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Bioengineering

अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिका संस्कृति के लिए एक क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज एम्बेडेड Agarose Biomaterial स्याही का निर्माण

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62519
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Summary

यह प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता और सेल सतह रिसेप्टर्स, किट (CD117) और उच्च-आत्मीयता IgE रिसेप्टर्स (FcπRI) की फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति के संदर्भ में माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं के साथ एक क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज (सीएनसी) / एगारोज़ समग्र हाइड्रोजेल बायोमैटेरियल स्याही की जैव संगतता का तेजी से आकलन करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डाला गया है।

Abstract

त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग हाइड्रोजेल-आधारित कंपोजिट (या बायोमटेरियल इंक) का उपयोग करता है जो एक पैटर्न में जमा होते हैं, जिससे एक सब्सट्रेट बनता है जिस पर कोशिकाएं जमा होती हैं। क्योंकि कई biomaterial स्याही संभावित रूप से प्राथमिक कोशिकाओं के लिए साइटोटॉक्सिक हो सकता है, महंगी 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग प्रक्रियाओं में उनके उपयोग से पहले इन हाइड्रोजेल कंपोजिट की जैव संगतता निर्धारित करना आवश्यक है। बायोप्रिंटिंग सहित कुछ 3 डी संस्कृति विधियों के लिए कोशिकाओं को 3 डी मैट्रिक्स में एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है, जिससे यांत्रिक क्षति को प्राप्त किए बिना व्यवहार्यता और बायोमार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए कोशिकाओं को निकालना और विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। यह प्रोटोकॉल अवधारणा के प्रमाण के रूप में वर्णन करता है, एक क्रिस्टलीय नैनोसेल्युलोज (सीएनसी) एम्बेडेड एगारोज़ कंपोजिट की जैव संगतता का आकलन करने की एक विधि, माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं (बीएमएमसी) के साथ 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्रणाली में निर्मित, सेल व्यवहार्यता और बायोमार्कर अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक एसेस का उपयोग करके।

सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल मैट्रिक्स के संपर्क में आने के 18 घंटे के बाद, बीएमएमसी व्यवहार्यता को प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) पारगम्यता द्वारा मापा गया था। हालांकि, CNC / agarose / D-mannitol सब्सट्रेट पर सुसंस्कृत BMMCs उच्च-आत्मीयता IgE रिसेप्टर (FcπRI) और स्टेम सेल फैक्टर रिसेप्टर (किट) की अपनी अभिव्यक्ति को थोड़ा बढ़ाने के लिए दिखाई दिए; CD117), हालांकि यह bioink समग्र में सीएनसी की मात्रा पर निर्भर करने के लिए प्रकट नहीं होता है। बीएमएमसी की व्यवहार्यता का मूल्यांकन हाइड्रोजेल मचानों के लिए एक समय पाठ्यक्रम के जोखिम के बाद भी किया गया था जो 3 डी एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटर का उपयोग करके फाइब्रिलर नैनोसेल्यूलोज (एफएनसी) और सोडियम एल्जिनेट से बने एक वाणिज्यिक बायोमटेरियल स्याही से निर्मित थे। 6-48 घंटे की अवधि में, FNC / alginate substrates ने बीएमएमसी की व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं किया जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोटिटर एसेस (एक्सटीटी और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज) द्वारा निर्धारित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक कुशल विधि का वर्णन करता है तेजी से उनकी उपयोगिता के लिए उम्मीदवार biomaterial स्याही के जैव रासायनिक संगतता स्क्रीन के रूप में 3 डी scaffolds मस्तूल कोशिकाओं के साथ पोस्ट प्रिंट सीडिंग के लिए.

Introduction

3 डी संस्कृति प्रणालियों और 3 डी बायोप्रिंटिंग में हाल ही में रुचि ने हाइड्रोजेल और हाइड्रोजेल कंपोजिट पर ध्यान केंद्रित किया है। ये कंपोजिट चिपचिपा अभी तक झरझरा बायोमिमेटिक्स के रूप में काम करते हैं और वजन से 99% पानी की सामग्री से बने हो सकते हैं, जो जैविक ऊतकों 1,2,3 के बराबर है। हाइड्रोजेल कंपोजिट की ये विशेषताएं इस प्रकार उनकी व्यवहार्यता और कार्य को प्रभावित किए बिना कोशिकाओं के विकास की अनुमति देती हैं। ऐसा ही एक समग्र क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज (सीएनसी) है, जिसका उपयोग हाइड्रोजेल कंपोजिट में एक मजबूत सामग्री के रूप में किया गया है, बायोमैटेरियल प्रत्यारोपण के विकास में सेल मचान, और दो-आयामी (2 डी) और 3 डी इन विट्रो सेल कल्चर 4,5 में। अधिकांश भाग के लिए, सीएनसी से बने आव्यूह मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं 6, आंतों के उपकला कोशिकाओं 7, मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल 8, या न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं 9 के लिए अत्यधिक साइटोटॉक्सिक नहीं हैं। हालांकि, चयापचय गतिविधि और मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का प्रसार लकड़ी-आधारित नैनोसेल्यूलोज कंपोजिट की बढ़ी हुई चिपचिपाहट के साथ सहसंबंध में कम हो जाता है, यह सुझाव देते हुए कि मैट्रिक्स की संरचना को सेल कार्यों पर इसके हानिकारक प्रभावों के लिए सावधानीपूर्वक परीक्षण किया जाना चाहिए।

इसी तरह, सीएनसी आंतरिककरण पर मैक्रोफेज में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकता है, जिसके 3 डी प्रतिरक्षा सेल संस्कृति प्रणालियों में गंभीर परिणाम हो सकते हैं10,11। वास्तव में, इस बात पर बहुत कम डेटा उपलब्ध है कि सीएनसी अन्य प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से एलर्जी भड़काऊ प्रतिक्रियाएं जो मस्तूल कोशिकाओं द्वारा शुरू की जाती हैं। मस्तूल कोशिकाएं दानेदार ल्यूकोसाइट्स हैं जो उच्च-आत्मीयता आईजीई रिसेप्टर, एफसीईआरआई को व्यक्त करती हैं, जो एलर्जी के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए जिम्मेदार हैं। उनके प्रसार और भेदभाव स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) पर निर्भर हैं, जो टायरोसिन रिसेप्टर, किट को बांधता है। मस्तूल कोशिकाएं अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं जो परिसंचरण में प्रवेश करती हैं और बाद में सभी मानव ऊतकों में सर्वव्यापी रूप से फैलाने के लिए परिधीय रूप से स्थानांतरित होती हैं। जैसा कि मस्तूल कोशिकाएं 3 डी ऊतक वातावरण में कार्य करती हैं, वे इन विट्रो 3 डी ऊतक मॉडल में प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रतिरक्षा कोशिका उम्मीदवार हैं। हालांकि, आज तक, मस्तूल कोशिकाओं वाले इन विट्रो 3 डी ऊतक मॉडल में कोई व्यवहार्य नहीं है।

मस्तूल कोशिकाओं की अत्यधिक संवेदनशील प्रकृति और बाहरी उत्तेजनाओं के लिए प्रो-भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने की उनकी प्रवृत्ति के कारण, 3 डी मैट्रिक्स घटकों और 3 डी पाड़ में मस्तूल कोशिकाओं को पेश करने की बायोप्रिंटिंग विधि पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है, जैसा कि आगे चर्चा की गई है। ऊतक निर्माणों को बायोमैटेरियल्स की दो व्यापक श्रेणियों से बायोफैब्रिकेटेड किया जा सकता है, यानी, बायोइंक्स और बायोमटेरियल स्याही। अंतर इस तथ्य में निहित है कि बायोइंक्स सेल-लदे हाइड्रोजेल कंपोजिट हैं, जबकि बायोमटेरियल स्याही हाइड्रोजेल कंपोजिट हैं जो कोशिकाओं से रहित हैं, जैसा कि ग्रोल एट अल.13,14 द्वारा परिभाषित किया गया है। इसलिए, बायोइंक्स के साथ मुद्रित 3 डी निर्माणों में हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के भीतर पूर्व-एम्बेडेड कोशिकाएं होती हैं, जबकि बायोमटेरियल स्याही के साथ मुद्रित 3 डी निर्माणों को पोस्ट-प्रिंटिंग कोशिकाओं के साथ सीड करने की आवश्यकता होती है। हाइड्रोजेल-आधारित बायोइंक्स / बायोमटेरियल स्याही से संस्कृति मचानों का बायोफैब्रिकेशन आमतौर पर एक्सट्रूज़न 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग करके किया जाता है, जो बायोइंक / बायोमटेरियल स्याही को एक वायवीय या यंत्रवत् रूप से संचालित पिस्टन 14 के माध्यम से दबाव में माइक्रोस्केल नोजल के माध्यम से बाहर निकालता है। एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटर 2 डी क्रॉस-सेक्शनल पैटर्न में बायोइंक को जमा करके 3 डी मचानों का निर्माण करते हैं जो क्रमिक रूप से 'बॉटम-अप' दृष्टिकोण में एक-दूसरे पर स्टैक किए जाते हैं।

एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटिंग के साथ संगत होने के लिए, हाइड्रोजेल-आधारित बायोइंक / बायोमटेरियल स्याही के पास थिक्सोट्रोपिक (कतरनी-पतला) गुण होने चाहिए, जिससे बायोइंक / बायोमटेरियल स्याही के घटक हाइड्रोजेल पॉलिमर एक माइक्रोचैनल नोजल के माध्यम से तरल पदार्थ की तरह प्रवाहित होते हैं जब कतरनी तनाव के अधीन होते हैं, लेकिन कतरनी तनाव को हटाने पर एक चिपचिपा, जेल जैसी स्थिति में वापस आ जाते हैं15 . उनकी उच्च जल सामग्री के कारण, हाइड्रोजेल-आधारित बायोइंक्स / बायोमटेरियल स्याही के पॉलिमर को 3 डी बायोप्रिंटेड संरचना की वास्तुकला और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए शारीरिक या सहसंयोजक रूप से क्रॉसलिंक किया जाना चाहिए। सेल से लदे बायोइंक्स के मामले में, कोशिकाओं को सीधे क्रॉसलिंकिंग प्रक्रिया के दौरान रासायनिक तनाव के अधीन किया जाता है। बायोइंक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के भीतर encapsulated कोशिकाओं को बाहर निकालने की प्रक्रिया भी कोशिकाओं को कतरनी तनाव के लिए विषयों, जो कम व्यवहार्यता और / या सेल मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एक बार जब 3 डी ऊतक मॉडल को बायोप्रिंट किया गया है, तो हाइड्रोजेल मैट्रिक्स द्वारा प्राप्त साइटोटॉक्सिसिटी के स्तर और क्रमशः एक्सट्रूज़न और क्रॉसलिंकिंग प्रक्रियाओं के बीच भेदभाव करना मुश्किल है। यह विशेष रूप से 3 डी मचानों के संदर्भ में चुनौतीपूर्ण है जहां कोशिकाएं हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के भीतर पूर्व-एम्बेडेड होती हैं, इस प्रकार बाद के विश्लेषणों के लिए कोशिकाओं को हटाना मुश्किल हो जाता है, जो मस्तूल कोशिकाओं की व्यवहार्यता के लिए हानिकारक होगा।

मस्तूल कोशिकाओं वाले 3 डी ऊतक निर्माणों को उत्पन्न करने के लिए एक gentler दृष्टिकोण में कोशिकाओं को सेल संस्कृति निलंबन से पूर्व-मुद्रित, झरझरा बायोमटेरियल स्याही 3 डी मचानों में सीडिंग करना शामिल है, जो परिधीय ऊतकों में परिसंचरण से स्थानांतरित करने के लिए मस्तूल कोशिकाओं की जन्मजात क्षमता का लाभ उठाता है। इस सेल सीडिंग दृष्टिकोण के लाभ दो गुना हैं: (i) मस्तूल कोशिकाओं को क्रमशः एक्सट्रूज़न और क्रॉसलिंकिंग प्रक्रियाओं से कतरनी और रासायनिक तनाव के अधीन नहीं किया जाता है, और (ii) कोशिकाओं को उनकी व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित किए बिना विश्लेषण के लिए कोमल धोने के जोखिम के बाद आसानी से 3 डी पाड़ से हटाया जा सकता है। 2 डी हाइड्रोजेल डिस्क के विपरीत 3 डी बायोप्रिंटेड, झरझरा हाइड्रोजेल मचानों पर मस्तूल कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता का सीडिंग और विश्लेषण करने का अतिरिक्त लाभ यह है कि 3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचान विवो ऊतकों में माइक्रोस्केल स्थलाकृतिक विशेषताओं को दोहराते हैं, जो थोक, 2 डी प्लानर हाइड्रोजेल डिस्क में मौजूद नहीं हैं। यह दृष्टिकोण एक उपयुक्त, तेजी से, और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है जो मस्तूल कोशिकाओं पर उम्मीदवार बायोइंक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के संभावित भयावह साइटोटोक्सिक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए है, साथ ही साथ अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी कोशिकाओं, महंगे 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोगों में निवेश से पहले।

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Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल पांच वर्गों से बना है: (1) माउस अस्थि मज्जा का अलगाव और माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं (बीएमएमसी) का भेदभाव, (2) सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट का निर्माण 24-अच्छी तरह से प्रणाली और सब्सट्रेट पर बीएमएमसी की संस्कृति, (3) सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट से बीएमएमसी को हटाने और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके व्यवहार्यता और बायोमार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण, (4) वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फाइब्रिलर नैनोसेल्यूलोज (एफएनसी)/सोडियम एल्गिनेट समग्र बायोमैटेरियल स्याही से हाइड्रोजेल मचानों की 3डी बायोप्रिंटिंग, और (5) एफएनसी/सोडियम एल्जिनेट हाइड्रोजेल मचानों पर बीएमएमसी की संस्कृति और फ्लो साइटोमेट्री, एक्सटीटी, और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) माइक्रोटिटर एसेस का उपयोग करके व्यवहार्यता का विश्लेषण।

1. BMMC संस्कृति की पीढ़ी

नोट: चूहों को आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के बाद सीओ 2 श्वासावरोध द्वारा euthanized किया गया था। टिबिया और फीमर को अलग कर दिया गया था, और पूरे अस्थि मज्जा को काटा गया था। सभी पशु अध्ययन अल्बर्टा विश्वविद्यालय के लिए स्वास्थ्य विज्ञान पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ पशु देखभाल दिशानिर्देशों और नीतियों पर कनाडाई परिषद के अनुसार आयोजित किए गए थे।

  1. तालिका 1 में सूचीबद्ध पूरक ों को इंगित अंतिम सांद्रता में जोड़कर पूर्ण RPMI-1640 संस्कृति माध्यम तैयार करें। NaOH का उपयोग करके माध्यम के पीएच को 7.4-7.6 पर समायोजित करें, एकल-उपयोग, बोतल-शीर्ष फ़िल्टर (0.2 μm रंध्र आकार) का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, और 2 महीने तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. स्थानीय विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों से फीमर प्राप्त करें।
    नोट: इस अध्ययन में, फीमर को C57BL /6 चूहों से अलग किया गया था, लेकिन किसी भी तनाव का उपयोग किया जा सकता है यदि यह अध्ययन के लिए प्रासंगिक है।
  3. कैंची का उपयोग करके, कूल्हे के जोड़ से त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें, और फिर धीरे से कूल्हे के सॉकेट से थोड़ा बाहर घुमाकर फीमर को खींचें (चित्रा 1)। ध्यान रखें कि ऊरु के सिर को न तोड़ें। कैंची का उपयोग करके औसत दर्जे के फैबेला पर टिबिया को फीमर से दूर काटें। कैल्केनियम के ठीक ऊपर काटकर पंजा निकालें और त्याग दें।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करके, फीमर और टिबिया के टुकड़ों से त्वचा और उपास्थि को हटा दें। कैंची का उपयोग करके, फीमर और टिबिया के प्रत्येक छोर पर एक साफ कट बनाएं, जो भीतर लाल अस्थि मज्जा को उजागर करता है। यदि आवश्यक हो, तो इस बिंदु पर फाइबुला को हटा दें, लेकिन ध्यान दें कि यह अस्थि मज्जा फ्लशिंग के दौरान टिबिया के हेरफेर में सहायता कर सकता है।
  5. 5 एमएल ल्यूर-लॉक सिरिंज के साथ एक 26 जी सुई तैयार करें, और ऊपर वर्णित के रूप में तैयार किए गए लगभग 5 मिलीलीटर पूर्ण मीडिया के साथ भरें।
    नोट: इस बिंदु पर, additives के बिना अपूर्ण RPMI भी अभिकर्मकों पर बचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. संदंश के साथ फीमर या टिबिया को पकड़कर, सुई को हड्डी के एक छोर में डालें और धीरे से सिरिंज को दबाएं। हड्डी को 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब पर रखें, और धीरे-धीरे हड्डी में लगभग 5 मिलीलीटर माध्यम इंजेक्ट करें, कुछ दबाव लागू करें। अस्थि मज्जा के टुकड़े हड्डी के दूसरे छोर से पतले लाल रिबन के रूप में और शंक्वाकार ट्यूब में गिरने का निरीक्षण करें।
  7. aspirates नीचे स्पिन और पूर्ण माध्यम में resuspend, या एक T175 सेमी 2 बाँझ ऊतक संस्कृति फ्लास्क में सीधे स्थानांतरण पूर्ण RPMI-1640 माध्यम के 50 mL युक्त. 30 ng / mL माउस पुनः संयोजक इंटरल्यूकिन (IL)-3 के साथ पूर्ण RPMI-1640 माध्यम में aspirates बनाए रखें।
  8. 1 दिन के बाद, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें। संस्कृति अलग-अलग आकार और आकार की कोशिकाओं की एक विषम आबादी और अस्थि मज्जा के भी बड़े टुकड़ों से बनी होगी। ऊपर वर्णित पूर्ण RPMI-1640 माध्यम का उपयोग करके हर 3-5 दिनों में 15 मिलीलीटर ताजा माध्यम जोड़कर सेल संस्कृतियों को फ़ीड करें, और यह सुनिश्चित करें कि सेल घनत्व कभी भी 1 × 106 कोशिकाओं / एमएल से अधिक न हो। प्रति सप्ताह एक बार, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें, ताजा पूर्ण RPMI-1640 माध्यम में फिर से निलंबित करें, और ताजा T175 फ्लास्क में माध्यम के 50 मिलीलीटर में 1: 4 विभाजित करें।
  9. 4 सप्ताह के बाद, CD117 (किट) और FceRI रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा सेल शुद्धता का निर्धारण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जैसा कि नीचे वर्णित है (खंड 3.2)।
    नोट: 4 सप्ताह के बाद, 99% कोशिकाओं को CD117 (किट) और FcπRI के लिए डबल-पॉजिटिव होना चाहिए।
  10. 4 सप्ताह और उसके बाद, पूर्ण RPMI-1640 माध्यम में IL-3 के 20 ng/mL के साथ BMMCs को बनाए रखें। लगभग 6 सप्ताह में, कोशिकाएं विभाजित करना बंद कर देंगी और अब विभाजन की आवश्यकता नहीं होगी। संस्कृतियों को हर 3-5 दिनों में खिलाएं, प्रति सप्ताह एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें, और ताजा पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम में फिर से निलंबित करें।

2. सीएनसी / agarose / D-mannitol हाइड्रोजेल substrates और BMMC संस्कृति के निर्माण

  1. एक कांच की बोतल में, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) (2% डब्ल्यू / वी) में 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में 0.2 ग्राम एगारोज़ पाउडर जोड़ें, और भंग करने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए उबालें।
  2. पीबीएस में 2.5 ग्राम सीएनसी पाउडर को 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में भंग करें ताकि 25% डब्ल्यू / वी मिश्रण तैयार किया जा सके।
  3. पीबीएस में 2 ग्राम सीएनसी पाउडर को 20% डब्ल्यू / वी मिश्रण तैयार करने के लिए 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में भंग करें, और 10, 5, और 2% डब्ल्यू / वी सीएनसी मिश्रण तैयार करने के लिए 20% डब्ल्यू / वी मिश्रण को क्रमिक रूप से पतला करें।
  4. 25, 20, 10, 5 और 2% w / v CNC मिश्रण को 10 मिनट के लिए 37 °C तक गर्म करें (चित्र2A)।
  5. गर्म agarose समाधान (4.6% w / v) के लिए D-mannitol के 0.46 ग्राम जोड़ें और भंग।
  6. हाइड्रोजेल मिश्रण में 12.5, 10, 5, और 1% डब्ल्यू / वी डब्ल्यू / वी सीएनसी -पीबीएस मिश्रण को अलग-अलग शंक्वाकार ट्यूबों में गर्म एगारोज़ / डी-मैनीटोल समाधान के साथ 1: 1 अनुपात में मिलाएं ताकि हाइड्रोजेल मिश्रण में 12.5, 10, 5, 2.5 और 1% डब्ल्यू / वी की अंतिम सीएनसी सांद्रता प्राप्त हो सके।
  7. जल्दी से काम करते हुए, 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में चतुर्भुज में चरण 2.6 में तैयार किए गए उपरोक्त समाधानों में से 500 μL / अच्छी तरह से जोड़ें, और पोलीमराइजेशन (चित्रा 2 बी) की सुविधा के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े होने दें।
  8. एक माइक्रोपिपेट्टर के साथ हाइड्रोजेल सब्सट्रेट के शीर्ष पर 1.1 × 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर बीएमएमसी निलंबन की सावधानीपूर्वक परत 1000 μL, और पिपेट की नोक के साथ जेल को छूने से बचें क्योंकि यह जेल की सतह को नुकसान पहुंचाएगा और कणों को उत्पन्न करेगा।
  9. एक बाँझ इनक्यूबेटर (5% CO2, humidified वातावरण) में हाइड्रोजेल substrates पर BMMCs को 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. पीआई बहिष्करण के माध्यम से बीएमएमसी व्यवहार्यता का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
    1. CNC / agarose / D-mannitol के शीर्ष से BMMCs युक्त संस्कृति माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें, जेल से बचें, और कोशिकाओं को 1.5 mL माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. BMMCs को PBS (pH 7.4) के साथ दो बार धोएं, जिसमें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × g पर 0.5% w / v गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन होता है, और PBS-0.5% w / v BSA के 180 μL में 1.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व के लिए फिर से निलंबित किया जाता है। कोशिकाओं को 96 अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: फ़िल्टर-sterilize सभी PBS-0.5% w / v BSA समाधान दो बार एक 0.2 μm रंध्र आकार सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    3. PBS-0.5% w/v BSA, या PBS-0.5% w/v BSA में तैयार 10x PI (100 μg/mL) के 20 μL जोड़ें, कोशिकाओं को 10 μg/mL की अंतिम सांद्रता में, और 4 °C पर 1 h या अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक आर्गन आयन लेजर (488-514 एनएम) और बैंडपास फिल्टर से लैस एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति डेटा प्राप्त करें ताकि 578 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाया जा सके। कमरे के तापमान पर 30 μL / मिनट की प्रवाह दर पर प्रति नमूना 20,000 घटनाओं का अधिग्रहण करें। नीचे वर्णित डेटा का विश्लेषण करें (अनुभाग 3.2.7-3.2.10)।
  2. किट (CD117) और FcπRI सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के लिए BMMCs के प्रवाह cytometric विश्लेषण
    1. CNC / agarose / D-mannitol के शीर्ष से BMMCs युक्त संस्कृति माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें, जेल से बचें, और कोशिकाओं को 1.5 mL माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर फ़िल्टर किए गए पीबीएस -0.5% बीएसए के साथ बीएमएमसी को दो बार धोएं, और पीबीएस के 180 μL में 0.5% w / v BSA (1.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल) वाले पीबीएस में फिर से निलंबित करें। पुन: निलंबित कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें।
    3. CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) के 0.06 μg/mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के लिए 10x एंटीबॉडी काम करने वाले समाधानों के 20 μL जोड़ें और FcrIα-allophycocyanin (APC) के क्रमशः 0.06 μg/mL।
      नोट: 10x एंटीबॉडी काम समाधान फ़िल्टर-sterilized PBS-0.5% w / v BSA में तैयार किया जाना चाहिए।
    4. 10x आइसोटाइप नियंत्रण काम करने वाले समाधानों के 20 μL जोड़ें जिसमें या तो चूहा IgG2b π आइसोटाइप नियंत्रण-PE या अर्मेनियाई हैम्स्टर IgG आइसोटाइप नियंत्रण-APC शामिल हैं, जो कोशिकाओं वाले कुओं को अलग करने के लिए हैं जिन्हें चरण 3.2.3 में एंटीबॉडी-फ्लोरोफोर संयुग्मों में से किसी के साथ दाग नहीं दिया गया है।
      नोट: आइसोटाइप नियंत्रण, चूहा IgG2b π आइसोटाइप नियंत्रण-पीई और अर्मेनियाई हैम्स्टर IgG आइसोटाइप नियंत्रण-APC BMMC के लिए एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट अनुलग्नक के लिए नियंत्रण करने के लिए सेवा करते हैं। चूंकि बीएमएमसी एफसीआर के उच्च स्तर को व्यक्त नहीं करते हैं, इसलिए आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ शायद ही कभी उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाया जाता है। फ़िल्टर-निष्फल PBS-0.5% w/v BSA में 10x आइसोटाइप नियंत्रण कार्य समाधान तैयार करें।
    5. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा PBS-0.5% w / v BSA बफर के 200 μL जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × g पर सेंट्रीफ्यूज करें। धोने के चरण को एक बार फिर दोहराएं। ध्यान से सेल गोली को छूने के बिना supernatant निकालें; यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल गोली अबाधित रहती है, कुछ supernatant के पीछे छोड़ दें।
    7. धोने के बाद, 0.5% w / v BSA के 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया, PBS (pH 7.4) में 0.05% w / v सोडियम azide जो 0.2 μm रंध्र-आकार के सिरिंज फ़िल्टर के साथ दो बार बाँझ-फ़िल्टर किया गया है। पीई और एपीसी डिटेक्टर चैनलों में एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति डेटा प्राप्त करें, जैसा कि चरण 3.1.3 में ऊपर उल्लिखित है।
    8. विस्तार ".fcs" के साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा फ़ाइलों को देखने और विश्लेषण करने में सक्षम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
    9. y-अक्ष के साथ x-अक्ष और साइड स्कैटर (SSC) के साथ आगे स्कैटर (FSC) की साजिश रचकर विश्लेषण शुरू करें, और log10 1.5-5.0 की FSC रेंज और log10 0.75-3.25 की SSC रेंज के साथ संरक्षित सेल आबादी के लिए गेट अनुपचारित और अप्रकाशित कोशिकाओं में जैसा कि चित्र 3A (i), (ii) में दिखाया गया है।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है कि कम FSC और SSC मानों के साथ सेल मलबे विश्लेषण से समाप्त कर रहे हैं। मस्तूल कोशिकाएं आमतौर पर बहुत दानेदार (उच्च एसएससी) कोशिकाएं और बड़े (उच्च एफएससी) होते हैं जब अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी सेल प्रकारों की तुलना में, जैसे कि मोनोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स।
    10. इसके बाद, एफएससी बनाम एसएससी डॉट प्लॉट्स और अनुपचारित नमूनों के हिस्टोग्राम प्रोफाइल उत्पन्न करें जिन्हें डाई, एंटीबॉडी, या आइसोटाइप नियंत्रण के साथ दाग दिया गया है, और पीई या एपीसी चैनलों में विशिष्ट एंटीबॉडी-फ्लोरोफोर संयुग्मन या डाई के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के अनुसार माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) प्राप्त करें। विभिन्न सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल सब्सट्रेट्स के साथ इनक्यूबेट किए गए सभी बीएमएमसी नमूनों के लिए गेट्स और पैरामीटर का एक ही सेट लागू करें और संबंधित आइसोटाइप नियंत्रण, एंटीबॉडी, या डाई के साथ दाग दिया जाए; एमएफआई प्राप्त करें।
      नोट: अनिवार्य रूप से, अनुपचारित दाग वाले नमूनों के एफएससी बनाम एसएससी डॉट भूखंडों को अनुपचारित / अप्रकाशित नमूनों से अप्रभेद्य होना चाहिए, जो चरण 3.2.9 में प्राप्त किया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि धुंधला प्रक्रिया सेल आकार (एफएससी द्वारा मापा जाता है) या ग्रैन्युलैरिटी (एसएससी द्वारा मापा जाता है) (चित्रा 3 ए (आई), (ii)) को नहीं बदलती है।
    11. एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके ग्राफ़ की पीढ़ी के बाद 4 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रत्येक नमूने के लिए औसत MFIs और माध्य (SEM) की मानक त्रुटि की गणना करें।
    12. प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में हिस्टोग्राम ओवरले तैयार करें (चित्रा 3B, 4A(ii), B(ii)).

4.3D FNC / सोडियम alginate हाइड्रोजेल substrates के बायोप्रिंटिंग

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला 3 डी बायोप्रिंटर एक वायवीय-एक्सट्रूज़न सिस्टम है जो दो स्वतंत्र, तापमान-नियंत्रित प्रिंटहेड्स से सुसज्जित है। हाइड्रोजेल मचानों को 3 डी बायोप्रिंट करने के लिए उपयोग की जाने वाली बायोमैटेरियल स्याही को (ए) अत्यधिक हाइड्रेटेड फाइब्रिलर नैनोसेल्यूलोज (एफएनसी) का तैयार किया जाता है, जो रूपात्मक रूप से कोलेजन के समान है, (बी) सोडियम एल्गिनेट, और (सी) डी-मैनिटोल। यह 3 एमएल कारतूस में एक बाँझ हाइड्रोजेल निलंबन के रूप में आपूर्ति की जाती है जिसमें बाँझ ल्यूर-लॉक शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल (22, 25, या 27 जी) को संलग्न किया जा सकता है।

  1. प्रिंटहेड्स के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें और कमरे के तापमान पर प्रिंटबेड करें, जहां कमरे का तापमान 20-25 डिग्री सेल्सियस है।
  2. हाइड्रोजेल समग्र की स्थिरता बनाए रखने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बायोमैटेरियल स्याही कारतूस स्टोर करें। 3 डी बायोप्रिंटिंग शुरू करने से पहले, रेफ्रिजरेटर से एक कारतूस (3 एमएल) निकालें और इसे कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें।
  3. INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर पर एक Bioink कारतूस की स्थापना
    1. 3 mL biomaterial स्याही कारतूस (चित्रा 5B (i)) से नीले अंत कैप्स निकालें, और Bioink कारतूस के luer-लॉक अंत करने के लिए एक बाँझ 22 जी (नीले) शंक्वाकार bioprinting नोजल चिपकाने.
      नोट: कारतूस स्थापित करने और बाद के अंशांकन चरणों को निष्पादित करने से पहले बायोइंक कारतूस के लिए वांछित शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल चिपकाना आवश्यक है, क्योंकि ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप 3 डी बायोप्रिंटर के जेड-अक्ष का अनुचित अंशांकन होगा।
    2. प्रिंटहेड 1 (PH1, बाएं) के लिए हवा के दबाव की आपूर्ति टयूबिंग को कारतूस के विपरीत छोर से कनेक्ट करें, और PH1 (चित्रा 5A (ii)) के ऊर्ध्वाधर स्लॉट में अपने संलग्न शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल के साथ कारतूस डालें।
    3. दृढ़ता से ट्रंकिकल bioprinting नोजल printhead के नीचे विस्तार के साथ PH1 में कारतूस सीट. PH1 दक्षिणावर्त पर पेंच कस जब तक उंगली तंग जगह में Bioink कारतूस ताला करने के लिए. ध्यान दें कि 3 डी बायोप्रिंटिंग PH2 खाली छोड़ दिया के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
  4. 3D बायोप्रिंटर के x-y-z अक्षों को कैलिब्रेट करना
    1. 3 डी बायोप्रिंटर पर पावर, और यूएसबी 2.0 केबल के माध्यम से 3 डी बायोप्रिंटर से जुड़े पीसी पर बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    2. सॉफ़्टवेयर में, 3D बायोप्रिंटर के साथ सॉफ़्टवेयर को सिंक्रनाइज़ करने के लिए CONNECT बटन पर क्लिक करें.
      नोट: सिंक्रनाइज़ेशन सफल होता है जब printhead पराबैंगनी प्रकाश उत्सर्जक डायोड रोशनी चक्र पर और बंद, और HEPA फ़िल्टर प्रशंसक चक्र बंद और फिर से पर। सॉफ्टवेयर को बायोप्रिंटर अक्षों और प्रारंभिक बिंदु अंशांकन को होम करने से पहले 3 डी बायोप्रिंटर से सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए, जैसा कि बाद के चरणों में उल्लिखित है।
    3. 3डी बायोप्रिंटर के मुख्य नियंत्रण मेनू में चार विकल्पों का निरीक्षण करें: (i) बायोप्रिंट तैयार करें, (ii) बायोप्रिंट, (iii) उपयोगिताएं मेनू, और (iv) स्थिति स्क्रीन। BIOPRINT तैयार करें विकल्प का चयन करें, फिर नीचे स्क्रॉल करें और होम अक्ष विकल्प का चयन करें।
      नोट: 3 डी बायोप्रिंटर तब क्रमशः y- और x-अक्षों को कैलिब्रेट करने के लिए प्रिंटहेड असेंबली को पीछे और बाईं ओर ले जाएगा। इसके बाद, प्रिंटहेड्स को दूर बाईं स्थिति में रोक दिए जाने के साथ, बायोप्रिंटर प्रिंटबेड को तब तक बढ़ाएगा जब तक कि जेड-अक्ष अंशांकन स्विच (प्रिंटबेड पर स्थित) प्रिंटहेड 1 पर स्थापित शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल के साथ संपर्क नहीं करता है
    4. एक्स-वाई-जेड अक्षों के सफल अंशांकन के बाद, प्रिंटबेड के मामूली कम होने और प्रिंटबेड के केंद्र बिंदु के ऊपर प्रिंटहेड्स के स्थानांतरण का निरीक्षण करें (चित्रा 5ए (आई))।
  5. 24-अच्छी तरह से प्लेटों में बायोप्रिंटिंग के लिए बायोप्रिंटर का प्रारंभिक बिंदु अंशांकन
    1. अपने सील प्लास्टिक रैपिंग से एक बाँझ 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट को हटा दें, और एक स्थायी मार्कर के साथ प्लेट के नीचे अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र बिंदु पर एक बिंदु को चिह्नित करें। प्लेट कवर को हटा दें, और प्रिंटबेड के सामने बाएं कोने में स्थित अच्छी तरह से डी 1 के साथ प्रिंटबेड पर 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट रखें।
    2. मुख्य नियंत्रण मेनू पर, उपयोगिताएँ मेनू का चयन करें और तब अक्ष ले जाएँ का चयन करें। प्रिंटहेड्स को एक्स- और वाई-अक्षों के साथ 1 मिमी की वृद्धि में तब तक ले जाएं जब तक कि पीएच 1 के शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल सीधे अच्छी तरह से डी 1 के तहत चिह्नित डॉट पर न हो। यदि आवश्यक हो, तो 0.1 मिमी वेतन वृद्धि में प्रिंटहेड्स को स्थानांतरित करके डॉट पर शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल की स्थिति को ठीक करें।
    3. शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल के एक्स- और वाई-निर्देशांक रिकॉर्ड करें जब सीधे अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र पर, जैसा कि 3 डी बायोप्रिंटर के नियंत्रण कक्ष स्क्रीन पर इंगित किया गया है।
      नोट: यहाँ उपयोग किए जाने वाले INKREDIBLE + 3D बायोप्रिंटर के मामले में, x- और y-निर्देशांक निम्नानुसार हैं: x : -46.5 और y : -27.5। ये निर्देशांक 24-अच्छी तरह से प्लेट में बायोप्रिंटिंग के लिए अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र में शुरुआती बिंदु के रूप में कार्य करते हैं।
    4. अगला, 1 मिमी वेतन वृद्धि में प्रिंटबेड को तब तक बढ़ाएं जब तक कि अच्छी तरह से डी 1 का तल लगभग प्रिंटहेड 1 में स्थापित शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल को छू रहा हो। यदि आवश्यक हो तो 0.1 मिमी वेतन वृद्धि में प्रिंटबेड के आंदोलन को ठीक करें (चित्रा 5ए (ii))। उसके बाद, उपयोगिताएँ मेनू से, Z-अक्ष अंशांकन विकल्प का चयन करें, और आगे का चयन करें और संग्रह Z अंशांकन विकल्प की पुष्टि करें।
    5. मुख्य मेनू पर वापस जाएँ, और तैयार BIOPRINT विकल्प का चयन करें। करने के लिए नीचे स्क्रॉल करें और कैलिब्रेट Z विकल्प का चयन करें।
      नोट:: 3D bioprinter अब z-अक्ष अंशांकन (चित्रा 5A(iii)) सफलतापूर्वक निष्पादित करने पर printbed कम हो जाएगा।
  6. सही प्रारंभिक बिंदु निर्देशांक के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट जी-कोड फ़ाइल अद्यतन करना
    1. बायोप्रिंटर सॉफ़्टवेयर (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की गई 24-अच्छी तरह से प्लेट ज्यामितीय कोड (जी-कोड) फ़ाइल खोलें।
      नोट: यह 24-अच्छी तरह से जी-कोड फ़ाइल प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 5C (i), (iii)) में 2-परत 5 x 5 x 1 मिमी rectilinear constructs की छपाई encodes. प्रदान की गई जी-कोड फ़ाइलों का उपयोग किसी भी 3 डी बायोप्रिंटिंग सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है।
    2. ध्यान दें कि जी-कोड फ़ाइल की पंक्ति 1 G0 X-50.0 Y-33.5 पढ़ती है; D1 अच्छी तरह से केंद्र की स्थिति. चरण 4.5.3 में प्राप्त मानों के साथ पंक्ति 1 पर x- और y-निर्देशांक को अद्यतन करें, यानी, पंक्ति 1 को अब G0 X-46.5 Y-27.5 पढ़ना चाहिए; D1 अच्छी तरह से केंद्र की स्थिति. फ़ाइल को किसी नए नाम के अंतर्गत सहेजें.
      नोट:: यह प्रक्रिया G-कोड फ़ाइल को कैलिब्रेट करने के लिए कार्य करती है ताकि मुद्रण उपयोग किए जा रहे विशिष्ट 3 D बायोप्रिंटर के x, y निर्देशांक के आधार पर अच्छी तरह से D1 के केंद्र में शुरू हो जाए। इस दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी एक्सट्रूज़न 3 डी बायोप्रिंटर के साथ मुद्रण के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट जी-कोड फ़ाइल को कैलिब्रेट करने के लिए किया जा सकता है। इस अध्ययन के उद्देश्य के लिए, 24-वेल प्लेट के केवल बाएं आधे हिस्से, यानी, कुओं A1-3, B1-3, C1-3, और D1-3 मुद्रित किए गए थे। एक अलग जी-कोड फ़ाइल जो 3 x 4 ग्रिड में 2-परत 5 x 5 x 1 मिमी रेक्टिलिनियर निर्माणों की छपाई को एन्कोड करती है, वह भी प्रदान की जाती है (पूरक फ़ाइल 2, चित्रा 5 सी (ii))।
  7. Printhead 1 (PH1) के लिए बाहर निकालना दबाव का समायोजन
    1. सुनिश्चित करें कि वायवीय पंप कसकर INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर के पीछे हवा के सेवन बंदरगाह से जुड़ा हुआ है, और वायवीय पंप को चालू करें।
    2. INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर के दाईं ओर स्थित आगे नियंत्रण घुंडी बाहर खींचें।
      नोट: आगे नियंत्रण घुंडी PH1 के लिए दबाव समायोजित करता है, जबकि रियर नियंत्रण घुंडी PH2 के लिए दबाव को समायोजित करता है।
    3. PH1 और PH2 के लिए डिजिटल दबाव गेज का निरीक्षण करें जो बायोप्रिंटर के सामने स्थित है, प्रत्येक 0 kPa के करीब पढ़ता है। धीरे-धीरे आगे के नियंत्रण घुंडी को दक्षिणावर्त घुमाएं जब तक कि PH1 के लिए बाएं गेज पर इंगित दबाव 12 kPa (चित्रा 5A (iii)) तक नहीं पहुंच जाता है।
    4. स्थापित कारतूस के प्रिंट नोजल के नीचे एक मुड़ा हुआ टिशू पेपर या पनरोक का टुकड़ा रखें, प्रिंट नोजल को छूने के लिए सावधान न रहें।
    5. 3डी बायोप्रिंटर पर मुख्य नियंत्रण मेनू से, BIOPRINT तैयार करें का चयन करें।
    6. पर नेविगेट करें और PH1 चालू करें का चयन करें। ध्यान दें कि biomaterial स्याही प्रिंट नलिका से बाहर निकालना शुरू कर देता है। यदि आवश्यक हो, तो नियंत्रण घुंडी दक्षिणावर्त घूर्णन करके बाहर निकालना दबाव बढ़ाएं जब तक कि बायोमटेरियल स्याही को एक निरंतर फिलामेंट में बाहर नहीं निकाला जाता है, और नए दबाव सेटिंग को रिकॉर्ड करें। बायोमटेरियल स्याही बर्बाद करने से बचने के लिए जल्दी से काम करें।
    7. Biomaterial स्याही के बाहर निकालना बंद करने के लिए PH1 बंद बारी का चयन करें, प्रिंटबेड से बाहर निकाला biomaterial स्याही युक्त ऊतक कागज या फिल्म को हटाने, और bioprinter दरवाजा बंद.
      नोट:: 3 डी bioprinter स्वचालित रूप से G-कोड फ़ाइल द्वारा निर्देश के रूप में मुद्रण के दौरान PH1 करने के लिए हवा के दबाव की आपूर्ति चालू हो जाएगा।
  8. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में रेक्टिलिनियर हाइड्रोजेल सब्सट्रेट्स की 3 डी बायोप्रिंटिंग
    1. 3 डी बायोप्रिंटर पर मुख्य नियंत्रण मेनू से, उपयोगिताओं मेनू का चयन करें। पर नेविगेट करें और एसडी प्रिंट को अक्षम करें, जो बायोप्रिंटर सॉफ़्टवेयर को मुद्रण के लिए 3 डी बायोप्रिंटर को जी-कोड फ़ाइलों को प्रसारित करने की अनुमति देगा।
    2. बायोप्रिंटर सॉफ़्टवेयर में लोड बटन पर क्लिक करें, और चरण 4.6.2 में सहेजी गई अद्यतन 24-अच्छी तरह से प्लेट जी-कोड फ़ाइल का चयन करें।
    3. सॉफ़्टवेयर में दाएं हाथ के नियंत्रण कक्ष में, प्रिंट पूर्वावलोकन टैब का चयन करें, और अच्छी तरह से D1 में बायोप्रिंटिंग शुरू करने के लिए प्रिंट बटन पर क्लिक करें।
      नोट: यदि 3 x 4 ग्रिड अच्छी तरह से प्लेट जी-कोड फ़ाइल का उपयोग कर रहे हैं, तो बायोप्रिंटिंग 24-वेल प्लेट (चित्रा 5C (ii), D) के अच्छी तरह से A3 में समाप्त हो जाएगी, जैसा कि अच्छी तरह से A6 के विपरीत है यदि एक पूर्ण 24-अच्छी तरह से प्लेट मुद्रित की जाती है।
    4. रेक्टिलिनियर निर्माणों के बायोप्रिंटिंग के पूरा होने पर, अपने ढक्कन के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें और इसे कक्षा II जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
    5. बाँझ 50 mM CaCl2 समाधान (चित्रा 5B (ii)) की दो बूँदों में प्रत्येक रेक्टिलिनियर निर्माण को विसर्जित करें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह Ca2 + आयनों के साथ एल्गिनेट बहुलक श्रृंखलाओं को आयनित रूप से क्रॉसलिंक करने और रेक्टिलिनियर निर्माणों को उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने की अनुमति देने के लिए कार्य करता है।
    6. प्रत्येक निर्माण से CaCl2 समाधान को ध्यान से एस्पिरेट करें, और अतिरिक्त CaCl2 (चित्रा 5D) को हटाने के लिए 1x PBS (pH 7.4) के 1 mL में एक बार कुल्ला करें।
    7. बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल निर्माणों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए, ताजा 1x पीबीएस में 3 डी बायोप्रिंटेड रेक्टिलिनियर निर्माणों को बनाए रखें जब तक कि बीएमएमसी निर्माणों (चित्रा 5 डी) पर सीड करने के लिए तैयार न हों।

5. 3 डी bioprinted rectilinear scaffolds और व्यवहार्यता परीक्षण पर BMMCs के इनक्यूबेशन

  1. 3 डी bioprinted rectilinear hydrogel scaffolds पर BMMCs की इनक्यूबेशन
    1. चार अलग-अलग अवधियों के लिए तीन बार में 3 डी बायोप्रिंटेड रेक्टिलिनियर मचानों पर बीएमएमसी के बीज ऐलीकोट, उदाहरण के लिए, 6, 18, 24, और 48 ज, ताकि सभी उपचार एक साथ समाप्त हो जाएं। अनुपचारित नियंत्रण के रूप में एक ही अवधि के लिए तीन प्रतियों में खाली कुओं में बीजित BMMCs का उपयोग करें।
    2. Aseptically एक T175 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क से एक बाँझ 50 mL शंक्वाकार ट्यूब के लिए BMMCs हस्तांतरण, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर BMMCs गोली.
    3. आईएल -3 के 20 एनजी / एमएल युक्त ताजा पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 50 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, और हेमेसिटोमीटर का उपयोग करके ट्राइपैन नीले-दाग वाले बीएमएमसी के एलीकोट की गिनती करके लाइव सेल घनत्व की गणना करें।
    4. चरण 5.1.3 में गणना किए गए सेल घनत्व के आधार पर, 1 × 106 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व पर बीएमएमसी निलंबन का 6 एमएल एलीकोट तैयार करें।
    5. 48 ज इनक्यूबेशन सेटअप के लिए, कुओं A1-3 से एस्पिरेट पीबीएस जिसमें 3 डी बायोप्रिंटेड रेक्टिलिनियर हाइड्रोजेल मचान होते हैं, और पिपेट 1 एमएल बीएमएमसी (1 × 106 कोशिकाएं / एमएल) प्रत्येक कुएं में निलंबन होता है। इसके अलावा, बीएमएमसी के पिपेट 1 एमएल (1 × 106 कोशिकाओं / एमएल) को अनुपचारित नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए बायोप्रिंटेड निर्माणों के बिना कुओं ए 4-6 में निलंबन। 24, 18, और 6 ज उपचार अवधि के लिए बीएमएमसी के साथ सीडिंग के लिए उपयुक्त समय तक पहुंचने तक निर्जलीकरण को रोकने के लिए additives के बिना RPMI में bioprinted scaffolds (B1-3, C1-3, D1-3) युक्त शेष कुओं को इनक्यूबेट करें। Bioprinted scaffolds (B4-6, C4-6, D4-6) के बिना कुओं को पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ भरें जब तक कि 24, 18, और 6 घंटे के समय बिंदुओं के लिए BMMCs के साथ सीडिंग के लिए उपयुक्त समय तक नहीं पहुंच जाता है।
    6. 5% CO2 humidified वातावरण में 37 °C पर 24-अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट करें।
    7. 24 घंटे इनक्यूबेशन सेटअप के लिए, इन कुओं में एस्पिरेट पहले से मौजूद संस्कृति माध्यम / बफर बी 1-6, और बीज बीएमएमसी (1 × 106 कोशिकाओं / एमएल) निलंबन के बीज 1 एमएल। प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस कर दें।
    8. 18 ज इनक्यूबेशन सेटअप के लिए, कुओं C1-6 से एस्पिरेट पूर्व-मौजूदा संस्कृति माध्यम / बफर, और इन कुओं में BMMC (1 × 106 कोशिकाओं / एमएल) निलंबन के बीज 1 मिलीलीटर। प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस कर दें।
    9. 6 ज इनक्यूबेशन सेटअप के लिए, कुओं D1-6 से एस्पिरेट पूर्व-मौजूदा संस्कृति माध्यम / बफर, और इन कुओं में BMMC (1 × 106 कोशिकाओं / एमएल) निलंबन के बीज 1 एमएल बीज। प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस कर दें।
    10. समाप्ति इनक्यूबेशन लिए, 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से नमूने वितरित (i) प्रवाह cytometry द्वारा पीआई धुंधला और विश्लेषण, (ii) XTT सेल व्यवहार्यता परख, और (iii) LDH रिलीज परख. इसलिए, सुनिश्चित करें कि एक राउंड-बॉटम 96-वेल प्लेट और आवश्यक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को इनक्यूबेशन के समापन बिंदु से पहले अच्छी तरह से लेबल किया जाता है।
  2. XTT चयापचय परख के लिए सेल नमूना
    1. अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर संस्कृति माध्यम में BMMCs resuspend, नुकसान और 3 डी bioprinted हाइड्रोजेल scaffolds टुकड़ा नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
    2. Aseptically प्रत्येक अच्छी तरह से बाँझ करने के लिए सजातीय BMMC निलंबन के 40 μL हस्तांतरण करने के लिए बाँझ करने के लिए 1.5 mL microfuge ट्यूबों ताजा पूर्ण RPMI माध्यम (अंतिम मात्रा = 800 μL) के 760 μL युक्त, और भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए.
    3. एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर अवशोषण माप ( सामग्री की तालिका देखें) रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त है कि एक फ्लैट नीचे 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में पतला BMMC निलंबन के 100 μL वितरित करें।
    4. एक multichannel micropipette का उपयोग कर BMMC सेल निलंबन युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए XTT काम कर समाधान के 50 μL वितरित करें।
      नोट: इलेक्ट्रॉन युग्मन अभिकर्मक के 100 μL के साथ XTT अभिकर्मक के 5 mL मिश्रण द्वारा XTT काम समाधान तैयार करें। उपयोग से ठीक पहले 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में -20 डिग्री सेल्सियस से इन घटकों को पिघलाएं।
    5. 24 घंटे के लिए 5% CO2 humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेशन के अंत में, इनक्यूबेटर से 96-अच्छी तरह से प्लेट को हटा दें और कमरे के तापमान पर ठंडा होने की अनुमति दें। 650 एनएम पर पृष्ठभूमि घटाव के साथ 450 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर रिकॉर्ड अवशोषण मान।
  3. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख के लिए supernatant नमूना
    1. शेष BMMC निलंबन (960 μL) को 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारें।
    2. पिपेट तीन 100 μL एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर फ्लैट-बॉटम प्लेट में प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब से supernatant सेल संस्कृति supernatant के ऐलीकोट। प्रत्येक microfuge ट्यूब से बचे हुए supernatants को छोड़ दें, और अनुभाग 5.4.1-5.4.8 में पीआई के साथ आगे धुंधला करने के लिए बीएमएमसी छर्रों को बनाए रखें।
    3. पिपेट 50 μL LDH काम समाधान के प्रत्येक 100 μL supernatant के ऐलीकोट में काम कर रहा है.
      नोट: एलडीएच परख अभिकर्मकों की तैयारी के लिए पूरक फ़ाइल 3 को देखें।
    4. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एम एसिटिक एसिड के पिपेट 50 μL।
    6. 680 एनएम पर पृष्ठभूमि घटाव के साथ 490 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर रिकॉर्ड अवशोषण मान।
  4. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) बहिष्करण के माध्यम से बीएमएमसी व्यवहार्यता का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
    1. प्रवाह धोने बफर (PBS [pH 7.4] जिसमें 0.5% w / v BSA युक्त) में BMMC छर्रों को फिर से निलंबित कर दिया गया है, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × g पर कोशिकाओं को गोली मार दी गई है।
    2. प्रवाह धोने बफर के साथ धोने के कदम को एक बार फिर से दोहराएं।
    3. प्रवाह धोने बफर के 400 μL में प्रत्येक BMMC गोली resuspend.
      नोट: कुल मिलाकर 24 पुन: निलंबित बीएमएमसी नमूने होंगे: बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल सब्सट्रेट्स (4 समय बिंदुओं में 4 समय बिंदु) पर इनक्यूबेट किए गए 12 बीएमएमसी नमूने और 12 बीएमएमसी नमूने बायोप्रिंटेड निर्माणों के बिना कुओं में इनक्यूबेट किए गए (4 समय अंक) तीन बार)।
    4. एक राउंड-बॉटम 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में, पिपेट 20 μL प्रवाह धोने बफर को कुओं A1-12 और B1-12 में धोता है। एक ही माइक्रोटिटर प्लेट में, पिपेट 20 μL 10x PI धुंधला समाधान (प्रवाह धोने बफर में 100 μg / mL PI) कुओं C1-12 और D1-12 में धुंधला समाधान।
    5. 12 BMMC नमूनों के 180 μL कुओं A1-12 (अच्छी तरह से एक नमूना प्रति) में bioprinted हाइड्रोजेल substrates पर incubated वितरण. 12 BMMC नमूनों के 180 μL कुओं B1-12 (अच्छी तरह से प्रति एक नमूना) में bioprinted हाइड्रोजेल substrates के बिना incubated वितरित करें। प्रत्येक उपचार की स्थिति (कुल में 24 नियंत्रण) के लिए बिना दाग वाले नियंत्रण के रूप में कुओं A1-12 और B1-12 में वितरित किए गए BMMC नमूनों का उपयोग करें।
    6. 12 BMMC नमूनों के 180 μL कुओं C1-12 (अच्छी तरह से एक नमूना प्रति) में bioprinted निर्माणों पर incubated वितरण. कुओं D1-12 (अच्छी तरह से एक नमूना प्रति एक नमूना) में bioprinted निर्माणों के बिना incubated 12 BMMC नमूनों के 180 μL वितरित करें।
      नोट: कुओं C1-12 और D1-12 में BMMC नमूने 10 μg / mL (कुल में 24 दाग नमूने) के अंतिम प्रभावी पीआई एकाग्रता पर दाग दिया जाएगा।
    7. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे या अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, एक प्रवाह साइटोमीटर पर माइक्रोटिटर प्लेट से सीधे नमूनों का विश्लेषण करें जैसा कि पहले धारा 3.1 के तहत वर्णित है।

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Representative Results

एक सफल biomaterial स्याही या संस्कृति सब्सट्रेट की सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक biocompatibility की है। मुख्य रूप से, सब्सट्रेट को सेलुलर मृत्यु को प्रेरित नहीं करना चाहिए। सेल व्यवहार्यता और परिगलन को मापने के कई माइक्रोटिटर-आधारित और प्रवाह साइटोमेट्रिक तरीके हैं; हालांकि, ये विधियां हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल में, उपर्युक्त सीमा को हाइड्रोजेल सब्सट्रेट या बायोप्रिंटेड पाड़ पर बीएमएमसी को सीडिंग करके दरकिनार कर दिया जाता है। एक विशिष्ट इनक्यूबेशन अवधि (इस अध्ययन में 6-48 घंटे) के बाद, बीएमएमसी को आसानी से हाइड्रोजेल सब्सट्रेट या बायोप्रिंटेड पाड़ के यांत्रिक व्यवधान या हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता के बिना माइक्रोपिपेटिंग द्वारा काटा जाता है, जो अन्यथा कोशिकाओं को शारीरिक क्षति पहुंचाएगा। BMMCs की व्यवहार्यता तो तेजी से प्रवाह cytometry के माध्यम से पीआई पारगम्यता विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है. पीआई एक झिल्ली-अभेद्य डाई है जिसे बरकरार सेल झिल्ली के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं से बाहर रखा जाता है और केवल डीएनए 16 के आधार जोड़े के बीच इंटरकैलेटिंग पर फ्लोरेसेस होता है।

इस प्रकार, केवल समझौता किए गए सेल झिल्ली वाली कोशिकाएं पीआई के लिए पारगम्य हैं और इसलिए, फ्लोरेसिस करेंगी। पीआई पारगम्यता विश्लेषण ने बीएमएमसी व्यवहार्यता में कोई बदलाव नहीं दिखाया जब वे सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल सब्सट्रेट पर सुसंस्कृत होते हैं। वास्तव में, परीक्षण किए गए सीएनसी सांद्रता में से कोई भी (12.5% डब्ल्यू / वी तक) ने सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट्स (चित्रा 3 बी, सी) की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत बीएमएमसी की तुलना में बीएमएमसी व्यवहार्यता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं डाला। यह भी महत्वपूर्ण है कि बायोइंक या संस्कृति सब्सट्रेट कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को नहीं बदलता है। प्रवाह cytometric FSC बनाम एसएससी भूखंडों के आधार पर, उच्चतम सीएनसी एकाग्रता (12.5% डब्ल्यू / वी) के साथ हाइड्रोजेल सब्सट्रेट ने सीएनसी / एगारोस / डी-मैनिटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट (चित्रा 3 ए (आई), (ii)) की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत बीएमएमसी की तुलना में बीएमएमसी के मूल आकार (एफएससी) या ग्रैन्युलैरिटी (एसएससी) को नहीं बदला।

बायोमटेरियल स्याही या संस्कृति सब्सट्रेट की एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि इसमें उन कोशिकाओं के भेदभाव और फेनोटाइप को बनाए रखने की क्षमता होनी चाहिए जो इसका समर्थन करता है। मस्तूल कोशिकाओं के सबसे उत्कृष्ट बायोमाकर्स में से दो उच्च-आत्मीयता आईजीई रिसेप्टर, एफसीआरआई हैं, जो एंटीजन और स्टेम सेल फैक्टर रिसेप्टर, किट (सीडी 117) के लिए बीएमएमसी प्रतिक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है, जो मस्तूल सेल अस्तित्व और भेदभाव के लिए आवश्यक है। परिपक्व मस्तूल कोशिकाओं को इन दो सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया जाता है, और संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के लिए बायोइंक सब्सट्रेट के लिए, इसे इन दो रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से संशोधित नहीं करना चाहिए। CNC/agarose/D-mannitol सब्सट्रेट 2.5% (चित्रा 4A(iii), B(iii)) के ≥ CNC सांद्रता में FcπRI और Kit अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए दिखाई दिया। दिलचस्प बात यह है कि, ऊंचा FcπRI और किट अभिव्यक्ति का स्तर 2.5% और 12.5% सीएनसी के बीच अपेक्षाकृत सुसंगत रहा, जो एक पठार प्रभाव का संकेत है और एक प्रभाव का सुझाव देता है जो सीएनसी की एकाग्रता पर निर्भर नहीं है, लेकिन हाइड्रोजेल समग्र के कुछ अन्य पैरामीटर पर।

इस अध्ययन में उत्पन्न 3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल बायोमटेरियल स्याही मचानों में क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज के बजाय फाइब्रिलर नैनोसेल्यूलोज (एफएनसी) और एगारोज़ के बजाय जेलेटर के रूप में सोडियम एल्गिनेट शामिल हैं। फाइब्रिलर नैनोसेल्यूलोज सीएनसी 17 की तुलना में अलग-अलग नैनोस्केल स्थलाकृतिक विशेषताओं को प्रदर्शित करता है, जो 3 डी बायोप्रिंटेड एफएनसी हाइड्रोजेल बायोइंक सब्सट्रेट के माइक्रोस्केल आर्किटेक्चर के अलावा, संभावित रूप से बीएमएमसी की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है। FNC/alginate/D-mannitol bioink scaffolds (चित्रा 6) के 3D बायोप्रिंटिंग और आयनिक क्रॉसलिंकिंग के बाद, BMMCs को या तो अकेले या 3D बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचानों पर क्रमशः 6, 18, 24, और 48 h के लिए सुसंस्कृत किया गया था, ताकि FNC/ alginate/ D-mannitol scaffolds के जवाब में BMMCs की व्यवहार्यता में गतिशील परिवर्तनों का आकलन किया जा सके, यदि कोई हो, तो समय की विस्तारित अवधि में। XTT परख ने संकेत दिया कि 3 डी bioprinted हाइड्रोजेल scaffolds पर सुसंस्कृत BMMCs की चयापचय गतिविधि सभी परीक्षण समय बिंदुओं पर ~ 100% पर अपेक्षाकृत सुसंगत बनी रही, जब अकेले सुसंस्कृत BMMCs की तुलना में (चित्रा 7A)। कोशिकाओं के lysis सेल संस्कृति माध्यम है, जो एलडीएच परख अपने oxido-रिडक्टिव एंजाइमेटिक गतिविधि के एक समारोह के रूप में पता लगाता है में एलडीएच की रिहाई में परिणाम.

3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचानों पर सुसंस्कृत बीएमएमसी ने अकेले सुसंस्कृत बीएमएमसी की तुलना में एलडीएच रिलीज में क्रमिक समय-निर्भर वृद्धि का प्रदर्शन किया; हालांकि, इस प्रवृत्ति में 9% से कम का एक गैर-महत्वपूर्ण मानक विचलन था (चित्रा 7 बी)। 3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचानों पर सुसंस्कृत बीएमएमसी के पीआई स्टेनिंग ने प्रत्येक समय बिंदु (चित्रा 7 सी) पर अकेले सुसंस्कृत बीएमएमसी की तुलना में व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं किया। विशेष रूप से, पीआई-दाग वाले बीएमएमसी का एमएफआई 3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचानों पर सुसंस्कृत सभी समय बिंदुओं पर अपेक्षाकृत सुसंगत (7000 का पीआई-एमएफआई) बना रहा और सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल सब्सट्रेट्स पर सुसंस्कृत बीएमएमसी के समान था, जिसने सभी सीएनसी सांद्रता (2.5-12.5%) में 7000 के एक सुसंगत पीआई-एमएफआई का प्रदर्शन किया। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि FNC / alginate / D-mannitol हाइड्रोजेल scaffolds BMMCs की व्यवहार्यता पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालते हैं।

Figure 1
चित्र 1: माउस पैर की एनाटॉमी, टिबिया और फीमर को दर्शाती है, जिसमें से अस्थि मज्जा अलग-थलग है। कृपया इस आकृति के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीएनसी / agarose / D-mannitol हाइड्रोजेल सब्सट्रेट की तैयारी। (ए) सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट तैयारी प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। (बी) सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल तैयारी (0, 1, 2.5, 5, 10, और 12.5% (डब्ल्यू / वी) पीबीएस / एगारोज़ / डी-मैनिटोल में सीएनसी) को चतुष्कोणीय में 24-अच्छी तरह से प्लेट पर लोड किया गया था जैसा कि सचित्र है। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा; CNC = क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल सब्सट्रेट्स पर इनक्यूबेशन के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड बहिष्करण के माध्यम से बीएमएमसी व्यवहार्यता का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। BMMCs को CNC / agarose / D-mannitol hydrogel substrates से हटा दिया गया था, दो बार धोया गया था, PBS-0.5% w / v BSA में फिर से निलंबित किया गया था, 4 °C पर 1 h के लिए PI के साथ दाग दिया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री (n = 4) द्वारा विश्लेषण किया गया था। पीई चैनल में पीआई प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने सहित प्रति नमूना कुल 20,000 कोशिकाओं का अधिग्रहण किया गया था। डेटा विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। (ए) फॉरवर्ड स्कैटर (एक्स-अक्ष) बनाम साइड स्कैटर (वाई-अक्ष) डॉट प्लॉट विश्लेषण (i) अनुपचारित नियंत्रण बीएमएमसी (0% सीएनसी / एगारोस / डी-मैनिटोल) और (ii) बीएमएमसी 12.5% सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल पर सुसंस्कृत, डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटेड सेल आबादी को दर्शाते हुए। (बी) गेटेड कोशिकाओं का हिस्टोग्राम ओवरले प्रोफाइल (बिना दाग या पीआई के साथ दाग), अनुपचारित नियंत्रण बीएमएमसी (0% सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल) से और बीएमएमसी 12.5% सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल पर सुसंस्कृत। (सी) बीएमएमसी को 18 घंटे के लिए विभिन्न सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल सब्सट्रेट्स (1-12.5% (डब्ल्यू / वी) सीएनसी) पर सुसंस्कृत किया गया था, और सेल व्यवहार्यता को पीआई-दाग कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। BMMCs के लिए PI MFIs का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व विभिन्न CNC/agarose/D-mannitol substrates (1-12.5% (w/v) CNC) पर इनक्यूबेट किया गया है, जो BMMCs के सापेक्ष है जो अनुपचारित और PI के साथ दागदार थे। संक्षिप्त रूप: BMMCs = अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं; सीएनसी = क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज; PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; PE = phycoerythrin कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: FcπRI और किट (CD117) सेल सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के प्रवाह cytometric विश्लेषण. BMMCs या तो अनुपस्थिति या 18 ज के लिए CNC / agarose / D-mannitol substrates की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे, हटा दिया, और रिसेप्टर अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया। डेटा 4 प्रतिकृतियों का प्रतिनिधि है। अनुपचारित BMMC नमूने (0% CNC/ agarose/D-mannitol) में कुल सेल आबादी के फॉरवर्ड स्कैटर (x-अक्ष) बनाम साइड स्कैटर (y-अक्ष) डॉट प्लॉट, (A) (i) आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी-APC या (B) (i) आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी-पीई, और डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटेड सेल आबादी के साथ दाग दिया गया है। गेटेड BMMCs के हिस्टोग्राम ओवरले प्रोफाइल (आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी या (ए) (ii) एंटी-एफसीआरआई-एपीसी एंटीबॉडी या (बी) (ii) एंटी-किट-पीई एंटीबॉडी के साथ दाग), या तो अकेले (0% सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल) या 12.5% सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल सब्सट्रेट पर इनक्यूबेट किया गया। BMMCs को विभिन्न CNC / agarose / D-mannitol substrates (1-12.5% (w / v) CNC) पर 18 h के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जिसके बाद क्रमशः FcπRI और Kit सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री (n = 4) के माध्यम से। BMMCs के MFIs का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व (A) (iii) एंटी-FcπRI-APC या (B)(iii) एंटी-किट-पीई एंटीबॉडी, क्रमशः, विभिन्न CNC / agarose / D-mannitol substrates (1-12.5% (w / v) CNC) पर संस्कृति का पालन करते हुए कोशिकाओं के सापेक्ष जो अनुपचारित (0% CNC) थे और इसी तरह दागदार थे। संक्षेप: सीएनसी = क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज; APC = allophycocyanin; पीई = phycoerythrin; BMMCs = अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं; MFI = मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 3 डी बायोप्रिंटर उपकरण और उपभोग्य वस्तुओं को बायोप्रिंट करने के लिए आवश्यक 5 x 5 x 1 मिमी 2-परत रेक्टिलिनियर बायोइंक हाइड्रोजेल मचान एक 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में। (ए) (i) प्रिंटहेड असेंबली स्थिति के साथ एक वायवीय-एक्सट्रूज़न 3 डी बायोप्रिंटर अपने एक्स-वाई-जेड अक्षों के होमिंग को पूरा करने पर अपनी आराम की स्थिति में। (A) (ii) स्थापित बायोइंक कारतूस के साथ प्रिंटहेड 1 का प्रारंभिक बिंदु अंशांकन और एक्स-वाई-जेड आयामों में अच्छी तरह से डी 1 के मध्य में सीधे प्रिंट नोजल का प्लेसमेंट। (A) (iii) जेड-अक्ष अंशांकन के बाद पीएच1 की स्थिति और पीएच1 के एक्सट्रूज़न दबाव को 12 केपीए पर सेट किया गया है। (B) (i) बायोइंक कारतूस (3 एमएल) जिसमें एनएफसी/एल्गिनेट/डी-मैनीटोल बायोमैटेरियल इंक फार्मूलेशन होता है। (B) (ii) 50 एमएम CaCl2 क्रॉसलिंकिंग समाधान का ड्रॉपलेट डिस्पेंसर। (C) (i) 24-वेल प्लेट के सभी कुओं में 5 x 5 x 1 मिमी 2-परत रेक्टिलिनियर बायोइंक हाइड्रोजेल मचानों के मुद्रण को एन्कोडिंग करने वाली जी-कोड फ़ाइल से प्रिंट लेआउट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (C) (ii) 5 x 5 x 1 मिमी 2-परत रेक्टिलिनियर बायोइंक हाइड्रोजेल मचानों के मुद्रण को एन्कोडिंग करने वाली जी-कोड फ़ाइल से प्रिंट लेआउट का योजनाबद्ध निरूपण केवल कुओं A1-3, B1-3, C1-3, और 24-वेल प्लेट के D1-3 में एन्कोडिंग करता है। (C) (iii) स्लाइसिंग प्रोग्राम, स्लीक3आर में 5 x 5 x 1 मिमी 2-लेयर रेक्टिलिनियर बायोइंक हाइड्रोजेल पाड़ पैटर्न का विस्तारित दृश्य। (D) वास्तविक 3 डी bioprinted के Topview 5 x 5 x 1 मिमी 2 परत rectilinear bioink hydrogel scaffolds एक 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप PBS में डूब में. संक्षिप्त रूप: 3 डी = तीन आयामी; PH1 = प्रिंटहेड 1; NFC = नैनोफिब्रिलर सेल्यूलोज; जी कोड = ज्यामितीय कोड; PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र6: FNC/alginate/D-mannitol hydrogel scaffolds पर 3D bioprinting और BMMC संस्कृति के वर्कफ़्लो को दर्शाने वाला योजनाबद्ध आरेख। 5 x 5 x 1 mm 2-layer ग्रिड पैटर्न एन्कोडिंग करने वाली G-code फ़ाइल से FNC/Alginate/D-mannitol bioink के साथ हाइड्रोजेल मचानों का 3D बायोप्रिंटिंग, CaCl2 के साथ हाइड्रोजेल मचानों की क्रॉसलिंकिंग, और क्रॉसलिंक किए गए FNC/Alginate/D-mannitol hydrogel निर्माणों पर BMMCs की खेती। संक्षिप्त रूप: 3 डी = तीन आयामी; 2D = दो आयामी; जी कोड = ज्यामितीय कोड; FNC = fibrillar nanocellulose; BMMCs = अस्थि-मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रवाह साइटोमेट्रिक (PI) और माइक्रोटिटर (XTT और LDH) FNC / alginate / D-mannitol scaffolds पर इनक्यूबेशन के बाद BMMC व्यवहार्यता के assays. (A) सेल प्रसार (XTT) चयापचय परख डेटा BMMCs पर सुसंस्कृत FNC / Alginate / D-mannitol bioink substrates पर क्रमशः 6, 18, 24, और 48 h के लिए सुसंस्कृत। मानों को क्रमशः 6, 18, 24, और 48 घंटे के लिए अकेले सुसंस्कृत बीएमएमसी के लिए XTT चयापचय डेटा के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (n = 3) को इंगित करती हैं. (बी) एलडीएच एंजाइम जारी बीएमएमसी के लिए परख डेटा एफएनसी / एल्गिनेट / डी-मैनीटोल बायोइंक मचानों पर सुसंस्कृत क्रमशः 6, 18, 24, और 48 ज के लिए। मूल्यों को क्रमशः 6, 18, 24 और 48 घंटे के लिए अकेले सुसंस्कृत बीएमएमसी द्वारा जारी किए गए एलडीएच एंजाइम के सापेक्ष गुना-परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (n = 3) को इंगित करती हैं. (सी) पीआई-दाग वाले बीएमएमसी का फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा जो या तो अकेले या एफएनसी / एल्गिनेट / डी-मैनीटोल बायोइंक मचानों पर क्रमशः 6, 18, 24 और 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (n = 3) को इंगित करती हैं. संक्षेप: एलडीएच = लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज; BMMCs = अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाओं; FNC = fibrillar nanocellulose; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; MFI = मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1.1.1. RPMI की 500 mL बोतल (HyClone, GE Healthcare, USA)
1.1.2. 4 mM L-glutamine (गिब्को, वाल्थम मैसाचुसेट्स, संयुक्त राज्य अमेरिका)
1.1.3. 50 mM β-Mercaptoethanol (फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, न्यू हैम्पशायर, संयुक्त राज्य अमेरिका)
1.1.4. 1 mM सोडियम पाइरूवेट (गिब्स)
1.1.5. 100 U/mL पेनिसिलिन (Gibco)
1.1.6. 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (Gibco)
1.1.7. 0.1 mM MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (Gibco)
1.1.8. 25 mM HEPES (फिशर)
1.1.9. 10% गर्मी निष्क्रिय FBS (Gibco)
1.1.10. 30 ng/ mL माउस पुनः संयोजक IL-3 (Peprotech, रॉकी हिल, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका)

तालिका 1: पूर्ण RPMI-1640 मीडिया की खुराक.

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Discussion

3 डी बायोमिमेटिक ऊतकों के निर्माण के लिए बायोइंक के सफल समामेलन की आवश्यकता होती है, जो सेलुलर घटक (ओं) के साथ बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के घटकों की नकल करता है ताकि विवो ऊतकों में शारीरिक एनालॉग ्स बनाए जा सकें। इसके लिए प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता होती है, न कि रूपांतरित कोशिकाओं के लिए, जब शारीरिक बायोमिमेटिक ऊतकों का निर्माण किया जाता है। प्राथमिक प्रतिरक्षाविज्ञानी कोशिकाएं, जैसे कि मस्तूल कोशिकाएं, हालांकि, विशेष रूप से साइटोटोक्सिक प्रभावों और फेनोटाइपिक परिवर्तनों के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं जिन्हें बायोइंक मैट्रिक्स द्वारा ही प्राप्त किया जा सकता है, जो अवांछनीय है। इसलिए, मस्तूल कोशिकाओं की व्यवहार्यता और फेनोटाइप (सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति) पर उम्मीदवार बायोमटेरियल स्याही के प्रभावों का तेजी से आकलन करने की क्षमता अत्यधिक फायदेमंद है, विशेष रूप से बायोइंक मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड विभिन्न सेल प्रकारों वाले जटिल ऊतकों के 3 डी बायोप्रिंटिंग से पहले, जो महंगा और समय लेने वाला है।

इस प्रोटोकॉल के दृष्टिकोण में बीएमएमसी को संवर्धित करना शामिल है, प्राथमिक मस्तूल कोशिकाओं का एक उदाहरण, पूर्वनिर्मित उम्मीदवार हाइड्रोजेल बायोइंक सब्सट्रेट्स (1-12.5% एगारोज़ में एम्बेडेड सीएनसी) की सतह पर, जो फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल व्यवहार्यता और सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के बाद के विश्लेषण के लिए बीएमएमसी की आसान पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है। माउस फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा के अलगाव के लिए इन हड्डियों की नाजुकता और छोटे आकार के कारण विस्तार पर सटीक और ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सेल कल्चर माध्यम में अस्थि मज्जा के सफल अलगाव और जमाव के बाद, 4 सप्ताह के लिए लगातार 30 एनजी / एमएल माउस पुनः संयोजक आईएल -3 के साथ सेल संस्कृति को बनाए रखना आवश्यक है, जो हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं को मस्तूल कोशिकाओं में अंतर करने के लिए निरंतर उत्तेजना सुनिश्चित करता है जो किट (सीडी 117) और एफसीआरआई सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए डबल-पॉजिटिव हैं।

किट (CD117) और FcπRI रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति के लिए मस्तूल कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण इन रिसेप्टर्स को लक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के विशिष्ट संकेतों से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को अलग करने में सहायता करने के लिए आइसोटाइप एंटीबॉडी नियंत्रणों को नियोजित करना चाहिए, जैसा कि चित्र 4A (ii), B (ii) में प्रदर्शित किया गया है। सेल मलबे को बाहर करने के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित मस्तूल सेल आबादी पर गेट करना भी आवश्यक है जैसा कि चित्रा 4 ए (आई) और 4 बी (आई) में दिखाया गया है, जो गैर-विशेष रूप से एंटीबॉडी को भी बांध सकता है। कोमल micropipetting का उपयोग बायोइंक हाइड्रोजेल सब्सट्रेट की सतह से BMMCs को पुनः प्राप्त करते समय किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं पर लगाए गए कतरनी बलों को कम किया जा सके, जो सेल झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है और परिणामस्वरूप कृत्रिम रूप से पीआई के साथ ऊंचा धुंधला हो सकता है। पीआई-सना हुआ बीएमएमसी का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा स्टेनिंग इनक्यूबेशन अवधि समाप्त होने के तुरंत बाद किया जाना चाहिए क्योंकि पीआई स्टेनिंग माध्यम, जो पीबीएस -0.5% डब्ल्यू / वी बीएसए पर आधारित है, सेल संस्कृति माध्यम के बाहर विस्तारित अवधि के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने का इरादा नहीं है। क्योंकि पीआई केवल समझौता कोशिका झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश करता है, यह उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता के साथ परिगलित कोशिकाओं को दागने में सक्षम है। हालांकि, पीआई एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाने में असमर्थ है, जो बरकरार सेल झिल्ली को बनाए रखते हैं।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित पीआई-बहिष्करण प्रवाह साइटोमेट्रिक परख को एनेक्सिन-वी-फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) के साथ संवर्धित किया जा सकता है, जो विशेष रूप से फॉस्फोलिपिड, फॉस्फेटिडिलसेरीन को बांधता है, जो एपोप्टोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली के बाहरी पत्रक में स्थानांतरित होता है। हालांकि, मुआवजे के लिए आवश्यक है प्रतिदीप्ति उत्सर्जन खून के माध्यम से FITC डिटेक्टर चैनल में पीआई और इसके विपरीत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया. प्रदान की गई 24-अच्छी तरह से प्लेट जी-कोड से 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बायोप्रिंटर तैयार करने में, यह आवश्यक है कि शुरुआती बिंदु अंशांकन को सटीक रूप से किया जाए, जिससे अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र के एक्स- और वाई-निर्देशांक दर्ज किए जाते हैं, और जी-कोड फ़ाइल को लाइन 1 पर इन एक्स- और वाई-निर्देशांक के साथ अपडेट किया जाता है। यदि ये प्रारंभिक अंशांकन चरण सही ढंग से निष्पादित नहीं किए जाते हैं, तो प्रिंटहेड्स मुद्रण के प्रारंभ में सही प्रारंभिक बिंदु पर नहीं जाएँगे. जेड-अक्ष का सही अंशांकन समान रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप प्रिंटहेड के नोजल को प्रिंटबेड या प्रिंटिंग की शुरुआत में 24-वेल प्लेट से टकराया जा सकता है।

5 x 5 x 1 मिमी 2-परत रेक्टिलिनियर ग्रिड निर्माण (चित्रा 5C (iii)) का योजनाबद्ध आरेख, सब्सट्रेट बनाने वाले बहिष्कृत बायोइंक फिलामेंट्स के बीच छिद्रों की उपस्थिति को दर्शाता है। फिलामेंट्स के छिद्रों और व्यास का आकार तीन मापदंडों पर निर्भर करता है: (i) प्रिंट नोजल की यात्रा की गति, (ii) कारतूस के भीतर बायोइंक पर लागू एक्सट्रूज़न दबाव, और (iii) प्रिंट नोजल व्यास। बड़े फिलामेंट व्यास और छोटे छिद्रों के साथ बायोइंक सब्सट्रेट्स को धीमी प्रिंट नोजल गति, उच्च एक्सट्रूज़न दबाव (>12 केपीए), और बड़े व्यास प्रिंट नोजल (22 जी) का उपयोग करके मुद्रित किया जा सकता है। इसके विपरीत, एक तेज प्रिंट नोजल गति, कम एक्सट्रूज़न दबाव (<12 केपीए), और छोटे व्यास प्रिंट नोजल (27 जी) के परिणामस्वरूप महीन फिलामेंट्स और बड़े छिद्रों के साथ सब्सट्रेट होंगे। हालांकि, अपर्याप्त रूप से उच्च एक्सट्रूज़न दबाव के परिणामस्वरूप बायोइंक के असंगत clumps को निरंतर फिलामेंट्स के बजाय बाहर निकाला जा रहा है, जो 3 डी बायोप्रिंटेड सब्सट्रेट की गुणवत्ता और संरचनात्मक अखंडता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगा।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल उम्मीदवार बायोइंक थर्मल जेलेशन से गुजरता है जब एगारोज़ कमरे के तापमान पर ठंडा हो जाता है। इसके विपरीत, इस प्रोटोकॉल में 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक बायोइंक बायोइंक फॉर्मूलेशन में सोडियम एल्गिनेट को शामिल करने के कारण CaCl2 के साथ आयनिक क्रॉसलिंकिंग से गुजरता है। इसलिए, सब्सट्रेट के क्रॉसलिंकिंग (जेलेशन) की सुविधा के लिए बायोप्रिंटिंग के बाद बायोप्रिंटिंग के बाद 50 एमएम CaCl2 समाधान में बायोप्रिंटेड एफएनसी / एल्गिनेट / डी-मैनीटोल मचानों को विसर्जित करना आवश्यक है। CaCl2 के साथ आयनिक क्रॉसलिंकिंग चरण की चूक के परिणामस्वरूप FNC / alginate / D-mannitol scaffolds का विघटन होगा जब वे सेल संस्कृति माध्यम में डूब जाते हैं। वास्तविक 3 डी बायोप्रिंटिंग में अपने आवेदन में सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल बायोइंक फॉर्मूलेशन की सबसे महत्वपूर्ण सीमा एगारोज़ (90-95 डिग्री सेल्सियस) का असाधारण रूप से उच्च पिघलने का तापमान है। भले ही इस अध्ययन में उपयोग किए गए 3 डी बायोप्रिंटर के प्रिंटहेड्स 130 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम तापमान तक पहुंच सकते हैं, सीएनसी / एगरोज / डी-मैनिटोल के बाहर निकाले गए फिलामेंट्स संभवतः तेजी से फैल जाएंगे क्योंकि सब्सट्रेट के निर्माण के लिए क्रमिक परतों को मुद्रित किया जाता है। सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनिटोल बायोइंक फॉर्मूलेशन की इस सीमा को या तो सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल बायोइंक को सीधे जेलेशन में तेजी लाने के लिए एक ठंडा प्रिंटबेड पर प्रिंट करके, या सोडियम एल्जिनेट के साथ एगारोज़ को प्रतिस्थापित करके दरकिनार किया जा सकता है, जिसे कमरे के तापमान पर बाहर निकाला जा सकता है और 5 मिनट के भीतर 50 एमएम CaCl2 के साथ तेजी से आयनिक क्रॉसलिंकिंग से गुजरता है।

यह प्रोटोकॉल तेजी से स्क्रीन करने और बायोइंक योगों को बाहर करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है जो संवेदनशील प्रतिरक्षाविज्ञानी कोशिकाओं के साथ खराब जैव रासायनिक संगतता प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि मस्तूल कोशिकाएं, जिन्हें वायवीय-एक्सट्रूज़न 3 डी बायोप्रिंटिंग के अधीन नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है क्योंकि इसे मल्टीप्लेक्स स्क्रीनिंग परख करने के लिए अपेक्षाकृत कम मात्रा में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, पूर्व-तैयार बायोइंक-सेल मिश्रण को बहुत उच्च सेल घनत्व (>107 कोशिकाओं / एमएल) पर बायोप्रिंट करने की आवश्यकता होती है, जो एक बायोकॉम्पैटिबिलिटी स्क्रीनिंग परख करने के लिए महंगा और समय लेने वाला साबित हो सकता है, खासकर जब प्राथमिक कोशिकाओं को संवर्धित किया जाता है जो महंगे पुनः संयोजक विकास कारकों पर निर्भर होते हैं।

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Disclosures

इस काम को राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा और अल्बर्टा इनोवेट्स द्वारा समर्थित किया गया था।

Acknowledgments

हम सीएनसी और केन हैरिस और जे-यंग चो को सीएनसी / एगारोज़ / डी-मैनीटोल मैट्रिक्स तैयार करते समय उनकी तकनीकी सलाह के लिए प्रदान करने के लिए अल्बर्टा इनोवेट्स को धन्यवाद देते हैं। हम बेन हॉफमैन, हीदर विंचेल और निकोल डायमेंटाइड्स को उनकी तकनीकी सलाह और INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर के सेटअप और अंशांकन के साथ समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

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Bioengineering अंक 171
अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिका संस्कृति के लिए एक क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज एम्बेडेड Agarose Biomaterial स्याही का निर्माण
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Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. … More

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

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