين فحص إصلاح الجروح الذي تم فيه زرع الخلايا في >1400 خلية / مم2. ثم تم استخدام كثافة الخلايا المهاجرة إلى الجرح ككثافة البذر في المقايسات الثقافية 2D. شكلت كثافة البذر من ~ 300 خلية / مم2 تيارات الخلية ، في حين لا تزال تسمح للتحليل الآلي لمسارات الخلية. الكثافات أعلى من 300 خلية / مم2 تميل إلى تشكيل تيارات أكثر حيوية التي يمكن تصورها بالعين، ولكن جعل تتبع الخلايا الفردية صعبة. عند مقارنة الخلايا الأولية MEPM من الأجنة البرية والمتحولة، على الرغم من أنه يمكن تقييم تأخير إغلاق الجرح دون تحليل حسابي، قد لا تكون الاختلافات في تكوين المجرى والاتجاه ملحوظة بالعين. إذا كانت كثافة الخلية عالية جدا أو كانت جودة الصورة ضعيفة/غير واضحة، على سبيل المثال بسبب فقدان التركيز، فقد يكون تتبع الخلية الآلي صعبا. في مثل هذه الحالة، من الممكن استخدام تتبع الخلايا اليدوي لتحديد مسارات الخلايا في فحوصات إصلاح الجروح باستخدام ImageJ. ويمكن أيضا استخدام تركيز منخفض جدا من البقع النووية Hoechst (3 ميكرولتر / مل من محلول 20 mM في المتوسطة ثقافة MEPM) لتسهيل تتبع الخلية؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون سمية الليزر الفلورية مشكلة مع الاستخدام الموسع.

للتتبع اليدوي ، كان من الأسهل تتبع الخلايا في الاتجاه المعاكس من نهاية إغلاق الجرح إلى الوراء قدر الإمكان حتى حجبت كثافة الخلايا العالية المزيد من التتبع. حتى مسارات الخلايا الجزئية، عندما تم دمجها تجمعات الخلايا، كانت مفيدة. وعلى النقيض من فحوصات إصلاح الجروح، يلزم تتبع الخلايا الآلي لتحليل زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، وهو أحد الأسباب التي تم من أجلها اختيار كثافات الخلايا المتوسطة. وأخيرا، يمكن استخدام التحليلات الأولية الحساسة القائمة على MEPM لتحديد المركبات والمسارات التي قد تؤثر على ارتفاع الحنك. أشارت الدراسات السابقة إلى أن تنشيط مسار PI3K-AKT حسن سرعة الخلية واتجاه خلايا SPECC1l MEPM المتحولة21. وقد استخدمت دراسات MEPM أخرى أيضا عامل النمو المختلفة أو العلاجات الدوائية لتحفيز الشلالات الإشارات المصب أو لتقييم الانتشار22،29،30،44،45. وهكذا، توفر التحليلات المستندة إلى MEPM طريقة سريعة لتحديد العديد من العوامل التنظيمية الأكثر إيجابية أو سلبية، والتي يمكن التحقق من صحتها بعد ذلك في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا المشروع جزئيا المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة DE026172 (I.S.)، وGM102801 (A.C). كما تم دعم I.S. جزئيا من منحة مركز التميز البحثي الطبي الحيوي (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM104936)، ومنحة امتياز أبحاث البحوث الطبية الحيوية من كانساس IDeA (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM103418)، ومنحة مركز كانساس لأبحاث الإعاقات الذهنية والتنموية (KIDDRC) (U54 يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 168، تكوين الخلايا، الحنك المشقوق، ارتفاع الحنك، الخلايا الميكنشيمالية الأولية، هجرة الخلايا، إصلاح الجرح، التصوير الفاصل الزمني، تشكيل تيار الخلية، حركة الخلية الجماعية، حركة الخلية المنسقة
العزلة والتصوير الفاصل الزمني لخلايا ميسنشيم الجنينية للفأر الأولي لتحليل سمات الحركة الجماعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter