Summary
In-vitro-Transkriptionsassays können die Mechanismen der Transkriptionsregulation in Borreliella burgdorferi entschlüsseln. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Aufreinigung der B. burgdorferi RNA-Polymerase und zur Durchführung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen. Experimentelle Ansätze mit In-vitro-Transkriptionsassays erfordern eine zuverlässige Aufreinigung und Lagerung der aktiven RNA-Polymerase.
Abstract
Borreliella burgdorferi ist ein bakterieller Erreger mit begrenzten metabolischen und genomischen Repertoires. B. burgdorferi transpiriert extrazellulär zwischen Wirbeltieren und Zecken und verändert sein Transkriptionsprofil dramatisch, um während der Infektion in unterschiedlichen Umgebungen zu überleben. Ein Schwerpunkt der Studien von B. burgdorferi ist es, klar zu verstehen, wie das Bakterium durch transkriptionelle Veränderungen auf seine Umgebung reagiert. In-vitro-Transkriptionsassays ermöglichen es, die grundlegenden Mechanismen der Transkriptionsregulation biochemisch zu analysieren. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung und Lagerung von B. burgdorferi RNA-Polymerase, die Aufreinigung des Sigma-Faktors, die Generierung von DNA-Vorlagen und In-vitro-Transkriptionsassays beschreibt. Das Protokoll beschreibt die Verwendung von RNA-Polymerase, die aus B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) gereinigt wurde. 5A4-RpoC ist ein bereits publizierter Stamm, der einen 10XHis-Tag auf dem rpoC-Gen trägt, das für die größte Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert. In-vitro-Transkriptionsassays bestehen aus der RNA-Polymerase, die aus dem Stamm 5A4-RpoC gereinigt wurde, einer rekombinanten Version des Housekeeping-Sigma-Faktors RpoD und einer PCR-generierten doppelsträngigen DNA-Vorlage. Während die Proteinreinigungstechniken und -ansätze zur Assemblierung von In-vitro-Transkriptionsassays konzeptionell gut verstanden und relativ verbreitet sind, unterscheiden sich die Überlegungen zur Handhabung von RNA-Polymerasen oft von Organismus zu Organismus. Das hier vorgestellte Protokoll ist für enzymatische Untersuchungen an der B. burgdorferi RNA-Polymerase konzipiert. Die Methode kann angepasst werden, um die Rolle von Transkriptionsfaktoren, Promotoren und posttranslationalen Modifikationen auf die Aktivität der RNA-Polymerase zu testen.
Introduction
Borreliose und Rezidivfieber werden durch Spirochätenerreger der Gattungen Borrelien und Borreliellaverursacht 1,2,3. Die Lyme-Borreliose ist eine prominente vektorübertragene Krankheit in Nordamerika, und daher ist Borreliella burgdorferi ein prominenter Modellorganismus zur Untersuchung der Spirochätenbiologie 4,5. Untersuchungen der Mechanismen der transkriptionellen Regulation von B. burgdorferi zielen darauf ab, seine Anpassungen an Veränderungen in der Umwelt besser zu verstehen, während er zwischen seinem Zeckenvektor und Säugetierwirten wechselt 6,7. Veränderungen des pH-Werts, der Temperatur, der Osmolarität, der Nährstoffverfügbarkeit, der kurzkettigen Fettsäuren, der organischen Säuren sowie des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid modulieren die Expression von Genen, die für das Überleben von B. burgdorferi in seinem Arthropodenvektor und für die Infektion von Tieren wichtig sind 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Die Verknüpfung dieser Reaktionen auf Reize mit regulatorischen Mechanismen war ein wichtiger Aspekt der Forschung von B. burgdorferi 19.
Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren steuern die Transkription von Genen, die zelluläre Prozesse ausführen. Lyme-Borreliose und schubförmige Spirochäten beherbergen eine relativ spärliche Anzahl von Transkriptionsfaktoren und alternativen Sigmafaktoren. Trotzdem gibt es komplexe transkriptionelle Veränderungen, die die Reaktionen von B. burgdorferi auf die Umwelt lenken20,21,22. Die spezifischen Mechanismen, die zu transkriptionellen Veränderungen in B. burgdorferi als Reaktion auf Umweltveränderungen führen, sind noch unklar. In-vitro-Transkriptionsassays sind leistungsstarke Werkzeuge für die Anwendung eines biochemischen Ansatzes zur Untersuchung der Funktion und der regulatorischen Mechanismen von Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren23,24,25,26.
Ein In-vitro-Transkriptionsassay-System mit der RNA-Polymerase von B. burgdorferi wurde kürzlich etabliert24. Da Bakterien oft eine einzigartige zelluläre Physiologie aufweisen, reagieren RNA-Polymerasen verschiedener Spezies und Gattungen unterschiedlich auf Enzymreinigung, Enzymspeicherung und Reaktionspufferbedingungen27. B. burgdorferi ist auch genetisch weit von den vielen Bakterienarten entfernt, an denen RNA-Polymerasen untersucht wurden20. Aspekte der Enzymvorbereitung wie Lyse-, Wasch- und Elutionspufferbedingungen, Speicherpuffer, In-vitro-Transkriptionsreaktionspuffer und die Methode der Assay-Konstruktion können alle die RNA-Polymerase-Aktivität verändern. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Aufreinigung von RNA-Polymerase und Sigma-Faktor RpoD, die Herstellung von linearen doppelsträngigen DNA-Matrizen und die Konstruktion von In-vitro-Transkriptionsassays zur Verfügung, um die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien, die dieses System verwenden, zu erleichtern. Wir beschreiben eine Beispielreaktion, um den linearen Bereich für die RpoD-abhängige Transkription zu demonstrieren und diskutieren Einschränkungen und Alternativen zu diesem Ansatz.
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Protocol
1. Aufreinigung der RNA-Polymerase und Herstellung des RNA-Polymerase-Stammes
- Das Zellpellet wird aus 2-4 l B. burgdorferi RpoC-His10X, kultiviert in BSKI-Medium in einer mikroaerophilen Umgebung (34 °C, 5 % CO 2, 3 %O2) auf eine Dichte von2-4 x 107 Zellen/ml unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zellentnahmeprotokollegesammelt 28,29. Die Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4 °C für 30 min in 500-ml-Zentrifugalflaschen durchführen und den Überstand abgießen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 30 ml eiskaltem HN-Puffer (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt wie oben beschrieben mit einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen und dekantieren Sie den Überstand.
Anmerkungen: Haltepunkt. Frieren Sie das Zellpellet bei −80 °C ein, um die Zellen bis zu 2 Wochen zu lagern, oder fahren Sie sofort mit der Zelllyse fort. - Bewahren Sie die Zellen, das Lysat und die gereinigten Proteine bei 4 °C oder auf Eis auf, es sei denn, sie frieren ein. Halten Sie die RNA-Polymerase in einer reduzierenden Umgebung, indem Sie jedem in diesem Protokoll verwendeten Puffer frisch zubereitetes DTT in einer Konzentration von 2 mM hinzufügen und den pH-Wert 8,0 aufrechterhalten.
- Bereiten Sie das Lysat aus dem B. burgdorferi-Zellpellet mit einem handelsüblichen bakteriellen Lysekit gemäß den Anweisungen des Kits vor. Resuspendieren Sie das Pellet in 10-15 ml B-Per-Lösung bei Raumtemperatur (RT) OHNE Proteasehemmer und lassen Sie die Lyse 5 Minuten lang auf Eis fortsetzen. Das Lysevolumen hängt von der Größe des Zellpellets ab, wie in der Bauanleitung beschrieben.
- Fügen Sie der Lyselösung einen Proteasehemmer-Cocktail hinzu, gefolgt von drei Beschallungsrunden, wie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschrieben.
HINWEIS: Alternativ können die Zellen in einer französischen Druckzelle wie zuvor beschrieben lysiertwerden 24. Überspringen Sie Schritt 1.4. und Schritt 1.5. - Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation und Filtration mit einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Volumen des Röhrchens auf mindestens 30 ml Gesamtvolumen, indem Sie der Lösung Kobaltsäulen-Ladepuffer (Tabelle 1) hinzufügen. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 Minuten.
- Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45 μm Spritzenvorsatzfilter.
- Verdünnen Sie das Lysat in Kobaltsäulenbeladungspuffer (Tabelle 1) mit einem Endverdünnungsverhältnis von 1:10.
- Führen Sie eine Affinitätschromatographie des geklärten Zelllysatüberstandes unter Verwendung einer Kobalt- oder Nickelharzsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse". Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer. Sammeln Sie die Durchfluss-, Wasch- und Elutionsproben für die Analyse.
- Tauschen Sie die RNA-Polymerase in der Elutionspufferlösung sofort unter Verwendung einer Pufferaustauschsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers in eine RNA-Polymerase-Speicherpufferlösung (Tabelle 1) aus.
- Bereiten Sie die Gefriervorräte vor, indem Sie die RNA-Polymerase mit 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfiltereinheiten auf eine spektralphotometrisch bestimmte Konzentration von 0,2-0,4 mg/ml konzentrieren (A280 nm ohne Anpassung des Extinktionskoeffizienten [1 abs bei 1 cm = 1 mg·ml−1]).
- Aliquot RNA-Polymerase gefriert in 20-50 μL Volumen in PCR-Röhrchen und lagert die RNA-Polymerase bei −80 °C.
- Bestimmen Sie die Qualität der Affinitätschromatographie mit SDS-PAGE und messen Sie die Gesamtproteinausbeute mittels Spektrophotometrie oder BCA-Assay. Lassen Sie die Proben 50 Minuten lang auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel bei 120 V laufen, um eine gute Auflösung durch SDS-PAGE zu erzielen.
2. Aufreinigung von rekombinantem RpoD und Herstellung von RpoD-Bestand
- Kultur und Induktion der Expression von Maltose Binding Protein-tagged recombinant B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) in BL21::MBP-RpoDBb, wie in der Bedienungsanleitung des Proteinfusions- und -reinigungssystems beschrieben, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, und Entnahme der Zellen durch Zentrifugation.
Anmerkungen: Haltepunkt. Frieren Sie die Zellpellets bei −80 °C ein, um die Zellen bis zu 2 Wochen zu lagern, oder fahren Sie sofort mit der Zelllyse fort. - Führen Sie die Lyse mit einem handelsüblichen bakteriellen Zelllysekit oder einer französischen Druckzelle durch. Das Beispiel für einen Lysepuffer finden Sie in Tabelle 1.
- Klärung des Zelllysats durch Zentrifugation und Filtration. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 Minuten. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45-μm-Filter.
- Extrahieren Sie MBP-RpoD unter Verwendung eines Proteinextraktionsprotokolls für das Expressionssystem. Im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" finden Sie z. B. Implementierungsdetails und -ergebnisse.
- Bestimmung der Qualität des Affinitätschromatographie-Prozesses und der Elution mittels SDS-PAGE und Messung der Proteinausbeute mittels Spektrophotometrie (A280nm ohne Anpassung des Extinktionskoeffizienten [1 abs bei 1 cm = 1 mg·mL−1]). Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
- MBP-RpoD wird mit einem Zentrifugalfilter mit 10 kDa-Abschaltung auf eine spektrophotometrisch ermittelte Konzentration von >2 mg/ml konzentriert.
- Trennen Sie MBP von RpoD an der Faktor-Xa-Spaltstelle. Fügen Sie CaCl 2 zu den Affinitätschromatographie-Elutionsfraktionen hinzu, die MBP-RpoD in einer Konzentration von2 mM enthalten. Fügen Sie 200 μg Faktor-Xa-Protease pro 30 mg gereinigtem Protein hinzu. Über Nacht bei RT inkubieren.
- Bestätigen Sie die vollständige Spaltung von MBP von RpoD durch SDS-PAGE. Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
- Die MBP- und RpoD-haltige Lösung wird im Verhältnis 1:10 mit einem Heparin-bindenden Puffer verdünnt.
- Trennen Sie MBP und RpoD auf der Heparinsäule mittels FPLC. In Tabelle 2 finden Sie Informationen zu den FPLC-Einstellungen.
- Bestimmen Sie die Qualität der Affinitätschromatographieprodukte mit SDS-PAGE und messen Sie die Proteinausbeute mittels Spektrophotometrie. Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
- Die RpoD-haltigen Elutionsfraktionen werden mit einem 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter auf ein Endvolumen von 2-3 ml konzentriert.
- Puffer tauschen die konzentrierten RpoD-Elutionsfraktionen mit Hilfe einer Gelfiltrationssäule in Speicherpuffer aus.
- Konzentrieren Sie den RpoD-Stamm mit einem 10-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter auf eine spektralphotometrisch ermittelte Konzentration von 0,2-0,8 mg/ml.
- Aliquot RpoD-Vorrat bei 20-50 μL Volumen in PCR-Röhrchen und bei −80 °C lagern.
3. Herstellung von DNA-Vorlagenmaterial
- Die PCR amplifiziert die 500 bp große Region um eine RpoD-getriebene Promotorstelle aus genomischer DNA von B. burgdorferi mit Hilfe einer 200 μL Reaktion (Tabelle 3).
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit. Elute die DNA in molekularbiologischer KlasseH2O.
- Die molare Konzentration der PCR-generierten DNA-Templates wird durch Verdünnung in molekularbiologischer KlasseH2Oauf 100 nM eingestellt.
4. Führen Sie eine In-vitro-Transkription unter Einbeziehung von radioaktiv markierten Nukleotiden durch
- Erstellen Sie einen experimentellen Plan für die In-vitro-Transkription . Bestimmen Sie die Konzentrationen der RNA-Polymerase, des RpoD und der DNA-Matrize. Bestimmen Sie die aliquoten Volumina und Pipettierreihenfolgen für die Reaktionsröhrchen. Ein Beispiel finden Sie in Tabelle 4 und Abbildung 1 .
HINWEIS: Nehmen Sie Kontrollen in den Versuchsplan auf, z. B. Reaktionen, die keine RNA-Polymerase, alternative Polymerase, kein Template oder alternative Templates enthalten. - Berechnen Sie das Volumen von α-32P-ATP, das für das Experiment benötigt wird. Bauen Sie dies in den Versuchsplan ein. In der Regel werden 2 μCi Aktivität pro In-vitro-Transkriptionsreaktion für den Phosphorscreen-Nachweis angegeben.
- Bereiten Sie die Arbeitsflächen, einschließlich der Bestrahlungsbank, vor, um das Risiko einer Strahlenkontamination zu verringern.
- Frische Aliquots von RNA-Polymerase, Rpo, 5x-Puffer-NTP und Template-Stammlösungen auf Eis auftauen. Mischen Sie alle aufgetauten gefrorenen Brühen vor dem Pipettieren gründlich.
- Bereiten Sie ein Master-Reaktionsgemisch und ein separates NTP-Gemisch für radioaktiv markierte Nukleotide gemäß dem Versuchsplan vor.
- Dispensieren Sie die Kontrollreaktionen und Experimentiersets in PCR-Röhrchen, um die Zugabe von Radiomarkierung in die Reaktion vorzubereiten. H2O, Reaktionsmastermix, RNA-Polymerase und RpoD vorsichtig in dafür vorgesehene PCR-Röhrchen dosieren und durch Pipettieren mischen.
- Übertragen Sie die vorbereiteten Materialien auf eine Bestrahlungsbank.
- Fügen Sie α-32P-ATP zu NTP hinzu und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren.
VORSICHT: Verwenden Sie bei der Arbeit mit radioaktivem Material geeignete Schutzausrüstung und Handhabungsverfahren für radioaktive Isotope. - NTP wird in die Röhrchen gegeben, die die In-vitro-Transkriptionsreaktionsgemische aus Schritt 4.6 enthalten.
- Starten Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der Zugabe einer DNA-Vorlage . Mischen Sie das Reaktionsvolumen durch vorsichtiges Pipettieren.
- Röhrchen bei 37 °C für 5 min in einem Thermocycler oder Heizblock inkubieren.
- Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler oder Heizblock und fügen Sie den 2x RNA-Beladungsfarbstoff mit 50 % Formamid zu einem gleichen Reaktionsvolumen hinzu, um In-vitro-Transkriptionsreaktionen zu stoppen.
- Denaturieren Sie die Enzyme, indem Sie Reaktionen bei 65 °C für 5 min in einem Thermocycler oder Heizblock inkubieren.
- Trennen Sie die RNA in der In-vitro-Transkriptionsreaktionsmischung durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 10%-15%igen FSME-Harnstoffpolyacrylamidgelen bei 180 V für 30-45 min.
Anmerkungen: Abhängig von den Bedingungen der Gelelektrophorese kann die Pufferlösung mit radioaktiv markierten Nukleotiden kontaminiert sein oder das Gel kann die meisten oder alle radioaktiv markierten Nukleotide enthalten. Planen Sie die ordnungsgemäße Lagerung oder Entsorgung von Radioaktivität ein. - Stellen Sie die radioaktiv markierte RNA mit einem Phosphoscreen dar, nachdem Sie einen Teil des Gels entfernt haben, der nicht inkorporiertes radioaktiv markiertes ATP enthält. Belichten Sie das Gel über Nacht (16 h) mit dem Phosphoscreen und fotografieren Sie es mit einem Phosphoscreen-Imager (100 μm Auflösung, 700 V PMT-Röhrenspannung).
- Analysieren Sie die Daten mit Densitometrie-Methoden24.
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Representative Results
Bei einer in vitro Transkriptionsreaktion, bei der der limitierende Schritt der Reaktion die Sigma-Faktor-vermittelte Transkriptionsinitiierung ist, sollte die Transkriptionsaktivität linear mit der Menge des Sigma-Faktors zunehmen. Wir stellen die Vorbereitung von in vitro Transkriptionsexperimenten vor, bei denen eine Reihe von RpoD-Konzentrationen zusammen mit zwei Konzentrationen von RNA-Polymerase getestet werden, um das resultierende unterschiedliche Signal des radioaktiv markierten Nukleotideinbaus in RNA-Produkte zu beobachten. Repräsentative Ergebnisse der Herstellung von RNA-Polymerase, RpoD und doppelsträngigen DNA-Template-Stämmen werden gezeigt. Die repräsentativen In-vitro-Transkriptionsreaktionen dienen als Beispiel für die für die Analyse akzeptablen RNA-Polymerase-Aktivitätsniveaus.
Zur Aufreinigung der RNA-Polymerase wurde eine 4 L Kultur von B. burgdorferi RpoC-His10X bei 34 °C unter mikroaerophilen Bedingungen (5% CO2, 3 %O2) kultiviert. Die Kulturen wurden mittels Dunkelfeldmikroskopie engmaschig auf die Spirochätendichte überwacht und vor dem Erreichen von Dichten von mehr als 4 x 10,7 Spirochäten/ml entnommen. Die Zellen wurden zur Lyse in einem B-PER-Gemisch resuspendiert (Tabelle 1). Das Zellpellet wurde durch Pipettieren homogenisiert, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation bei RT und anschließenden Beschallungsrunden für 3 s in dreifacher Ausfertigung. Geklärte Lysate wurden mit Kobaltsäulenbeladungspuffer und 5 ml Kobaltharz auf ein Gesamtvolumen von 180 ml verdünnt. RpoC-His10X konnte sich an das Kobaltharz binden, indem das Gemisch 1 h lang bei 4 °C angesaugt wurde. Das Gemisch wurde in eine Schwerkraftströmungssäule überführt und fünfmal mit 40 ml Säulenwaschpuffer gewaschen. Das gebundene Protein wurde freigesetzt, indem 5 ml Elutionspuffer durch die Säule geleitet wurden, und die Elution wurde siebenmal wiederholt. Die Proben der Flow-Through-, Washes- und Elutionsfraktionen wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch Färbeineinarbeitung abgebildet (Abbildung 1). Der RNA-Polymerase-Kernkomplex besteht aus RpoC, RpoB und RpoA mit einer Größe von 154 kDa, 129 kDa bzw. 38,5 kDa. Das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 zeigt drei markante Banden in der Größe der drei Peptide, aus denen sich der RNA-Polymerase-Komplex zusammensetzt. Der Durchfluss aus der Affinitätschromatographie enthielt 0,5-1 mg/ml Protein mit einem Verhältnis von 260/280 zwischen 1,0 und 1,7, was auf eine höhere Konzentration von Nukleinsäuren hinweist. Die RNA-Polymerase-Proteinausbeute nach spektrophotometrisch ermittelter Konzentration der Proteinmischung betrug 0,3 mg/ml.
Zur Herstellung von RpoD-Proteinvorräten wurde rekombinantes RpoD mit einem C-terminalen Maltose-bindenden Protein-Tag aus einem pMAL-C5X-Plasmid in BL21 (DE3) pLysS E. coli exprimiert. 2 l E. coli wurden bei 32 °C auf einen OD600nm von 0,5 gezüchtet. Die Kultur wurde dann mit 0,3 mM IPTG behandelt, um die Expression von RpoD für 1 h zu induzieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und in B-PER lysiert. Die resultierenden 200 ml verdünntes Zelllysat wurden durch 10 ml Amyloseharz filtriert. Das Harz wurde achtmal mit 40 ml Bindungspuffer gewaschen, um DNA- und Peptidereste zu entfernen. MBP-markiertes RpoD wurde fünfmal mit 5 ml Elutionspuffer in die Harzsäule eluiert. Der Durchfluss aus den Bindungs- und Waschschritten sowie die Elutionsfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 2A). Die Hauptkomponente in der Elutionsfraktion ist ein Peptid von ~115 kDa, das der Größe des MBP-markierten rekombinanten B. burgdorferi RpoD entspricht. Die Elutionsfraktionen wurden kombiniert, dieCaCl2-Konzentration auf 2 mM eingestellt und 100 μg FactorXa-Protease zu 40 mg gereinigtem Protein hinzugefügt. Nach nächtlichem Aufschluss bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 2B). Nach der Spaltung mit der Faktor-Xa-Protease waren die beiden Hauptprodukte in der Mischung RpoD (73,6 kDa) und MBP (45 kDa). Das Gemisch aus RpoD- und MBP-Proteinen wurde mittels Heparin-Affinitätschromatographie getrennt. Das Gemisch wurde im Verhältnis 1:10 in Heparin-bindendem Puffer verdünnt und in einer FPLC in eine Heparin-gebundene Harzsäule geladen. RpoD wurde mit steigendem Gradienten von NaCl auf eine Konzentration von 1 M eluiert. Bei der Analyse der Fraktionen mittels SDS-PAGE zeigte sich in der Elutionsfraktion eine große Bande von 73,6 kDa im Bereich von 400-600 mM NaCl (Abbildung 2C). Einige degradierte RpoD-Fragmente wurden mitgereinigt. RpoD-haltige Fraktionen wurden kombiniert, Puffer in RpoD-Speicherpuffer ausgetauscht und dann mit einem 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter eingeengt. Die endgültige RpoD-Konzentration betrug 0,67 mg/ml (9,1 mM), gemessen durch Spektrophotometrie.
Mittels PCR wurde eine doppelsträngige DNA-Matrize generiert, die die Promotorstelle von B. burgdorferi flgB umfasst. Der flgB-Promotor wurde durch Primer amplifiziert, die 250 bp stromaufwärts und stromabwärts des Promotors entsprachen (Tabelle 6), wobei eine 200 μL-Reaktion mit 30 ng B. burgdorferi DNA24,30 verwendet wurde. Das PCR-Produkt wurde mittels Gelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel analysiert (Abbildung 3). Das PCR-Produkt war etwa 500 bp groß und hatte eine scheinbare Homogenität. Wichtig ist, dass Salze und die Kontamination von Zellkomponenten zur Variabilität der Ergebnisse von In-vitro-Transkriptionsreaktionen beitragen können. Wir stellen sicher, dass die DNA-Vorlage auf der PCR-Aufreinigungssäule gründlich entsalzt wird.
Ein experimentelles Schema, bei dem die Transkription durch die Zugabe von Template-DNA initiiert wird, kann die Geschwindigkeit der Promotorerkennung und Transkriptionsinitiation testen. In unseren repräsentativen Experimenten wurde eine Verdünnungsreihe von RpoD-Protein durch zweifache Verdünnung in Wasser im Bereich von 16 nM-1 μM hergestellt. Es wurde eine Mastermischung hergestellt, die RNA-Polymerase in einem Reaktionspuffer enthielt, der zweiwertige Kationen enthielt, die für die Aktivität erforderlich waren (Tabelle 4 und Tabelle 5). Der RpoD und der Mastermix wurden zusammen auf Eis aliquotiert. Der Mastermix aus RNA-Polymerase und RpoD wurde inkubieren gelassen, während andere Schritte der in vitro Transkription vorbereitet wurden. Wir integrierten drei Kontrollreaktionen: eine Positivkontrollreaktion, die separat vom Mastermix hergestellt wurde, eine Negativkontrollreaktion, die keine Template-DNA enthielt, um sicherzustellen, dass das In-vitro-Transkriptionssignal Template-abhängig war, und eine Negativkontrollreaktion ohne RNA-Polymerase, um sicherzustellen, dass das Signal RNA-Polymerase-abhängig war. Radioaktiv markierte Nukleotide wurden der Reaktion zugesetzt, indem 5 μl (α-32P-ATP) mit 20 μl 10x NTP-Stammgemisch gemischt wurden, um genügend Aliquot für 20 Reaktionen zu erzeugen und nicht wiederherstellbare Volumina zu kompensieren. Schließlich wurde die Template-DNA, die für den flgB-Promotor kodiert, durch Pipettieren gemäß der zuvor geplanten Pipettierreihenfolge in die Reaktionsröhrchen eingebracht (Abbildung 4).
Das Signal aus den durch In-vitro-Transkription erzeugten RNA-Fragmenten wurde nach einer 16-stündigen Expositionszeit des durch Gelelektrophorese abgetrennten FSME-Harnstoffgels mittels Phosphor-Screening detektiert. Ein Experiment mit 50 nM RNA-Polymerase und RpoD im Bereich von 500 nM bis 16 nM erzeugte RNA-Produkte von 250 bp (Abbildung 5). Für jede zweifache Verdünnung der RpoD-Konzentration ergab sich ein geringerer Gehalt an akkumuliertem RNA-Produkt. Es gab eine Reihe von Produkten mit niedrigerem Blutdruck, die unterhalb der prominenten Bande auftraten, was auf unvollständige RNA-Fragmente hindeutete, die auf eine Transkriptionsunterbrechung oder eine fragmentierte DNA-Vorlage zurückzuführen waren. RNA-Produkte fehlten in der Kontrollgruppe ohne Template, was darauf hindeutet, dass in diesem Assay keine exogenen DNA-Fragmente zum Signal beitrugen. In der No-RNA-Polymerase-Kontrolle wurde kein Signal nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die B. burgdorferi RNA-Polymerase die einzige Polymerase war, die in diesem Assay zur Produktion von RNA beitrug.
In einem zweiten Experiment verwendeten wir eine niedrigere Konzentration von 25 nM RNA-Polymerase (Abbildung 6). Im Vergleich zu Abbildung 5 wurden im gesamten Bereich der getesteten RpoD-Konzentrationen weniger RNA-Produkte nachgewiesen, und die Intensität des Hintergrundsignals war höher. Dies ist problematisch für die nachgelagerte Analyse mittels Densitometrie. Als das Phosphorbild densitometrisch analysiert wurde (Abbildung 7), zeigte das vom Phosphoscreen erhaltene Densitometriesignal eine lineare Beziehung zwischen der Menge an RpoD, die in der Reaktion in beiden Experimenten vorhanden war. Im Experiment mit hohem Hintergrundsignal war die Reaktion, die 25 nM RNA-Polymerase und weniger als 100 nM RpoD enthielt, jedoch unzuverlässig für Vergleiche des relativen Transkriptionsniveaus.
Abbildung 1: Trennung der His-markierten B. burgdorferi RNA-Polymerase, die mittels Affinitätschromatographie gereinigt wurde. Die Durchflussfraktion aus Zelllysat (Spur 1), der ersten Waschfraktion (Spur 2), der letzten Waschfraktion (Spur 3) und fünf Elutionsfraktionen (Spur 4-8) wurden in 2x Probenbeladungspuffer verdünnt, gekocht und mittels SDS-PAGE in einem Gradienten-Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min aufgetrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der RpoD-Aufreinigung mittels Gelelektrophorese. (A) Gepoolte Durchflussfraktionen (Spur 1 und Spur 2), Waschfraktionen (Bahnen 3-5) und Elutionsfraktionen (Bahnen 6-10) aus der Aufreinigung von MBP-markiertem RpoD durch Amyloseharz-Affinitätschromatographie. (B) Proteinmischung nach der Spaltung von MBP und RpoD unter Verwendung der Faktor-Xa-Protease. (C) Flowthrough-Lösung (Spur 1) und Elutionsfraktionen mit zunehmendem Gradienten von NaCl (Bahnen 2-9) von der Heparin-Affinitätschromatographie zur Trennung von MBP und RpoD. In jedem präsentierten Gel wurden die Proben mit 2x Ladepuffer gemischt, gekocht und in einem Gradienten-Polyacrylamid-Gel unter Verwendung von SDS-PAGE bei 200 V für 30 min getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: PCR-Generierung von in vitro Transkriptionsvorlagen. 500 bp großes Amplikon mit flgB-Promotor (Spur 1 und Spur 2) und Kontroll-PCR-Reaktionen mit Amplikons anderer Promotorstellen (Bahnen 3-4) sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Versuchsanordnung und Pipettierablaufplan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: RpoD-abhängige Variabilität im Phosphorbildsignal von RNA, die durch In-vitro-Transkription unter Verwendung der B. burgdorferi-RNA-Polymerase erzeugt wurde. In-vitro-Transkriptionsreaktionen enthielten 50 nM RNA-Polymerase und unterschiedliche RpoD-Konzentrationen, die über den Banden24 angegeben waren. Die RNA wurde durch ein 10%iges FSME-Harnstoff-Gel getrennt, und ein Phosphorschirm wurde verwendet, um das Signal des radioaktiven Zerfalls über 16 h zu erfassen. Diese Abbildung wurde von Boyle et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: RpoD-abhängige Variabilität im Phosphor-Bildsignal von RNA, die durch In-vitro-Transkription erzeugt wurde. Die In-vitro-Transkription enthielt 25 nM RNA-Polymerase und unterschiedliche RpoD-Konzentrationen, die über den Banden angegeben waren. Die RNA wurde durch ein 15%iges FSME-Harnstoff-Gel getrennt, und ein Phosphorschirm wurde verwendet, um das Signal des radioaktiven Zerfalls über 16 h zu erfassen. Die niedrigere RNA-Polymerase-Konzentration und das höhere Hintergrundsignal erhöhten die Schwierigkeit einer genauen Messung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Zunehmende Akkumulation radioaktiv markierter RNA in vitro Transkriptionsreaktionen mit steigenden RpoD-Spiegeln. Die in der Phosphor-Screen-Bildgebung detektierten Signale wurden mittels Densitometrie ohne Hintergrundsubtraktion analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Medienrezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: FPLC-Einstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: PCR-Reaktionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: 50 nM RNA-Polymerase-Versuchsplan und Volumenberechnung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: 25 nM RNA-Polymerase-Versuchsplan und Volumenberechnung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 6: Stämme und Oligonukleotide, die in diesem Protokoll verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In-vitro-Transkriptionsassays, die mit dem vorgestellten Protokoll konstruiert wurden, wurden kürzlich verwendet, um die Rolle eines Transkriptionsfaktors in B. burgdorferi zu untersuchen, und können für ähnliche Experimente mit anderen Transkriptionsfaktoren, Sigma-Faktoren und Molekülen verwendet werden23. Sobald die aktive RNA-Polymerase aus B. burgdorferi gewonnen und ihre Aktivität nachgewiesen wurde, können Komponenten und Bedingungen innerhalb der In-vitro-Transkriptionsassays modifiziert werden. Der Assay ist hochflexibel und modifizierbar. Die Reaktionen sind modular aufgebaut und werden aus gefrorenen Beständen aufgebaut und benötigen nur wenig Vorlaufzeit, sobald die experimentellen Parameter ausgewählt wurden. Bei ausreichendem Vorrat können mehrere Experimente an 1 Tag durchgeführt werden.
Die Gewinnung einer aktiven RNA-Polymerase ist der kritischste Aspekt bei der Vorbereitung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen. Wir empfehlen, RNA-Polymerase aus Zellen zu ernten, die in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet wurden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Bei der Reinigung der RNA-Polymerase von Bakterien wurde festgestellt, dass die Wachstumsrate ein wichtiger Faktor bei der Reinigung der aktiven RNA-Polymerase ist. RNA-Polymerasen können posttranslationale Modifikationen akkumulieren und in der stationären Wachstumsphase mit inhibitorischen Transkriptionsfaktoren assoziiert sein31. Es ist uns nicht gelungen, große Mengen aktiver RNA-Polymerase aus B. burgdorferi-Kulturen, die in die stationäre Phase gezüchtet wurden, zu reinigen. Der Ansatz der Affinitätschromatographie ist im Vergleich zu einem physikalischen Trennansatz32 auch für die Aufreinigung von B. burgdorferi von Vorteil, da der Organismus in Kultur eine geringe Dichte erreicht und die Anhäufung großer Mengen an Zellkultur relativ materialintensiv ist.
Bei der Aufreinigung anderer bakterieller RNA-Polymerasen können Sigma-Faktoren je nach Aufreinigungsmethode und -bedingungen in signifikanten Mengen mitreinigen33,34,35,36. Die Co-Reinigung von Sigma-Faktoren kann nachgelagerte Experimente mit alternativen Sigma-Faktoren, modifizierten Sigma-Faktoren oder dem Fehlen von Sigma-Faktoren einschränken. Darüber hinaus ist die Supplementierung mit dem Housekeeping-Sigma-Faktor RpoD vorteilhaft für die Erkennung von Aktivität, unabhängig von der anfänglichen Co-Reinigung des Sigma-Faktors37. Aufgrund der Flexibilität bei der Trennung des Sigma-Faktors vom RNA-Polymerase-Kern halten wir es für vorteilhaft, dass Sigma-Faktoren unter den hier beschriebenen Aufreinigungsbedingungen der His-Affinitätschromatographie nicht mitgereinigt werden. Es ist möglich, dass die Reinigungsbedingungen geändert werden, um intaktere und aktive Holoenzyme zu erhalten, die RpoD enthalten. Zum Beispiel ist es wahrscheinlich, dass Salzkonzentrationen die Stabilität von Enzymen mehrerer Untereinheiten beeinflussen, und der Einfluss der Imidazolkonzentration auf die Stabilität des B. burgdorferi RNA-Polymerase-Komplexes oder seinen zweiwertigen Kationeneinbau ist ebenfalls unbekannt.
B. burgdorferi Die enzymatische Aktivität der RNA-Polymerase ist empfindlich gegenüber der Art und Menge der vorhandenen zweiwertigen Kationen24. Wir fanden heraus, dass Mangan für eine maximale RNA-Polymerase-Aktivität benötigt wird, und Magnesium schien in geringerem Maße zur Aktivität beizutragen. Kontaminierende Ionen in Wasser verleihen der enzymatischen Aktivität der RNA-Polymerase eine hohe Variabilität. Folglich ist hochreines Wasser wie Molekularbiologie, HPLC-Qualität und MetallanalyseklasseH2Omit wenigen Metallionen für eine höhere RNA-Polymerase-Aktivität in dem hier beschriebenen Protokoll unerlässlich. RNA-Polymerasen sind auch empfindlich gegenüber dem pH-Wert und benötigen während der Aufreinigung eine reduzierende Umgebung27. Ein veränderter pH-Wert oder die Verwendung von BME als Reduktionsmittel hat zu einer inaktiven RNA-Polymerase geführt. Wir empfehlen, kommerziell erhältliche E. coli-RNA-Polymerase als Kontrolle zu verwenden, um die ordnungsgemäße Konstruktion von In-vitro-Transkriptionsassays sicherzustellen24. E. coli Die RNA-Polymerase ermöglicht es, die Lebensfähigkeit der Nukleotide, die Methode zur Konstruktion der Vorlagen, den Einbau von Radiomarkierungen, die RNA-Trennung und die Signaldetektionsmethode zu testen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die B. burgdorferi RNA-Polymerase im Vergleich zu E. coli spezifische zweiwertige Kationen-, Puffer- und Promotoranforderungen hat.
Für In-vitro-Transkriptionsreaktionen stehen verschiedene Nachweismethoden zur Verfügung. Farbstoffeinarbeitung und molekulare Beacon-Assays sind gängige Alternativen zur Methode zur Detektion von Radiomarkierungen38,39. Der radioaktiv markierte Nukleotideinbau ist derzeit die empfindlichste RNA-Nachweismethode. Alternative Assays benötigen im Vergleich zu Radio-Markierungs-Assays mehr RNA-Polymerase, um messbare Signalpegel zu erreichen. Darüber hinaus bieten Farbstoffeinbau- und molekulare Beacon-Methoden in der Regel mehr Möglichkeiten für fehlerhafte Signale. Zum Beispiel kann eine DNase-Kontamination dazu führen, dass molekulare Beacons ein Signal in Abwesenheit ihres Ziels abgeben. Durch den Einbau von Radiomarkierungen kann die relative Aktivität des RNA-Polymerase-Enzyms B. burgdorferi bereits in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden, was für erste Experimente mit RNA-Polymerase-Enzymen geeignet ist.
Während die Konzentration des in die Reaktion einbezogenen RNA-Polymerase-Enzyms B. burgdorferi durch Spektrophotometrie standardisiert wird, kann diese Messung eine Quelle der Variabilität sein. Die spezifische Aktivität von RNA-Polymerasen kann von der Anzahl der voll ausgebildeten aktiven Holoenzyme abhängen, die einen Teil der gesamten Proteinmischungausmachen 40. Zum Beispiel wurde die molare Menge von 50 nM RNA-Polymerase, die in unseren Ergebnissen berichtet wurde, durch Spektrophotometrie bestimmt, aber eine Analyse der Untereinheitenmengen durch quantitatives Western Blot ergab, dass die RpoA-Untereinheit eine limitierende Komponente in der Anzahl potenzieller RNA-Polymerase-Holoenzyme war und maximal nur 21 nM voll ausgebildete RNA-Polymerase in unserer Mischung möglich waren24. Experimente sollten immer durchgeführt werden, um die Variation der RNA-Polymerase und anderer Komponenten der In-vitro-Transkriptionsreaktion von Charge zu Charge zu kontrollieren.
In unserem repräsentativen Experiment, das in Abbildung 5 gezeigt ist, wurden die RpoD-Spiegel verändert und eine lineare Beziehung zwischen RpoD und dem detektierten Signal nachgewiesen. Die In-vitro-Transkription ist eine vielseitige Methode, die mit Hilfe der vorgestellten experimentellen Vorlage leicht verändert werden kann (Tabelle 4). So können beispielsweise alternative Sigma-Faktoren oder alternative DNA-Templates problemlos getestet werden24. Alternative Vorlagen könnten verschiedene Promotorregionen sein, die durch PCR generiert werden, oder Plasmide, die aus Zellen gereinigt werden, um supercoiled und methylierte DNA-Merkmale einzuführen. Für ein bestimmtes Niveau von RpoD, RNA-Polymerase und Matrize können unterschiedliche Konzentrationen eines Transkriptionsfaktors hinzugefügt werden, um eine Hemmung oder Verstärkung der Aktivität eines Promotors zu sehen23. Die Reihenfolge der Komponentenaddition und die molaren Verhältnisse innerhalb der In-vitro-Transkriptionsreaktion können so verändert werden, dass vor der Reaktionsinitiierung Transkriptionsinitiationskomplexe gebildet werden; Diese Reaktionen konnten die Transkriptionsverlängerung anstelle der Transkriptionsinitiierung messen40. Der In-vitro-Transkriptionstest kann an eine Vielzahl von Untersuchungen zur Biologie von B. burgdorferi angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant der Creighton University unterstützt. Der B. burgdorferi RpoC-His10X-Stamm wurde freundlicherweise von Dr. D. Scott Samuels von der University of Montana zur Verfügung gestellt. Der E. coli-Stamm , der das pMAL-C5X-Plasmid enthält, das für ein Maltose-bindendes Protein-markiertes rpoD-Allel kodiert, wurde freundlicherweise von Dr. Frank Gherardini von den Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
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