Summary
In vitro transcriptie assays kunnen de mechanismen van transcriptionele regulatie in Borreliella burgdorferi ontcijferen. Dit protocol beschrijft de stappen om B. burgdorferi RNA polymerase te zuiveren en in vitro transcriptiereacties uit te voeren. Experimentele benaderingen met behulp van in vitro transcriptietests vereisen betrouwbare zuivering en opslag van actief RNA-polymerase.
Abstract
Borreliella burgdorferi is een bacteriële ziekteverwekker met beperkte metabole en genomische repertoires. B. burgdorferi transiteert extracellulair tussen gewervelde dieren en teken en hermodelleert zijn transcriptionele profiel drastisch om te overleven in ongelijksoortige omgevingen tijdens infectie. Een focus van B. burgdorferi-studies is om duidelijk te begrijpen hoe de bacterie reageert op zijn omgeving door transcriptieveranderingen. In vitro transcriptietesten maken het mogelijk om de basismechanismen van transcriptionele regulatie biochemisch te ontleden. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat B. burgdorferi RNA-polymerasezuivering en -opslag, sigmafactorzuivering, DNA-sjabloongeneratie en in vitro transcriptietests beschrijft. Het protocol beschrijft het gebruik van RNA-polymerase gezuiverd uit B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC is een eerder gepubliceerde stam met een 10XHis-tag op het rpoC-gen dat codeert voor de grootste subeenheid van het RNA-polymerase. In vitro transcriptie assays bestaan uit het RNA polymerase gezuiverd uit stam 5A4-RpoC, een recombinante versie van de huishouding sigma factor RpoD, en een PCR-gegenereerde dubbelstrengs DNA sjabloon. Hoewel de eiwitzuiveringstechnieken en benaderingen voor het samenstellen van in vitro transcriptietests conceptueel goed worden begrepen en relatief vaak voorkomen, verschillen de behandelingsoverwegingen voor RNA-polymerasen vaak van organisme tot organisme. Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen voor enzymatische studies op het B. burgdorferi RNA-polymerase. De methode kan worden aangepast om de rol van transcriptiefactoren, promotors en posttranslationele modificaties op de activiteit van het RNA-polymerase te testen.
Introduction
De ziekte van Lyme en relapsing fever worden veroorzaakt door spirocheetpathogenen in de geslachten Borrelia en Borreliella 1,2,3. De ziekte van Lyme is een prominente door vectoren overgedragen ziekte in Noord-Amerika en daarom is Borreliella burgdorferi een prominent modelorganisme om spirocheetbiologie te bestuderen 4,5. Onderzoek naar de B. burgdorferi-mechanismen van transcriptionele regulatie heeft tot doel de aanpassingen aan veranderingen in de omgeving beter te begrijpen terwijl het fietst tussen zijn tekenvector en zoogdiergastheren 6,7. Veranderingen in pH, temperatuur, osmolariteit, beschikbaarheid van voedingsstoffen, vetzuren met een korte keten, organische zuren en opgeloste zuurstof- en koolstofdioxideniveaus moduleren de expressie van genen die belangrijk zijn voor B. burgdorferi om te overleven in zijn geleedpotige vector en om dieren te infecteren 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Het koppelen van deze reacties aan stimuli met regulerende mechanismen is een belangrijk aspect geweest van het onderzoek van B. burgdorferi 19.
Transcriptiefactoren en sigmafactoren regelen de transcriptie van genen die cellulaire processen uitvoeren. Lyme en relapsing fever spirocheten herbergen een relatief schaarse set transcriptiefactoren en alternatieve sigmafactoren. Desondanks zijn er complexe transcriptionele veranderingen die B. burgdorferi-reacties op de omgeving sturen20,21,22. De specifieke mechanismen die transcriptionele veranderingen in B. burgdorferi veroorzaken als reactie op veranderingen in de omgeving, blijven onduidelijk. In vitro transcriptie assays zijn krachtige hulpmiddelen voor het gebruik van een biochemische benadering om de functie en regulerende mechanismen van transcriptiefactoren en sigmafactoren te testen23,24,25,26.
Een in vitro transcriptietestsysteem met behulp van het B. burgdorferi RNA-polymerase werd onlangs vastgesteld24. Omdat bacteriën vaak unieke cellulaire fysiologieën hebben, reageren RNA-polymerasen van verschillende soorten en geslachten verschillend op enzymzuivering, enzymopslag en reactiebufferomstandigheden27. B. burgdorferi is ook genetisch ver verwijderd van de vele bacteriesoorten waarin RNA-polymerasen zijn bestudeerd20. Aspecten van enzympreparatie zoals lysis, wassen en elutiebuffercondities, opslagbuffer, in vitro transcriptiereactiebuffer en de methode van testconstructie kunnen allemaal de RNA-polymeraseactiviteit veranderen. Hierin bieden we een protocol voor de zuivering van RNA-polymerase en sigmafactor RpoD, de productie van lineaire dubbelstrengs DNA-sjabloon en de constructie van in vitro transcriptietests om reproduceerbaarheid tussen laboratoria met behulp van dit systeem te vergemakkelijken. We beschrijven een voorbeeldreactie om het lineaire bereik voor RpoD-afhankelijke transcriptie aan te tonen en bespreken beperkingen en alternatieven voor deze aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zuivering van het RNA-polymerase en bereiding van RNA-polymerasevoorraad
- Verzamel de celpellet van 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X gekweekt in BSKIE-medium in een microaerofiele omgeving (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) tot een dichtheid van2-4 x 107 cellen / ml met behulp van eerder beschreven celverzamelingsprotocollen28,29. Voer centrifugatie uit bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten in centrifugaalflessen van 500 ml en giet het supernatant af.
- Resuspendeer de cellen in 30 ml ijskoude HN-buffer (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Herhaal de centrifugatiestap zoals hierboven beschreven met behulp van een centrifugebuis van 50 ml en decanteer het supernatant.
LET OP: Stoppunt. Bevries de celpellet bij −80 °C om cellen maximaal 2 weken op te slaan of ga onmiddellijk over tot cellysis. - Houd de cellen, lysaat en gezuiverde eiwitten op 4 °C of op ijs, tenzij ze bevriezen. Houd RNA-polymerase in een reducerende omgeving door vers bereide DTT in een concentratie van 2 mM toe te voegen aan elke buffer die in dit protocol wordt gebruikt en handhaaf de pH 8,0.
- Bereid lysaat uit de B. burgdorferi-celpellet met behulp van een commerciële bacteriële lysiskit volgens de instructies van de kit. Resuspendie van de pellet in 10-15 ml kamertemperatuur (RT) B-PER oplossing zonder proteaseremmer en laat de lysis 5 minuten op ijs doorgaan. Het lysisvolume is afhankelijk van de grootte van de celpellet, zoals beschreven in de instructies van de kit.
- Voeg proteaseremmercocktail toe aan de lysisoplossing, gevolgd door drie ultrasoonapparaatrondes, zoals beschreven in de sectie met representatieve resultaten.
OPMERKING: Als alternatief, lyseer de cellen in een Franse drukcel zoals eerder beschreven24. Sla stap 1.4 over. en stap 1.5. - Verduidelijk het cellysaat met behulp van centrifugatie en filtratie met behulp van een centrifugebuis van 50 ml. Vul het volume van de buis tot ten minste 30 ml totaal volume door de kobaltkolombelastingbuffer (tabel 1) aan de oplossing toe te voegen. Pellet het celafval door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 30 minuten.
- Filter het supernatant met een spuitfilter van 0,45 μm.
- Verdun het lysaat in de kobaltkolombelastingsbuffer (tabel 1) met een eindverdunningsverhouding van 1:10.
- Voer affiniteitschromatografie uit op het geklaarde cellysaatsupernatant met behulp van een kobalt- of nikkelharskolom volgens de instructies van de fabrikant. Zie de sectie representatieve resultaten voor een voorbeeld. Gebruik de buffers in tabel 1. Verzamel de doorstroom-, was- en elutiemonsters voor analyse.
- Wissel het RNA-polymerase in de elutiebufferoplossing onmiddellijk om in een RNA-polymeraseopslagbufferoplossing (tabel 1) met behulp van een bufferwisselkolom volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid de vriesvoorraden voor door het RNA-polymerase met behulp van 10 kDa-cutoff centrifugaalfiltereenheden te concentreren tot een concentratie van 0,2-0,4 mg/ml bepaald door spectrofotometrie (A280nm zonder extinctiecoëfficiëntaanpassing [1 abs bij 1 cm = 1 mg·ml−1]).
- Aliquot RNA-polymerasevriezer slaat in volumes van 20-50 μL op in PCR-buizen en slaat het RNA-polymerase op bij −80 °C.
- Bepaal de kwaliteit van de affiniteitschromatografie met SDS-PAGE en meet de totale eiwitopbrengst door spectrofotometrie of BCA-assay. Voer de monsters uit op een 7,5% polyacrylamide gel op 120 V gedurende 50 minuten voor een goede resolutie door SDS-PAGE.
2. Zuivering van recombinant RpoD en bereiding van RpoD-voorraad
- Kweek en induceer de expressie van Maltose Binding Protein-tagged recombinant B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) in BL21::MBP-RpoDBb, zoals beschreven in de handleiding voor eiwitfusie- en zuiveringssystemen die in de materiaaltabel wordt vermeld, en verzamel de cellen door centrifugeren.
LET OP: Stoppunt. Bevries de celpellets bij −80 °C om cellen maximaal 2 weken op te slaan of ga onmiddellijk over tot cellysis. - Voer lysis uit met behulp van een commerciële bacteriële cellysiskit of Franse drukcel. Zie het voorbeeld lysisbuffer in tabel 1.
- Verduidelijk het cellysaat met behulp van centrifugatie en filtratie. Pellet het celafval door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 30 minuten. Filter het supernatant met een filter van 0,45 μm.
- Extraheer MBP-RpoD met behulp van een eiwitextractieprotocol voor het expressiesysteem. Zie de sectie representatieve resultaten voor bijvoorbeeld implementatiedetails en resultaten.
- Bepaal de kwaliteit van het affiniteitschromatografieproces en de elutie door SDS-PAGE en meet de eiwitopbrengst door spectrofotometrie (A280nm zonder extinctiecoëfficiëntaanpassing [1 abs bij 1 cm = 1 mg·ml−1]). Gebruik 10% polyacrylamide gel bij 200 V gedurende 30 minuten voor scheiding in SDS-PAGE.
- Concentreer MBP-RpoD met behulp van een centrifugaalfilter met 10 kDa-cutoff tot een concentratie van >2 mg/ml, bepaald door spectrofotometrie.
- Splijt MBP van RpoD op de Factor Xa-splitsingsplaats. Voeg CaCl 2 toe aan de affiniteitschromatografie-elutiefracties die MBP-RpoD bevatten in een concentratie van2 mM. Voeg 200 μg Factor Xa Protease toe voor elke 30 mg gezuiverd eiwit. Incubeer 's nachts bij RT.
- Bevestig volledige splitsing van MBP van RpoD door SDS-PAGE. Gebruik 10% polyacrylamide gel bij 200 V gedurende 30 minuten voor scheiding in SDS-PAGE.
- Verdun de MBP en RpoD-bevattende oplossing in een verhouding van 1:10 met een heparinebindende buffer.
- Scheid MBP en RpoD op de heparinekolom door FPLC. Zie tabel 2 voor FPLC-instellingen.
- Bepaal de kwaliteit van de affiniteitschromatografieproducten met SDS-PAGE en meet de eiwitopbrengst door spectrofotometrie. Gebruik 10% polyacrylamide gel bij 200 V gedurende 30 minuten voor scheiding in SDS-PAGE.
- Concentreer de elutiefracties die RpoD bevatten met behulp van een centrifugaalfilter met 10 kDa-cutoff tot een eindvolume van 2-3 ml.
- Bufferwissel de geconcentreerde RpoD-elutiefracties uit naar opslagbuffer met behulp van een gelfiltratiekolom.
- Concentreer de RpoD-voorraad met behulp van een centrifugaalfilter met 10 kDa-cutoff tot een concentratie van 0,2-0,8 mg/ml zoals bepaald door spectrofotometrie.
- Aliquot RpoD voorraad bij 20-50 μL volumes in PCR-buizen en opslaan bij −80 °C.
3. Voorbereiding van DNA-sjabloonvoorraad
- PCR versterkt het 500 bp-gebied rond een RpoD-aangedreven promotorlocatie van B. burgdorferi genomisch DNA met behulp van een 200 μL-reactie (tabel 3).
- Zuiver de PCR-producten met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit. Elueer het DNA in moleculaire biologie graad H2O.
- Pas de molaire concentratie van de PCR-gegenereerde DNA-sjablonen aan tot 100 nM door verdunning in moleculaire biologiegraad H2O.
4. Voer in vitro transcriptie uit met de integratie van radioactief gelabelde nucleotiden
- Bereid een experimenteel plan voor transcriptie in vitro voor. Bepaal de RNA-polymerase-, RpoD- en DNA-sjabloonconcentraties. Bepaal de aliquot volumes en pipetteerorders voor de reactiebuizen. Zie tabel 4 en figuur 1 voor een voorbeeld.
OPMERKING: Neem controles op in het experimentele plan, zoals reacties die geen RNA-polymerase, alternatieve polymerase, geen sjabloon of alternatieve sjablonen bevatten. - Bereken het volume van α-32P-ATP dat nodig is voor het experiment. Neem dit op in het experimenteerplan. Typisch, neem 2 μCi activiteit per in vitro transcriptiereactie op voor fosforschermdetectie.
- Bereid de werkoppervlakken voor, inclusief de stralingsbank, om het risico op stralingsbesmetting te verminderen.
- Ontdooi verse aliquots van RNA-polymerase, Rpo, 5x buffer NTP en sjabloonstandaardoplossingen op ijs. Meng alle ontdooide bevroren bouillons grondig voordat u gaat pipetteren.
- Bereid een hoofdreactiemengsel en een afzonderlijk NTP-mengsel voor radioactief gelabelde nucleotiden volgens het experimentele plan.
- Doseer de controlereacties en experimentele sets in PCR-buizen ter voorbereiding op het toevoegen van radiolabel in de reactie. Doseer voorzichtig H2O, reactiemastermix, RNA-polymerase en RpoD in aangewezen PCR-buizen en meng door pipetteren.
- Breng de voorbereide materialen over naar een stralingsbank.
- Voeg α-32P-ATP toe aan NTP en meng door zacht pipetteren.
LET OP: Gebruik tijdens het werken met radioactief materiaal geschikte beschermingsmiddelen en behandelingsprocedures voor radioactieve isotopen. - Voeg NTP toe aan de buisjes met de in vitro transcriptiereactiemengsels uit stap 4.6.
- Start de in vitro transcriptiereactie met de toevoeging van een DNA-sjabloon. Meng het reactievolume door voorzichtig te pipetteren.
- Incubeer buizen bij 37 °C gedurende 5 minuten in een thermocycler of warmteblok.
- Verwijder de reacties van de thermocycler of het warmteblok en voeg de 2x RNA-ladende kleurstof met 50% formamide toe aan een gelijk reactievolume om in vitro transcriptiereacties te stoppen.
- Denatureer de enzymen door gedurende 5 minuten reacties bij 65 °C te incuberen in een thermocycler of warmteblok.
- Scheid RNA in het in vitro transcriptiereactiemengsel door gelelektroforese met behulp van 10% -15% TBE ureum polyacrylamide gels bij 180 V gedurende 30-45 min.
OPMERKING: Afhankelijk van de gel-elektroforeseomstandigheden kan de bufferoplossing besmet zijn met radioactief gelabelde nucleotiden of kan de gel de meeste of alle radioactief gelabelde nucleotiden bevatten. Plan voor een goede opslag of verwijdering van radioactiviteit. - Stel het radioactief gelabelde RNA voor met behulp van fosfoscreen na het verwijderen van een deel van de gel dat niet-geïncorporeerde radioactief gelabelde ATP bevat. Stel de gel 's nachts (16 uur) bloot aan het fosfoscherm en beeld met behulp van een fosfoscreen-imager (100 μm resolutie, 700 V PMT-buisspanning).
- Analyseer de gegevens met behulp van densitometriemethoden24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een in vitro transcriptiereactie waarbij de beperkende stap van de reactie sigmafactor-gemedieerde transcriptie-initiatie is, moet de transcriptieactiviteit lineair toenemen met de hoeveelheid sigmafactor. We presenteren de voorbereiding van in vitro transcriptie-experimenten die een reeks RpoD-concentraties testen, samen met twee concentraties RNA-polymerase om het resulterende variërende signaal van radioactief gelabelde nucleotide-opname in RNA-producten te observeren. Representatieve resultaten van de bereiding van RNA-polymerase, RpoD en dubbelstrengs DNA-sjabloonvoorraden worden getoond. De representatieve in vitro transcriptiereacties dienen als voorbeeld van RNA-polymeraseactiviteitsniveaus die aanvaardbaar zijn voor analyse.
Voor de zuivering van RNA-polymerase werd een 4 L-cultuur van B. burgdorferi RpoC-His10X gekweekt bij 34 °C onder microaerofiele omstandigheden (5% CO 2, 3% O2). De culturen werden nauwlettend gecontroleerd op spirocheetdichtheid met behulp van donkerveldmicroscopie en verzameld voordat ze dichtheden bereikten die hoger waren dan 4 x 107 spirocheten / ml. De cellen werden geresuspendeerd in B-PER-mengsel voor lysis (tabel 1). De celpellet werd gehomogeniseerd door pipetteren, gevolgd door 5 minuten incubatie bij RT en daaropvolgende ultrasoonapparaatrondes uitgevoerd gedurende 3 s in drievoud. Geklaarde lysaten werden verdund met kobaltkolomlaadbuffer en 5 ml kobalthars tot een totaal volume van 180 ml. RpoC-His10X mocht aan de kobalthars binden door het mengsel gedurende 1 uur bij 4 °C te nutten. Het mengsel werd overgebracht naar een zwaartekrachtstroomkolom en vijf keer gewassen met 40 ml kolomwasbuffer. Gebonden eiwit werd vrijgegeven door 5 ml elutiebuffer door de kolom te laten gaan en elutie werd zeven keer herhaald. Monsters van de doorstroom-, was- en elutiefracties werden gescheiden door SDS-PAGE en afgebeeld door vlekincorporatie (figuur 1). Het RNA-polymerasekerncomplex bestaat uit RpoC, RpoB en RpoA, met een grootte van respectievelijk 154 kDa, 129 kDa en 38,5 kDa. Het representatieve resultaat in figuur 1 toont drie prominente banden ter grootte van de drie peptiden waaruit het RNA-polymerasecomplex bestaat. De doorstroming van affiniteitschromatografie bevatte 0,5-1 mg/ml eiwit met een verhouding van 260/280 tussen 1,0 en 1,7, wat wijst op een hogere concentratie nucleïnezuren. De RNA-polymerase-eiwitopbrengst na de concentratie van het eiwitmengsel zoals bepaald door spectrofotometrie was 0,3 mg/ml.
Om RpoD-eiwitvoorraden te bereiden, werd recombinant RpoD met een C-terminale Maltose Binding Protein-tag uitgedrukt uit een pMAL-C5X-plasmide in BL21 (DE3) pLysS E. coli. 2 L E. coli werd geteeld bij 32 °C tot een OD600nm van 0,5. De kweek werd vervolgens behandeld met 0,3 mM IPTG om de expressie van RpoD gedurende 1 uur te induceren. De cellen werden gekorreld door centrifugatie en gelyseerd in B-PER. De resulterende 200 ml verdund cellysaat werd gefilterd door 10 ml amylosehars. De hars werd acht keer gewassen met 40 ml bindingsbuffer om rest-DNA en peptiden te verwijderen. MBP-gelabelde RpoD werd vijf keer geëlueerd met 5 ml elutiebuffer in de harskolom. De doorstroming van de bind- en wasstappen en de elutiefracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 2A). De belangrijkste component in de elutiefractie is een peptide van ~115 kDa, overeenkomend met de grootte van de MBP-gelabelde recombinant B. burgdorferi RpoD. De elutiefracties werden gecombineerd, de CaCl 2-concentratie werd aangepast tot2 mM en 100 μg FactorXa-protease werd toegevoegd aan 40 mg gezuiverd eiwit. Na nachtelijke vertering bij kamertemperatuur werd de reactie geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 2B). Na splitsing met Factor Xa-protease waren de twee belangrijkste producten in het mengsel RpoD (73,6 kDa) en MBP (45 kDa). Het mengsel van RpoD- en MBP-eiwitten werd gescheiden met behulp van heparine-affiniteitschromatografie. Het mengsel werd verdund in een verhouding van 1:10 in heparinebindende buffer en geladen in een heparinegebonden harskolom in een FPLC. RpoD werd geëlueerd met een toenemende gradiënt van NaCl tot een concentratie van 1 M. Toen de fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE, was een belangrijke band van 73,6 kDa-grootte zichtbaar in de elutiefractie in het bereik van 400-600 mM NaCl (figuur 2C). Sommige gedegradeerde RpoD-fragmenten werden geco-gezuiverd. RpoD-bevattende fracties werden gecombineerd, buffer uitgewisseld in RpoD-opslagbuffer en vervolgens geconcentreerd met behulp van een 10 kDa-cutoff centrifugaalfilter. De uiteindelijke RpoD-concentratie was 0,67 mg/ml (9,1 mM) zoals bepaald door spectrofotometrie.
Een dubbelstrengs DNA-sjabloon dat de promotorsite van B. burgdorferi flgB omvat, werd gegenereerd door PCR. De flgB-promotor werd versterkt door primers die overeenkwamen met 250 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de promotor (tabel 6) met behulp van een 200 μL-reactie met 30 ng B. burgdorferi-DNA 24,30. Het PCR-product werd geanalyseerd door gel-elektroforese in een 1% agarose-gel (figuur 3). Het PCR-product was ongeveer 500 bp groot met schijnbare homogeniteit. Belangrijk is dat zouten en celcomponentbesmetting kunnen bijdragen aan de variabiliteit van in vitro transcriptiereactie-uitkomsten; we zorgen ervoor dat het DNA-sjabloon grondig wordt ontzout op de PCR-zuiveringskolom.
Een experimenteel schema waarin transcriptie wordt geïnitieerd door de toevoeging van sjabloon-DNA kan de snelheid van promotorherkenning en transcriptie-initiatie testen. In onze representatieve experimenten werd een verdunningsreeks RpoD-eiwit bereid door tweevoudige verdunningen in water variërend van 16 nM-1 μM. Er werd een mastermix gemaakt met RNA-polymerase in een reactiebuffer met tweewaardige kationen die nodig zijn voor activiteit (tabel 4 en tabel 5). De RpoD en mastermix werden samen op ijs gealiquoteerd. De mastermix met RNA-polymerase en RpoD mocht incuberen terwijl andere stappen van de in vitro transcriptie werden voorbereid. We hebben drie controlereacties opgenomen: een positieve controlereactie die afzonderlijk van de mastermix is voorbereid, een negatieve controlereactie die geen sjabloon-DNA bevat om ervoor te zorgen dat het in vitro transcriptiesignaal sjabloonafhankelijk was, en een negatieve controlereactie zonder RNA-polymerase om ervoor te zorgen dat het signaal RNA-polymerase-afhankelijk was. Radioactief gelabelde nucleotiden werden aan de reactie toegevoegd door 5 μL (α-32P-ATP) te mengen met 20 μL 10x NTP-stammengsel om voldoende aliquot te creëren voor 20 reacties om onherstelbare volumes te compenseren. Ten slotte werd sjabloon-DNA dat codeert voor de flgB-promotor in de reactiebuizen geïntroduceerd door pipetteren volgens de eerder geplande pipetteervolgorde (figuur 4).
Het signaal van de RNA-fragmenten gegenereerd door in vitro transcriptie werd gedetecteerd door fosforscreening na een blootstellingsperiode van 16 uur van de TBE-ureumgel met RNA gescheiden door gelelektroforese. Een experiment met 50 nM RNA-polymerase en RpoD in het bereik van 500 nM tot 16 nM genereerde RNA-producten van 250 bp (figuur 5). Voor elke tweevoudige verdunning van de RpoD-concentratie was er een lager niveau van geaccumuleerd RNA-product. Er was een reeks producten met een lagere bp die onder de prominente band verschenen, wat wijst op onvolledige RNA-fragmenten als gevolg van transcriptiestop of gefragmenteerd DNA-sjabloon. RNA-producten waren afwezig in de no template control, wat aangeeft dat er geen exogene DNA-fragmenten waren die bijdroegen aan het signaal in deze assay. Er werd geen signaal gedetecteerd in de no RNA polymerase controle, wat aangeeft dat het B. burgdorferi RNA polymerase het enige polymerase was dat bijdroeg aan de productie van RNA in deze assay.
In een tweede experiment gebruikten we een lagere concentratie van 25 nM RNA-polymerase (figuur 6). Er werden minder RNA-producten gedetecteerd in het bereik van geteste RpoD-concentraties in vergelijking met figuur 5 en de intensiteit van het achtergrondsignaal was hoger. Dit is problematisch voor downstream-analyse door densitometrie. Toen het fosforbeeld werd geanalyseerd door densitometrie (figuur 7), gaf het densitometriesignaal verkregen uit het fosfoscherm een lineair verband aan tussen de hoeveelheid RpoD die in beide experimenten in de reactie aanwezig was. In het experiment met een hoog achtergrondsignaal was de reactie met 25 nM RNA-polymerase en minder dan 100 nM RpoD echter onbetrouwbaar voor relatieve transcriptieniveauvergelijkingen.
Figuur 1: Scheiding van His-tagged B. burgdorferi RNA polymerase gezuiverd door affiniteitschromatografie. De doorstroomfractie van cellysaat (baan 1), eerste wasfractie (baan 2), laatste wasfractie (baan 3) en vijf elutiefracties (baan 4-8) werden verdund in 2x monsterlaadbuffer, gekookt en gescheiden door SDS-PAGE in een gradiënt polyacrylamidegel bij 200 V gedurende 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van RpoD-zuivering door gel-elektroforese. (A) Gepoolde doorstroomfracties (rijstrook 1 en rijstrook 2), wasfracties (rijstroken 3-5) en elutiefracties (rijstroken 6-10) van de zuivering van MBP-gelabelde RpoD door amyloseharsaffiniteitschromatografie. (B) Eiwitmengsel na de splitsing van MBP en RpoD met behulp van Factor Xa-protease. (C) Doorstroomoplossing (baan 1) en elutiefracties met een toenemende gradiënt van NaCl (banen 2-9) van heparineaffiniteitschromatografie naar gescheiden MBP en RpoD. In elke gepresenteerde gel werden de monsters gemengd met 2x laadbuffer, gekookt en gescheiden in een gradiënt polyacrylamidegel met behulp van SDS-PAGE bij 200 V gedurende 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: PCR-generatie van in vitro transcriptiesjablonen. 500 bp-formaat amplicon met flgB-promotor (baan 1 en baan 2) en controle-PCR-reacties met amplicons van andere promotorlocaties (banen 3-4) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Experimenteel arrangement en pipetteervolgordeplan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: RpoD-afhankelijke variabiliteit in fosforbeeldsignaal van RNA gegenereerd door in vitro transcriptie met behulp van B. burgdorferi RNA-polymerase. In vitro transcriptiereacties bevatten 50 nM RNA-polymerase en verschillende niveaus van RpoD aangegeven boven de banden24. RNA werd gescheiden door een 10% TBE-ureumgel en een fosforscherm werd gebruikt om het signaal van radioactief verval gedurende 16 uur op te vangen. Dit cijfer is aangepast van Boyle et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: RpoD-afhankelijke variabiliteit in fosforbeeldsignaal van RNA gegenereerd door in vitro transcriptie. In vitro transcriptie bevatte 25 nM RNA-polymerase en verschillende niveaus van RpoD aangegeven boven de banden. RNA werd gescheiden door een 15% TBE-ureumgel en een fosforscherm werd gebruikt om het signaal van radioactief verval gedurende 16 uur op te vangen. De lagere RNA-polymeraseconcentratie en het hogere achtergrondsignaal verhoogden de moeilijkheid van nauwkeurige metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Toenemende radioactief gelabelde RNA-accumulatie in in vitro transcriptiereacties met toenemende RpoD-niveaus. De signalen die in de fosforschermbeeldvorming werden gedetecteerd, werden geanalyseerd door densitometrie zonder achtergrondaftrek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Mediarecepten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: FPLC-instellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: PCR-reacties. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: 50 nM RNA polymerase experimenteel plan en volumeberekening. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: 25 nM RNA polymerase experimenteel plan en volumeberekening. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: In dit protocol gebruikte stammen en oligonucleotiden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro transcriptietests geconstrueerd met behulp van het gepresenteerde protocol werden onlangs gebruikt om de rol van een transcriptiefactor in B. burgdorferi te bestuderen en kunnen worden toegepast om vergelijkbare experimenten te bouwen met behulp van andere transcriptiefactoren, sigmafactoren en moleculen23. Zodra actief RNA-polymerase uit B. burgdorferi is verkregen en de activiteit ervan is gedetecteerd, kunnen componenten en omstandigheden binnen de in vitro transcriptietests worden gewijzigd. De test is zeer flexibel en aanpasbaar. De reacties zijn modulair opgebouwd uit bevroren voorraden en vereisen weinig doorlooptijd zodra de experimentele parameters zijn gekozen. Bij voldoende voorraad kunnen meerdere experimenten op 1 dag worden uitgevoerd.
Het verkrijgen van actief RNA-polymerase is het meest kritische aspect van in vitro transcriptiereactievoorbereiding. We raden aan om RNA-polymerase te oogsten uit cellen die zijn gegroeid tot de mid-logaritmische groeifase zoals beschreven in dit protocol. Bij het zuiveren van het RNA-polymerase van bacteriën, is de groeisnelheid opgemerkt als een belangrijke factor bij het zuiveren van actief RNA-polymerase. RNA-polymerasen kunnen posttranslationele modificaties accumuleren en kunnen geassocieerd zijn met remmende transcriptiefactoren in de stationaire fase van groei31. We zijn er niet in geslaagd om grote hoeveelheden actief RNA-polymerase te zuiveren uit B. burgdorferi-culturen die tot stationaire fase zijn gegroeid. De affiniteitschromatografiebenadering, in vergelijking met een fysische scheidingsbenadering32, is ook gunstig voor zuivering van B. burgdorferi omdat het organisme een lage dichtheid in cultuur bereikt en het accumuleren van grote hoeveelheden celcultuur relatief materiaalintensief is.
Tijdens zuiveringen van andere bacteriële RNA-polymerasen kunnen sigmafactoren in aanzienlijke hoeveelheden co-zuiveren, afhankelijk van de zuiveringsmethode en omstandigheden33,34,35,36. Co-zuivering van sigmafactoren kan downstream-experimenten beperken met behulp van alternatieve sigmafactoren, gemodificeerde sigmafactoren of een gebrek aan sigmafactoren. Bovendien is suppletie met de huishoudelijke sigmafactor RpoD gunstig voor het detecteren van activiteit, ongeacht de initiële co-zuivering van de sigmafactor37. Vanwege de flexibiliteit van het scheiden van de sigmafactor van de RNA-polymerasekern, beschouwen we het als voordelig dat sigmafactoren niet co-zuiveren onder de his-affiniteitschromatografie-zuiveringsomstandigheden die hier worden beschreven. Het is mogelijk dat de zuiveringscondities kunnen worden gewijzigd om meer intacte en actieve holo-enzymen te produceren die RpoD bevatten. Zoutconcentraties hebben bijvoorbeeld waarschijnlijk invloed op de stabiliteit van meerdere subeenheidsenzymen en het effect van imidazoolconcentratie op de stabiliteit van het B. burgdorferi RNA-polymerasecomplex of de tweewaardige kationincorporatie ervan is ook onbekend.
B. burgdorferi RNA polymerase enzymatische activiteit is gevoelig voor het type en de hoeveelheid aanwezige tweewaardige kationen24. We ontdekten dat mangaan nodig is voor maximale RNA-polymeraseactiviteit en magnesium leek in mindere mate bij te dragen aan activiteit. Verontreinigende ionen in water voegen een hoge mate van variabiliteit toe aan de enzymatische activiteit van RNA-polymerase. Bijgevolg is zeer zuiver water zoals moleculaire biologiekwaliteit, HPLC-graad en metaalanalysegraad H2O met weinig aanwezige metaalionen essentieel voor een hogere RNA-polymeraseactiviteit in het hier beschreven protocol. RNA-polymerasen zijn ook gevoelig voor pH en vereisen een reducerende omgeving tijdens zuivering27. Veranderde pH of het gebruik van BME als reductiemiddel heeft geresulteerd in inactief RNA-polymerase. We raden aan om in de handel verkrijgbare E. coli RNA-polymerase te gebruiken als controle om de juiste constructie van in vitro transcriptietestste garanderen 24. E. coli RNA-polymerase zal het mogelijk maken om de levensvatbaarheid van de nucleotiden, de sjabloonconstructiemethode, radiolabelincorporatie, RNA-scheiding en de signaaldetectiemethode te testen. Er moet echter worden opgemerkt dat B. burgdorferi RNA-polymerase specifieke tweewaardige kation-, buffer- en promotorvereisten heeft in vergelijking met E. coli.
Er zijn verschillende detectiemethoden beschikbaar voor in vitro transcriptiereacties. Kleurstofincorporatie en moleculaire bakentests zijn veelgebruikte alternatieven voor de radiolabeldetectiemethode38,39. Radioactief gelabelde nucleotide-opname is momenteel de meest gevoelige RNA-detectiemethode. Alternatieve assays vereisen meer RNA-polymerase om meetbare signaalniveaus te bereiken in vergelijking met radiolabel-assays. Bovendien hebben kleurstofincorporatie en moleculaire bakenmethoden meestal meer manieren om signalen onjuist te laten zijn. DNase-besmetting kan er bijvoorbeeld voor zorgen dat moleculaire bakens een signaal afgeven in afwezigheid van hun doelwit. Met behulp van radiolabel-incorporatie kan de relatieve activiteit van het B. burgdorferi RNA-polymerase-enzym zelfs op lage niveaus worden gedetecteerd, wat past bij initiële experimenten met RNA-polymerase-enzymen.
Hoewel de concentratie van B. burgdorferi RNA-polymerase-enzym in de reactie is gestandaardiseerd door spectrofotometrie, kan deze meting een bron van variabiliteit zijn. De specifieke activiteit van RNA-polymerasen kan afhangen van het aantal volledig gevormde actieve holo-enzymen, die een deel uitmaken van het totale eiwitmengsel40. De molaire hoeveelheid van 50 nM RNA-polymerase gerapporteerd in onze resultaten werd bijvoorbeeld bepaald door spectrofotometrie, maar een analyse van de subeenheidhoeveelheden door kwantitatieve western blotting onthulde dat de RpoA-subeenheid een beperkende component was in het aantal potentiële RNA-polymerase holo-enzymen, en een maximum van slechts 21 nM volledig gevormd RNA-polymerase was mogelijk in ons mengsel24. Experimenten moeten altijd worden uitgevoerd om te controleren op batch-tot-batch variatie in RNA-polymerase en andere componenten van de in vitro transcriptiereactie.
In ons representatieve experiment in figuur 5 werden de RpoD-niveaus gewijzigd en werd een lineaire relatie tussen RpoD en het gedetecteerde signaal aangetoond. In vitro transcriptie is een veelzijdige methode die gemakkelijk kan worden gewijzigd met behulp van het gepresenteerde experimentele sjabloon (tabel 4). Alternatieve sigmafactoren of alternatieve DNA-sjablonen kunnen bijvoorbeeld eenvoudig worden getest24. Alternatieve sjablonen kunnen verschillende promotorregio's omvatten die worden gegenereerd door PCR of plasmide gezuiverd uit cellen om supercoiled en gemethyleerde DNA-kenmerken te introduceren. Voor een bepaald niveau van RpoD, RNA-polymerase en sjabloon kunnen verschillende niveaus van een transcriptiefactor worden toegevoegd om remming of versterking van activiteit van een promotorte zien 23. De volgorde van componentadditie en molaire verhoudingen binnen de in vitro transcriptiereactie kan zodanig worden gewijzigd dat transcriptie-initiatiecomplexen worden gevormd voorafgaand aan de reactie-initiatie; Deze reacties konden transcriptie-elongatie meten in plaats van transcriptie-initiatie40. De in vitro transcriptietest kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan onderzoeken in de biologie van B. burgdorferi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant van Creighton University. De B. burgdorferi RpoC-His10X stam werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Scott Samuels van de Universiteit van Montana. De E. coli-stam met het pMAL-C5X-plasmide dat codeert voor een maltose-bindend eiwit-gelabeld rpoD-allel werd vriendelijk verstrekt door Dr. Frank Gherardini van Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
References
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S.
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F.
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al.
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S.
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T.
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G.
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S.
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
