Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المكونات الأساسية لبوريليلا (بوريليا) بورغدورفيري في مقايسات النسخ المختبري

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

يمكن لفحوصات النسخ في المختبر فك رموز آليات تنظيم النسخ في Borreliella burgdorferi. يصف هذا البروتوكول خطوات تنقية بوليميراز B. burgdorferi RNA وإجراء تفاعلات النسخ في المختبر. تتطلب الأساليب التجريبية التي تستخدم مقايسات النسخ في المختبر تنقية وتخزينا موثوقا به لبوليميراز الحمض النووي الريبي النشط.

Abstract

Borreliella burgdorferi هو أحد مسببات الأمراض البكتيرية ذات الذخيرة الأيضية والجينومية المحدودة. ينتقل B. burgdorferi خارج الخلية بين الفقاريات والقراد ويعيد تشكيل ملفه النسخي بشكل كبير للبقاء على قيد الحياة في بيئات متباينة أثناء العدوى. تركز دراسات B. burgdorferi على الفهم الواضح لكيفية استجابة البكتيريا لبيئتها من خلال التغييرات النسخية. تسمح مقايسات النسخ في المختبر بتشريح الآليات الأساسية لتنظيم النسخ كيميائيا حيويا. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يصف تنقية وتخزين بوليميراز B. burgdorferi RNA ، وتنقية عامل سيغما ، وتوليد قالب الحمض النووي ، ومقايسات النسخ في المختبر . يصف البروتوكول استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC هي سلالة منشورة سابقا تحتوي على علامة 10XHis على جين rpoC الذي يشفر أكبر وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي. تتكون مقايسات النسخ في المختبر من بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من السلالة 5A4-RpoC ، ونسخة مؤتلفة من عامل التدبير المنزلي سيجما RpoD ، وقالب الحمض النووي المزدوج الذي تم إنشاؤه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين أن تقنيات تنقية البروتين ومناهج تجميع مقايسات النسخ في المختبر مفهومة جيدا من الناحية المفاهيمية وشائعة نسبيا ، فإن اعتبارات التعامل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي غالبا ما تختلف من كائن حي إلى آخر. تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للدراسات الأنزيمية على بوليميراز B. burgdorferi RNA. يمكن تكييف الطريقة لاختبار دور عوامل النسخ والمروجين وتعديلات ما بعد الترجمة على نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي.

Introduction

يحدث مرض لايم والحمى الانتكاسية بسبب مسببات الأمراض اللولبية في أجناس Borrelia و Borreliella1،2،3. مرض لايم هو مرض بارز ينتقل عن طريق النواقل في أمريكا الشمالية ، وبالتالي ، فإن Borreliella burgdorferi هو كائن نموذجي بارز لدراسة بيولوجيا spirochete 4,5. تهدف التحقيقات في آليات B. burgdorferi لتنظيم النسخ إلى فهم أفضل لتكيفها مع التغيرات في البيئة أثناء دورانها بين ناقل القراد ومضيفات الثدييات 6,7. التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والأسمولية، وتوافر المغذيات، والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض العضوية، والأكسجين المذاب ومستويات ثاني أكسيد الكربون تعدل التعبير عن الجينات التي تعتبر مهمة ل B. burgdorferi للبقاء على قيد الحياة في ناقل المفصليات وإصابة الحيوانات8،9،10،11،12،13،14،15 ،16,17,18. كان ربط هذه الاستجابات للمنبهات بالآليات التنظيمية جانبا مهما من أبحاث B. burgdorferi 19.

تتحكم عوامل النسخ وعوامل سيغما في نسخ الجينات التي تنفذ العمليات الخلوية. يحتوي لايم واللولبيات الحموية الانتكاسية على مجموعة متفرقة نسبيا من عوامل النسخ وعوامل سيغما البديلة. على الرغم من ذلك ، هناك تغييرات نسخية معقدة توجه استجابات B. burgdorferi للبيئة20،21،22. لا تزال الآليات المحددة التي تقود تغييرات النسخ في B. burgdorferi استجابة للتغيرات البيئية غير واضحة. مقايسات النسخ في المختبر هي أدوات قوية لاستخدام نهج كيميائي حيوي لفحص الوظيفة والآليات التنظيمية لعوامل النسخ وعوامل سيغما23،24،25،26.

تم مؤخرا إنشاء نظام فحص النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز B. burgdorferi RNA24. نظرا لأن البكتيريا غالبا ما يكون لها فسيولوجيات خلوية فريدة ، فإن بوليميراز الحمض النووي الريبي من الأنواع والأجناس المختلفة يستجيب بشكل مختلف لتنقية الإنزيم وتخزين الإنزيم وظروف عازلة التفاعل27. B. burgdorferi هو أيضا بعيد وراثيا عن العديد من الأنواع البكتيرية التي تمت فيها دراسة بوليميراز الحمض النوويالريبي 20. يمكن لجوانب تحضير الإنزيم مثل ظروف التحلل والغسيل والشطف العازلة ، ومخزن التخزين المؤقت ، ومخزن تفاعل النسخ في المختبر ، وطريقة بناء الفحص أن تغير جميعها نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي. هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي وعامل سيجما RpoD ، وإنتاج قالب الحمض النووي الخطي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، وبناء مقايسات النسخ في المختبر لتسهيل التكاثر بين المختبرات التي تستخدم هذا النظام. نقوم بتفصيل مثال رد فعل لتوضيح النطاق الخطي للنسخ المعتمد على RpoD ومناقشة القيود والبدائل لهذا النهج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي وإعداد مخزون بوليميراز الحمض النووي الريبي

  1. اجمع حبيبات الخلية من 2-4 لتر من B. burgdorferi RpoC-His10X المستزرعة في وسط BSKII في بيئة محبة للهواء (34 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O 2) إلى كثافة2-4 × 107 خلايا / مل باستخدام بروتوكولات جمع الخلايا الموصوفة سابقا28,29. قم بإجراء الطرد المركزي عند 10000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في زجاجات طرد مركزي سعة 500 مل واسكب المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الخلايا في 30 مل من المخزن المؤقت HN المثلج (10 mM HEPES ، 10 mM NaCl ، pH 8.0). كرر خطوة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه باستخدام أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وصب المادة الطافية.
    ملاحظة: نقطة التوقف. قم بتجميد حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية لتخزين الخلايا لمدة تصل إلى 2 أسابيع أو انتقل فورا إلى تحلل الخلية.
  3. الحفاظ على الخلايا ، المحللة ، والبروتينات المنقاة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد ما لم تتجمد. حافظ على بوليميراز الحمض النووي الريبي في بيئة مختزلة عن طريق إضافة DTT طازجة بتركيز 2 mM إلى كل مخزن مؤقت مستخدم في هذا البروتوكول والحفاظ على الرقم الهيدروجيني 8.0.
  4. تحضير المحللة من حبيبات خلية B. burgdorferi باستخدام مجموعة تحلل البكتيريا التجارية باتباع تعليمات المجموعة. أعد تعليق الحبيبات في 10-15 مل من محلول درجة حرارة الغرفة (RT) B-PER بدون مثبط الأنزيم البروتيني واترك التحلل يستمر لمدة 5 دقائق على الجليد. يعتمد حجم التحلل على حجم حبيبات الخلية, كما هو موضح في تعليمات المجموعة.
  5. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني إلى محلول التحلل ، متبوعا بثلاث جولات من الصوتنة ، كما هو موضح في قسم النتائج التمثيلية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، تحلل الخلايا في خلية ضغط فرنسية كما هو موضح سابقا24. تخطي الخطوة 1.4. والخطوة 1.5.
  6. توضيح تحلل الخلية باستخدام الطرد المركزي والترشيح باستخدام أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. املأ حجم الأنبوب إلى الحجم الإجمالي 30 مل على الأقل عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحميل عمود الكوبالت (الجدول 1) إلى المحلول. قم بتجميع حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.
  8. قم بتخفيف المحللة في المخزن المؤقت لتحميل عمود الكوبالت (الجدول 1) باستخدام نسبة تخفيف نهائية 1:10.
  9. قم بإجراء كروماتوغرافيا التقارب على طافات الخلية المحللة الموضحة باستخدام عمود الكوبالت أو راتنج النيكل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على مثال. استخدم المخازن المؤقتة المدرجة في الجدول 1. اجمع عينات التدفق والغسيل والشطف لتحليلها.
  10. استبدل على الفور بوليميراز الحمض النووي الريبي في محلول المخزن المؤقت للشطف إلى محلول مخزن بوليميراز الحمض النووي الريبي (الجدول 1) باستخدام عمود تبادل المخزن المؤقت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  11. قم بإعداد مخزون المجمد عن طريق تركيز بوليميراز الحمض النووي الريبي باستخدام وحدات مرشح طرد مركزي مقطوعة 10 كيلو دالتون بتركيز 0.2-0.4 مجم / مل يحدده القياس الطيفي (280 نانومتر بدون تعديل معامل الانقراض [1 abs عند 1 سم = 1 مجم · مل −1]).
  12. يخزن مجمد بوليميراز الحمض النووي الريبي في أحجام 20-50 ميكرولتر في أنابيب PCR ويخزن بوليميراز الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية.
  13. تحديد جودة كروماتوغرافيا التقارب بواسطة SDS-PAGE وقياس إجمالي إنتاج البروتين عن طريق القياس الطيفي أو مقايسة BCA. قم بتشغيل العينات على جل بولي أكريلاميد 7.5٪ عند 120 فولت لمدة 50 دقيقة للحصول على دقة جيدة بواسطة SDS-PAGE.

2. تنقية RpoD المؤتلف وإعداد مخزون RpoD

  1. استزراع وحث التعبير عن بروتين ربط المالتوز الموسوم ب B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) في BL21::MBP-RpoDBb ، كما هو موضح في دليل تعليمات نظام دمج وتنقية البروتين المدرج في جدول المواد ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
    ملاحظة: نقطة التوقف. قم بتجميد كريات الخلية عند -80 درجة مئوية لتخزين الخلايا لمدة تصل إلى 2 أسابيع أو انتقل فورا إلى تحلل الخلية.
  2. قم بإجراء التحلل باستخدام مجموعة تحلل الخلايا البكتيرية التجارية أو خلية الضغط الفرنسية. انظر مثال المخزن المؤقت للتحلل في الجدول 1.
  3. توضيح تحلل الخلية باستخدام الطرد المركزي والترشيح. قم بتجميع حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر.
  4. استخراج MBP-RpoD باستخدام بروتوكول استخراج البروتين لنظام التعبير. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على تفاصيل التنفيذ والنتائج على سبيل المثال.
  5. تحديد جودة عملية كروماتوغرافيا التقارب والشطف بواسطة SDS-PAGE وقياس محصول البروتين عن طريق القياس الطيفي (280 نانومتر بدون تعديل معامل الانقراض [1 abs عند 1 سم = 1 مجم · مل −1]). استخدم 10٪ بولي أكريلاميد جل عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة للفصل في SDS-PAGE.
  6. تركيز MBP-RpoD باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع 10 كيلو دالتون إلى تركيز >2 مجم / مل يحدده القياس الطيفي.
  7. الصق MBP من RpoD في موقع انقسام العامل Xa. أضف CaCl 2 إلى كسور الشطف اللوني المتقاربة التي تحتوي على MBP-RpoD بتركيز2 mM. أضف 200 ميكروغرام من بروتياز العامل Xa لكل 30 ملغ من البروتين المنقى. احتضان بين عشية وضحاها في RT.
  8. تأكيد الانقسام الكامل ل MBP من RpoD بواسطة SDS-PAGE. استخدم 10٪ بولي أكريلاميد جل عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة للفصل في SDS-PAGE.
  9. تمييع المحلول المحتوي على MBP و RpoD بنسبة 1:10 باستخدام مخزن مؤقت ملزم بالهيبارين.
  10. افصل MBP و RpoD على عمود الهيبارين بواسطة FPLC. انظر الجدول 2 لمعرفة إعدادات FPLC.
  11. تحديد جودة منتجات كروماتوغرافيا التقارب بواسطة SDS-PAGE وقياس محصول البروتين عن طريق القياس الطيفي. استخدم 10٪ بولي أكريلاميد جل عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة للفصل في SDS-PAGE.
  12. ركز كسور الشطف التي تحتوي على RpoD باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع 10 كيلو دالتون إلى حجم نهائي يبلغ 2-3 مل.
  13. استبدل المخزن المؤقت كسور شطف RpoD المركزة إلى مخزن التخزين المؤقت باستخدام عمود ترشيح هلام.
  14. تركيز مخزون RpoD باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع 10 كيلو دالتون إلى تركيز 0.2-0.8 مجم / مل على النحو الذي يحدده القياس الطيفي.
  15. مخزون القسمة RpoD بأحجام 20-50 ميكرولتر في أنابيب PCR وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. إعداد مخزون قالب الحمض النووي

  1. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم منطقة 500 نقطة أساس المحيطة بموقع المروج المدفوع ب RpoD من الحمض النووي الجيني B. burgdorferi باستخدام تفاعل 200 ميكرولتر (الجدول 3).
  2. تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية. Elute الحمض النووي في البيولوجيا الجزيئية الصفH 2O.
  3. اضبط التركيز المولي لقوالب الحمض النووي الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 100 نانومتر عن طريق التخفيف في درجة البيولوجيا الجزيئية H2O.

4. إجراء النسخ في المختبر مع دمج النيوكليوتيدات المشعة

  1. إعداد خطة تجريبية للنسخ في المختبر . أوجد تركيزات بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RPOD) وقالب الحمض النووي (DNA) تحديد أحجام القسمة وأوامر سحب العينات لأنابيب التفاعل. انظر الجدول 4 والشكل 1 للحصول على مثال.
    ملاحظة: قم بتضمين عناصر التحكم في الخطة التجريبية ، مثل التفاعلات التي لا تحتوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي ، أو البلمرة البديلة ، أو عدم وجود قالب ، أو قوالب بديلة.
  2. احسب حجم α-32P-ATP المطلوب للتجربة. دمج هذا في الخطة التجريبية. عادة ، قم بتضمين 2 μCi من النشاط لكل تفاعل نسخ في المختبر للكشف عن شاشة الفوسفور.
  3. قم بإعداد أسطح العمل ، بما في ذلك مقعد الإشعاع ، لتقليل مخاطر التلوث الإشعاعي.
  4. قم بإذابة القسوم الطازجة من بوليميراز الحمض النووي الريبي ، و RPO ، و 5x buffer NTP ، وحلول مخزون القوالب على الجليد. امزج جميع المرق المجمد المذاب جيدا قبل سحب الماصة.
  5. تحضير خليط تفاعل رئيسي وخليط NTP منفصل للنيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية وفقا للخطة التجريبية.
  6. توزيع تفاعلات التحكم والمجموعات التجريبية في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل استعدادا لإضافة التسمية الإشعاعية في التفاعل. قم بتوزيع H2O برفق ، ومزيج التفاعل الرئيسي ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي ، و RpoD في أنابيب PCR المخصصة واخلطها عن طريق الماصة.
  7. نقل المواد المعدة إلى مقعد الإشعاع.
  8. أضف α-32P-ATP إلى NTP واخلطه عن طريق سحب لطيف.
    تنبيه: أثناء العمل مع المواد المشعة ، استخدم معدات الحماية المناسبة وإجراءات التعامل مع النظائر المشعة.
  9. أضف NTP إلى الأنابيب التي تحتوي على مخاليط تفاعل النسخ في المختبر من الخطوة 4.6.
  10. ابدأ تفاعل النسخ في المختبر بإضافة قالب الحمض النووي. امزج حجم التفاعل عن طريق سحب الإصبع برفق.
  11. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دورة حرارية أو كتلة حرارية.
  12. قم بإزالة التفاعلات من جهاز التدوير الحراري أو الكتلة الحرارية وأضف صبغة تحميل الحمض النووي الريبي 2x التي تحتوي على 50٪ فورماميد إلى حجم تفاعل متساو لإيقاف تفاعلات النسخ في المختبر .
  13. قم بتشويه الإنزيمات عن طريق احتضان التفاعلات عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دورة حرارية أو كتلة حرارية.
  14. فصل الحمض النووي الريبي في خليط تفاعل النسخ في المختبر عن طريق هلام الكهربائي باستخدام 10٪ -15٪ TBE اليوريا بولي أكريلاميد المواد الهلامية في 180 فولت لمدة 30-45 دقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على ظروف الرحلان الكهربائي للهلام ، قد يكون المحلول العازل ملوثا بالنيوكليوتيدات ذات العلامات المشعة أو قد يحتوي الجل على معظم أو كل النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية. خطط لتخزين النشاط الإشعاعي أو التخلص منه بشكل صحيح.
  15. تخيل الحمض النووي الريبي المشع باستخدام فسفوس سكرين بعد إزالة أي جزء من الجل يحتوي على ATP غير مدمج مشع. قم بتعريض الجل للشاشة الفوسفاتية طوال الليل (16 ساعة) والصورة باستخدام جهاز تصوير فسفوس (دقة 100 ميكرومتر ، جهد أنبوب 700 فولت PMT).
  16. تحليل البيانات باستخدام طرق قياس الكثافة24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تفاعل النسخ في المختبر الذي تكون فيه الخطوة المحددة للتفاعل هي بدء النسخ بوساطة عامل سيغما ، يجب أن يزداد نشاط النسخ خطيا مع مقدار عامل سيجما. نقدم إعداد تجارب النسخ في المختبر لاختبار مجموعة من تركيزات RpoD جنبا إلى جنب مع تركيزين من بوليميراز الحمض النووي الريبي لمراقبة الإشارة المتغيرة الناتجة من دمج النوكليوتيدات ذات العلامات المشعة في منتجات الحمض النووي الريبي. يتم عرض النتائج التمثيلية لإعداد بوليميراز الحمض النووي الريبي ، RpoD ، ومخزون قالب الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. يعمل الممثل في تفاعلات النسخ المختبري كمثال على مستويات نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي المقبولة للتحليل.

لتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي ، تمت زراعة 4 لتر من B. burgdorferi RpoC-His10X عند 34 درجة مئوية في ظل ظروف محبة للهواء (5٪ CO 2 ، 3٪ O2). تمت مراقبة المزارع عن كثب لكثافة اللولبيات باستخدام الفحص المجهري في المجال المظلم وتم جمعها قبل الوصول إلى كثافات أعلى من 4 × 107 لولبيات / مل. تم إعادة تعليق الخلايا في خليط B-PER للتحلل (الجدول 1). تم تجانس بيليه الخلية عن طريق السحب ، تليها حضانة لمدة 5 دقائق في RT ، وجولات لاحقة من الصوتنة التي أجريت لمدة 3 ثوان في ثلاث نسخ. تم تخفيف المحللات الموضحة باستخدام مخزن مؤقت لتحميل عمود الكوبالت و 5 مل من راتنج الكوبالت إلى حجم إجمالي قدره 180 مل. سمح ل RpoC-His10X بالارتباط براتنج الكوبالت عن طريق تغذية الخليط لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم نقل الخليط إلى عمود تدفق الجاذبية وغسله خمس مرات باستخدام 40 مل من محلول غسل الأعمدة. تم إطلاق البروتين المرتبط عن طريق تمرير 5 مل من المخزن المؤقت للشطف عبر العمود ، وتكرر الشطف سبع مرات. تم فصل عينات من كسور التدفق والغسل والشطف بواسطة SDS-PAGE وتم تصويرها عن طريق دمج البقع (الشكل 1). يتكون مركب بوليميراز الحمض النووي الريبي الأساسي من RpoC و RpoB و RpoA ، بحجم 154 كيلو دالتون و 129 كيلو دالتون و 38.5 كيلو دالتون على التوالي. توضح النتيجة التمثيلية الموضحة في الشكل 1 ثلاثة نطاقات بارزة بأحجام الببتيدات الثلاثة المكونة لمركب بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA). احتوى التدفق من كروماتوغرافيا التقارب على 0.5-1 مجم / مل من البروتين بنسبة 260/280 بين 1.0 و 1.7 ، مما يشير إلى تركيز أعلى من الأحماض النووية. كان إنتاج بروتين بوليميراز الحمض النووي الريبي بعد تركيز خليط البروتين كما هو محدد بواسطة القياس الطيفي 0.3 مجم / مل.

لتحضير مخزون بروتين RpoD ، تم التعبير عن RpoD المؤتلف مع علامة بروتين ربط المالتوز C-terminal من بلازميد pMAL-C5X في BL21 (DE3) pLysS E. coli. نمت 2 لتر من الإشريكية القولونية عند 32 درجة مئوية إلى OD600نانومتر من 0.5. ثم تمت معالجة الثقافة ب 0.3 mM IPTG للحث على التعبير عن RpoD لمدة 1 ساعة. تم تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتحليلها في B-PER. تم ترشيح 200 مل الناتجة من محللة الخلايا المخففة من خلال 10 مل من راتنج الأميلوز. تم غسل الراتنج ب 40 مل من المخزن المؤقت للربط ثماني مرات لإزالة الحمض النووي والببتيدات المتبقية. تم استخلاص RpoD الموسوم ب MBP ب 5 مل من المخزن المؤقت للشطف في عمود الراتنج خمس مرات. تم تحليل التدفق من خطوات الربط والغسيل وكسور الشطف بواسطة SDS-PAGE (الشكل 2 أ). المكون الرئيسي في جزء الشطف هو الببتيد ~ 115 كيلو دالتون ، وهو يطابق حجم المؤتلف B. burgdorferi RpoD المؤتلف الموسوم ب MBP. تم دمج كسور الشطف ، وتم تعديل تركيز CaCl 2 إلى2 mM ، وأضيف 100 ميكروغرام من بروتياز FactorXa إلى 40 ملغ من البروتين المنقى. بعد الهضم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ، تم تحليل التفاعل بواسطة SDS-PAGE (الشكل 2B). بعد الانقسام مع بروتياز العامل Xa ، كان المنتجان الرئيسيان في الخليط هما RpoD (73.6 كيلو دالتون) و MBP (45 كيلو دالتون). تم فصل خليط بروتينات RpoD و MBP باستخدام كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين. تم تخفيف الخليط بنسبة 1:10 في محلول ربط الهيبارين وتحميله في عمود راتينج مرتبط بالهيبارين في FPLC. تم استخلاص RpoD مع تدرج متزايد من كلوريد الصوديوم إلى تركيز 1 M. عندما تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE ، كان النطاق الرئيسي بحجم 73.6 كيلو دالتون واضحا في جزء الشطف في نطاق 400-600 mM NaCl (الشكل 2C). تم تنقية بعض شظايا RpoD المتدهورة. تم دمج الكسور المحتوية على RpoD ، وتبادل المخزن المؤقت في مخزن تخزين RpoD ، ثم تم تركيزها باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع 10 كيلو دالتون. كان تركيز RpoD النهائي 0.67 مجم / مل (9.1 مللي مول) كما هو محدد بواسطة القياس الطيفي.

تم إنشاء قالب DNA مزدوج تقطعت به السبل يشمل موقع المروج ل B. burgdorferi flgB بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تضخيم مروج flgB بواسطة الاشعال التي تتوافق مع 250 نقطة أساس في المنبع والمصب للمروج (الجدول 6) باستخدام تفاعل 200 ميكرولتر يحتوي على 30 نانوغرام من الحمض النووي B. burgdorferi 24,30. تم تحليل منتج PCR بواسطة هلام كهربائي في هلام أغاروز 1٪ (الشكل 3). كان حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل حوالي 500 نقطة أساس مع تجانس واضح. الأهم من ذلك ، يمكن أن تساهم الأملاح وتلوث مكونات الخلية في تباين نتائج تفاعل النسخ في المختبر. نحن نضمن أن قالب الحمض النووي محلى تماما على عمود تنقية PCR.

يمكن للمخطط التجريبي الذي يبدأ فيه النسخ بإضافة قالب الحمض النووي اختبار معدل التعرف على المروج وبدء النسخ. في تجاربنا التمثيلية ، تم تحضير سلسلة تخفيف من بروتين RpoD عن طريق تخفيفات مزدوجة في الماء تتراوح من 16 نانومتر -1 ميكرومتر. تم إنشاء مزيج رئيسي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي في مخزن مؤقت للتفاعل يحتوي على الكاتيونات ثنائية التكافؤ المطلوبة للنشاط (الجدول 4 والجدول 5). تم اقتباس RpoD والمزيج الرئيسي معا على الجليد. سمح للمزيج الرئيسي الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي و RpoD بالاحتضان بينما تم إعداد خطوات أخرى للنسخ في المختبر . قمنا بدمج ثلاثة تفاعلات تحكم: تفاعل تحكم إيجابي تم إعداده بشكل منفصل عن المزيج الرئيسي ، وتفاعل تحكم سلبي لا يحتوي على قالب DNA للتأكد من أن إشارة النسخ في المختبر تعتمد على القالب ، ورد فعل تحكم سلبي بدون بوليميراز الحمض النووي الريبي للتأكد من أن الإشارة تعتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي. تمت إضافة النيوكليوتيدات الموسومة إشعاعيا إلى التفاعل عن طريق خلط 5 ميكرولتر من (α-32P-ATP) إلى 20 ميكرولتر من خليط مخزون NTP 10x لإنشاء ما يكفي من القسمة ل 20 تفاعلا للتعويض عن الأحجام غير القابلة للاسترداد. أخيرا ، تم إدخال قالب ترميز الحمض النووي لمروج flgB إلى أنابيب التفاعل عن طريق السحب باتباع ترتيب السحب المخطط له مسبقا (الشكل 4).

تم الكشف عن الإشارة من شظايا الحمض النووي الريبي الناتجة عن النسخ في المختبر بواسطة شاشة الفوسفور بعد فترة تعرض مدتها 16 ساعة لهلام TBE-urea المحتوي على الحمض النووي الريبي مفصولا بالرحلان الكهربائي الهلامي. تجربة تحتوي على 50 نانومتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي و RpoD في نطاق 500 نانومتر إلى 16 نانومتر ولدت منتجات الحمض النووي الريبي من 250 bp (الشكل 5). لكل تخفيف مزدوج لتركيز RpoD ، كان هناك مستوى أقل من منتج الحمض النووي الريبي المتراكم. كانت هناك سلسلة من منتجات BP المنخفضة التي ظهرت أسفل النطاق البارز ، مما يشير إلى شظايا الحمض النووي الريبي غير المكتملة بسبب توقف النسخ أو قالب الحمض النووي المجزأ. كانت منتجات الحمض النووي الريبي غائبة عن عنصر التحكم في عدم وجود قالب ، مما يشير إلى عدم وجود شظايا الحمض النووي الخارجية التي تساهم في الإشارة في هذا الفحص. لم يتم الكشف عن أي إشارة في عنصر التحكم في عدم وجود بوليميراز الحمض النووي الريبي ، مما يشير إلى أن بوليميراز B. burgdorferi RNA كان البلمرة الوحيد الذي يساهم في إنتاج الحمض النووي الريبي في هذا الفحص.

في تجربة ثانية ، استخدمنا تركيزا أقل من 25 نانومتر بوليميراز الحمض النووي الريبي (الشكل 6). تم الكشف عن عدد أقل من منتجات الحمض النووي الريبي عبر نطاق تركيزات RpoD التي تم اختبارها مقارنة بالشكل 5 ، وكانت كثافة إشارة الخلفية أعلى. هذا يمثل مشكلة لتحليل المصب عن طريق قياس الكثافة. عندما تم تحليل صورة الفوسفور عن طريق قياس الكثافة (الشكل 7) ، أشارت إشارة قياس الكثافة التي تم الحصول عليها من الشاشة الفوسفاتية إلى وجود علاقة خطية بين كمية RpoD الموجودة في التفاعل في كلتا التجربتين. ومع ذلك ، في التجربة ذات إشارة الخلفية العالية ، كان التفاعل الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي 25 نانومتر وأقل من 100 نانومتر من RpoD غير موثوق به لمقارنات مستوى النسخ النسبي.

Figure 1
الشكل 1: فصل بوليميراز الحمض النووي الريبي B. burgdorferi الموسوم به المنقى بواسطة كروماتوغرافيا التقارب. تم تخفيف جزء التدفق من محلول الخلية (الحارة 1) ، وجزء الغسيل الأول (الحارة 2) ، وجزء الغسيل الأخير (الحارة 3) ، وخمسة كسور شطف (الحارة 4-8) في مخزن مؤقت لتحميل العينة 2x ، وغليها ، وفصلها بواسطة SDS-PAGE في هلام بولي أكريلاميد متدرج عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحليل تنقية RpoD بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي. (أ) كسور التدفق المجمعة (الحارة 1 والحارة 2) ، وكسور الغسيل (الممرات 3-5) ، وكسور الشطف (الممرات 6-10) من تنقية RpoD الموسوم ب MBP بواسطة كروماتوغرافيا تقارب راتنج الأميلوز. (ب) خليط البروتين بعد انشقاق MBP و RpoD باستخدام عامل البروتياز Xa. (C) محلول التدفق (الحارة 1) وكسور الشطف مع تدرج متزايد لكلوريد الصوديوم (الممرات 2-9) من كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين لفصل MBP و RpoD. في كل هلام مقدم ، تم خلط العينات مع مخزن مؤقت تحميل 2x ، مسلوق ، وفصلها في هلام بولي أكريلاميد متدرج باستخدام SDS-PAGE عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توليد تفاعل البوليميراز المتسلسل لقوالب النسخ في المختبر. يتم عرض amplicon بحجم 500 bp يحتوي على مروج flgB (الحارة 1 والحارة 2) وتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحكم التي تحتوي على مضخمات لمواقع الترويج الأخرى (الممرات 3-4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الترتيب التجريبي وخطة تسلسل الماصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التباين المعتمد على RpoD في إشارة صورة الفوسفور من الحمض النووي الريبي الناتج عن النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي B. burgdorferi. احتوت تفاعلات النسخ في المختبر على 50 نانومتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي ومستويات متفاوتة من RpoD المشار إليها أعلاه النطاقات24. تم فصل الحمض النووي الريبي بواسطة هلام اليوريا TBE بنسبة 10٪ ، وتم استخدام شاشة الفوسفور لالتقاط الإشارة من الاضمحلال الإشعاعي على مدى 16 ساعة. تم تعديل هذا الرقم من بويل وآخرين.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التباين المعتمد على RpoD في إشارة صورة الفوسفور من الحمض النووي الريبي الناتج عن النسخ في المختبر. احتوى النسخ في المختبر على 25 نانومتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي ومستويات متفاوتة من RpoD المشار إليها فوق النطاقات. تم فصل الحمض النووي الريبي بواسطة هلام اليوريا TBE بنسبة 15٪ ، وتم استخدام شاشة الفوسفور لالتقاط الإشارة من الاضمحلال الإشعاعي على مدار 16 ساعة. زاد انخفاض تركيز بوليميراز الحمض النووي الريبي وإشارة الخلفية الأعلى من صعوبة القياس الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: زيادة تراكم الحمض النووي الريبي المشع في تفاعلات النسخ في المختبر مع زيادة مستويات RpoD. تم تحليل الإشارات المكتشفة في تصوير شاشة الفوسفور عن طريق قياس الكثافة بدون طرح في الخلفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات الوسائط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: إعدادات FPLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: خطة تجريبية لبوليميراز الحمض النووي الريبي 50 نانومتر وحساب الحجم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: خطة تجريبية لبوليميراز الحمض النووي الريبي 25 نانومتر وحساب الحجم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: السلالات وقليل النيوكليوتيدات المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام فحوصات النسخ في المختبر التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول المقدم مؤخرا لدراسة دور عامل النسخ في B. burgdorferi ويمكن تطبيقها لبناء تجارب مماثلة باستخدام عوامل النسخ الأخرى وعوامل سيغما والجزيئات23. بمجرد الحصول على بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط من B. burgdorferi واكتشاف نشاطه ، يمكن تعديل المكونات والظروف داخل مقايسات النسخ في المختبر. الفحص مرن للغاية وقابل للتعديل. التفاعلات معيارية ومبنية من المخزونات المجمدة وتتطلب مهلة قصيرة بمجرد اختيار المعلمات التجريبية. بالنظر إلى مخزون كاف ، يمكن إجراء تجارب متعددة في يوم 1.

يعد الحصول على بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط هو الجانب الأكثر أهمية في تحضير تفاعل النسخ في المختبر . نوصي بحصاد بوليميراز الحمض النووي الريبي من الخلايا المزروعة إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة كما هو موضح في هذا البروتوكول. في تنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي من أي بكتيريا ، لوحظ معدل النمو كعامل مهم في تنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط. يمكن أن تتراكم بوليميراز الحمض النووي الريبي تعديلات ما بعد الترجمة وقد تترافق مع عوامل النسخ المثبطة في المرحلة الثابتة من النمو31. لم ننجح في تنقية كميات كبيرة من بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط من مزارع B. burgdorferi التي نمت إلى المرحلة الثابتة. نهج كروماتوغرافيا التقارب ، مقارنة بنهج الفصلالمادي 32 ، مفيد أيضا للتنقية من B. burgdorferi لأن الكائن الحي يصل إلى كثافة منخفضة في الثقافة ، وتراكم كميات كبيرة من زراعة الخلايا هو مادة كثيفة نسبيا.

أثناء تنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري الآخر ، يمكن لعوامل سيغما أن تنقي بكميات كبيرة اعتمادا على طريقة التنقية والظروف33،34،35،36. يمكن أن تحد التنقية المشتركة لعوامل سيجما من تجارب المصب باستخدام عوامل سيغما البديلة أو عوامل سيجما المعدلة أو نقص عوامل سيجما. علاوة على ذلك ، فإن المكملات مع عامل التدبير المنزلي سيجما RpoD مفيد للكشف عن النشاط بغض النظر عن التنقية المشتركة الأولية لعامل سيجما37. نظرا لمرونة فصل عامل سيجما عن قلب بوليميراز الحمض النووي الريبي ، فإننا نعتبر أنه من المفيد ألا تتكاثر عوامل سيجما في ظل ظروف تنقية كروماتوغرافيا تقاربه الموضحة هنا. من الممكن أن تتغير ظروف التنقية لإنتاج إنزيمات هولوزيمية سليمة ونشطة تحتوي على RpoD. على سبيل المثال ، من المحتمل أن تؤثر تركيزات الملح على استقرار إنزيمات الوحدات الفرعية المتعددة ، كما أن تأثير تركيز الإيميدازول على استقرار مركب بوليميراز B. burgdorferi RNA أو دمجه الكاتيوني ثنائي التكافؤ غير معروف أيضا.

ب. بورغدورفيري النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي حساس لنوع وكمية الكاتيونات ثنائية التكافؤ الموجودة24. وجدنا أن المنغنيز مطلوب لأقصى نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي ، ويبدو أن المغنيسيوم يساهم في النشاط بدرجة أقل. تضيف الأيونات الملوثة في الماء قدرا كبيرا من التباين إلى النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، فإن المياه النقية للغاية مثل درجة البيولوجيا الجزيئية ، ودرجة HPLC ، ودرجة تحليل المعادن H2O مع وجود عدد قليل من أيونات المعادن ضرورية لنشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي العالي في البروتوكول الموضح هنا. بوليميراز الحمض النووي الريبي حساس أيضا لدرجة الحموضة ويتطلب بيئة مختزلة أثناء التنقية27. أدى تغير درجة الحموضة أو استخدام BME كعامل اختزال إلى بوليميراز الحمض النووي الريبي غير النشط. نوصي باستخدام بوليميراز E. coli RNA المتاح تجاريا كعنصر تحكم لضمان البناء السليم لمقايسات النسخ في المختبر 24. الإشريكية القولونية سيسمح بوليميراز الحمض النووي الريبي باختبار صلاحية النيوكليوتيدات ، وطريقة بناء القالب ، ودمج الملصقات الإشعاعية ، وفصل الحمض النووي الريبي ، وطريقة الكشف عن الإشارة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن B. burgdorferi RNA polymerase له متطلبات كاتيون وعازلة ومروج محددة ثنائية التكافؤ مقارنة بالإشريكية القولونية.

هناك العديد من طرق الكشف المتاحة لتفاعلات النسخ في المختبر. يعد دمج الصبغة ومقايسات المنارة الجزيئية بدائل شائعة لطريقة الكشف عن الملصق الإشعاعي38,39. يعد دمج النوكليوتيدات الموسومة إشعاعيا حاليا أكثر طرق الكشف عن الحمض النووي الريبي حساسية. تتطلب المقايسات البديلة المزيد من بوليميراز الحمض النووي الريبي للوصول إلى مستويات إشارة قابلة للقياس مقارنة بمقايسات التسمية الإشعاعية. بالإضافة إلى ذلك, عادة ما يكون لدمج الصبغة وطرق المنارة الجزيئية طرق أكثر للإشارات لتكون خاطئة. على سبيل المثال ، يمكن أن يتسبب تلوث DNase في إطلاق المنارات الجزيئية إشارة في غياب هدفها. باستخدام دمج التسمية الإشعاعية ، يمكن الكشف عن النشاط النسبي لإنزيم بوليميراز B. burgdorferi RNA حتى عند المستويات المنخفضة ، والتي تناسب التجارب الأولية مع إنزيمات بوليميراز الحمض النووي الريبي.

في حين أن تركيز إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي B. burgdorferi المتضمن في التفاعل يتم توحيده بواسطة القياس الطيفي ، يمكن أن يكون هذا القياس مصدرا للتباين. يمكن أن يعتمد النشاط المحدد لبوليميراز الحمض النووي الريبي على عدد الإنزيمات النشطة كاملة التكوين ، والتي تعد جزءا من خليط البروتينالكلي 40. على سبيل المثال ، تم تحديد الكمية المولية البالغة 50 نانومتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي المبلغ عنها في نتائجنا عن طريق القياس الطيفي ، لكن تحليل كميات الوحدات الفرعية عن طريق النشاف الغربي الكمي كشف أن الوحدة الفرعية RpoA كانت مكونا محددا في عدد إنزيمات هولوزيمات بوليميراز الحمض النووي الريبي المحتملة ، وكان من الممكن استخدام 21 نانومتر فقط من بوليميراز الحمض النووي الريبي المتكون بالكامل في خليطنا24. يجب دائما إجراء التجارب للتحكم في التباين من دفعة إلى أخرى في بوليميراز الحمض النووي الريبي والمكونات الأخرى لتفاعل النسخ في المختبر .

في تجربتنا التمثيلية الموضحة في الشكل 5 ، تم تغيير مستويات RpoD ، وتم توضيح علاقة خطية بين RpoD والإشارة المكتشفة. النسخ في المختبر هو طريقة متعددة الاستخدامات يمكن تغييرها بسهولة باستخدام القالب التجريبي المقدم (الجدول 4). على سبيل المثال ، يمكن اختبار عوامل سيجما البديلة أو قوالب الحمض النووي البديلة بسهولة24. يمكن أن تتضمن القوالب البديلة مناطق محفزة مختلفة تم إنشاؤها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو البلازميد المنقى من الخلايا لإدخال ميزات الحمض النووي فائقة الالتفاف والميثيلي. بالنسبة لمستوى معين من RpoD وبوليميراز الحمض النووي الريبي والقالب ، يمكن إضافة مستويات مختلفة من عامل النسخ لرؤية تثبيط أو تعزيز النشاط من المروج23. يمكن تغيير ترتيب إضافة المكونات والنسب المولية داخل تفاعل النسخ في المختبر بحيث تتشكل مجمعات بدء النسخ قبل بدء التفاعل ؛ يمكن أن تقيس هذه التفاعلات استطالة النسخ بدلا من بدء النسخ40. يمكن تغيير مقايسة النسخ في المختبر لتناسب مجموعة متنوعة من التحقيقات في بيولوجيا B. burgdorferi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير أعضاء هيئة التدريس لصندوق الاستثمار الاستراتيجي للعلوم الصحية بجامعة كريتون. تم توفير سلالة B. burgdorferi RpoC-His10X من قبل الدكتور د. سكوت صامويلز من جامعة مونتانا. تم توفير سلالة الإشريكية القولونية التي تؤوي بلازميد pMAL-C5X الذي يشفر أليل rpoD المرتبط بالبروتين المرتبط بالمالتوز من قبل الدكتور فرانك غيرارديني من مختبرات روكي ماونتن ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 185 ، بوريليا ، بوريليلا ، النسخ في المختبر ، بوليميراز الحمض النووي الريبي ، RpoD ، RpoC
المكونات الأساسية <em>لبوريليلا</em> (<em>بوريليا</em>) <em>بورغدورفيري في</em> مقايسات النسخ المختبري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyle, W. K., Sorensen, H. N.,… More

Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter