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Immunology and Infection

बोरेलिला (बोरेलिया) बर्गडॉर्फेरी इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन एसेस के आवश्यक घटक

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख बोरेलिला बर्गडोर्फरी में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के तंत्र को समझ सकते हैं। यह प्रोटोकॉल बी बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ को शुद्ध करने और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं को करने के चरणों का वर्णन करता है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख का उपयोग करने वाले प्रयोगात्मक दृष्टिकोण ों को सक्रिय आरएनए पोलीमरेज़ के विश्वसनीय शुद्धिकरण और भंडारण की आवश्यकता होती है।

Abstract

बोरेलिला बर्गडॉर्फेरी एक जीवाणु रोगज़नक़ है जिसमें सीमित चयापचय और जीनोमिक प्रदर्शन होते हैं। बर्गडॉर्फरी कशेरुक और टिक्स के बीच बाह्य रूप से पारगमन करता है और संक्रमण के दौरान असमान वातावरण में जीवित रहने के लिए नाटकीय रूप से अपने ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को फिर से तैयार करता है। बर्गडॉर्फेरी अध्ययनों का एक फोकस स्पष्ट रूप से समझना है कि बैक्टीरिया ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के माध्यम से अपने पर्यावरण का जवाब कैसे देता है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के बुनियादी तंत्र को जैव रासायनिक रूप से विच्छेदित करने की अनुमति देते हैं। बर्गडॉर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ शुद्धिकरण और भंडारण, सिग्मा कारक शुद्धिकरण, डीएनए टेम्पलेट पीढ़ी, और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख का वर्णन करते हुए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल बी बर्गडॉर्फेरी 5 ए 4 आरपीओसी-हिस (5 ए 4-आरपीओसी) से शुद्ध आरएनए पोलीमरेज़ के उपयोग का वर्णन करता है। 5ए4-आरपीओसी पहले प्रकाशित एक स्ट्रेन है जो आरएनए पोलीमरेज़ के सबसे बड़े सबयूनिट को एन्कोडिंग करने वाले आरपीओसी जीन पर 10एक्सएचआईएस-टैग को आश्रय देता है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख में स्ट्रेन 5ए4-आरपीओसी से शुद्ध आरएनए पोलीमरेज़, हाउसकीपिंग सिग्मा फैक्टर आरपीओडी का एक पुनः संयोजक संस्करण और एक पीसीआर-जनित डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट शामिल हैं। जबकि प्रोटीन शोधन तकनीक और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख को इकट्ठा करने के दृष्टिकोण वैचारिक रूप से अच्छी तरह से समझे जाते हैं और अपेक्षाकृत सामान्य हैं, आरएनए पोलीमरेज़ के लिए हैंडलिंग विचार अक्सर जीव से जीव में भिन्न होते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बी बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ पर एंजाइमेटिक अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है। विधि को आरएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि पर प्रतिलेखन कारकों, प्रमोटरों और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

लाइम रोग और रिलैप्सिंग बुखार जेनेरा बोरेलिया और बोरेलिला 1,2,3 में स्पाइरोकेट रोगजनकों के कारण होता है। लाइम रोग उत्तरी अमेरिका में एक प्रमुख वेक्टर-जनित बीमारी है, और, परिणामस्वरूप, बोरेलिला बर्गडॉर्फेरी स्पाइरोकेट जीव विज्ञान 4,5 का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव है। बर्गडॉर्फेरी तंत्र में जांच का उद्देश्य पर्यावरण में परिवर्तन के लिए इसके अनुकूलन को बेहतर ढंग से समझना है क्योंकि यह अपने टिक वेक्टर और स्तनधारी मेजबान 6,7 के बीच चक्र करता है। पीएच, तापमान, परासरणता, पोषक तत्वों की उपलब्धता, शॉर्ट-चेन फैटी एसिड, कार्बनिक एसिड, और घुलित ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के स्तर में परिवर्तन जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं जो बी बर्गडॉर्फरी के लिए अपने आर्थ्रोपोड वेक्टर में जीवित रहने और जानवरों को संक्रमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. इन प्रतिक्रियाओं को नियामक तंत्र के साथ उत्तेजनाओं से जोड़ना बी बर्गडॉर्फेरी अनुसंधान19 का एक महत्वपूर्ण पहलू रहा है।

प्रतिलेखन कारक और सिग्मा कारक जीन के प्रतिलेखन को नियंत्रित करते हैं जो सेलुलर प्रक्रियाओं को पूरा करते हैं। लाइम और रिलैप्सिंग फीवर स्पाइरोकेट्स प्रतिलेखन कारकों और वैकल्पिक सिग्मा कारकों के अपेक्षाकृत विरल सेट को परेशान करते हैं। इसके बावजूद, पर्यावरण20,21,22 के लिए बी बर्गडॉर्फरी प्रतिक्रियाओं को निर्देशित करने वाले जटिल ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन हैं। पर्यावरणीय परिवर्तनों के जवाब में बी बर्गडॉर्फेरी में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों को चलाने वाले विशिष्ट तंत्र स्पष्ट नहीं हैं। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख प्रतिलेखन कारकों और सिग्मा कारकों23,24,25,26 के कार्य और नियामक तंत्र को परख करने के लिए जैव रासायनिक दृष्टिकोण को नियोजित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं।

बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख प्रणाली हाल ही मेंस्थापित की गई थी। चूंकि बैक्टीरिया में अक्सर अद्वितीय सेलुलर फिजियोलॉजी होती है, इसलिए विभिन्न प्रजातियों और जेनेरा के आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम शुद्धिकरण, एंजाइम भंडारण और प्रतिक्रिया बफरस्थितियों के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देते हैं। बर्गडॉर्फेरी आनुवंशिक रूप से कई जीवाणु प्रजातियों से दूर है जिसमें आरएनए पोलीमरेज़का अध्ययन किया गया है। एंजाइम तैयारी के पहलू जैसे कि लाइसिस, वॉश और क्षालन बफर स्थितियां, भंडारण बफर, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन बफर, और परख निर्माण की विधि सभी आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि को बदल सकते हैं। यहां, हम आरएनए पोलीमरेज़ और सिग्मा फैक्टर आरपीओडी के शुद्धिकरण, रैखिक डबल-फंसे डीएनए टेम्पलेट के उत्पादन और इस प्रणाली का उपयोग करने वाली प्रयोगशालाओं के बीच प्रजनन क्षमता की सुविधा के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम आरपीओडी-निर्भर प्रतिलेखन के लिए रैखिक सीमा प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण प्रतिक्रिया का विस्तार करते हैं और इस दृष्टिकोण की सीमाओं और विकल्पों पर चर्चा करते हैं।

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Protocol

1. आरएनए पोलीमरेज़ का शुद्धिकरण और आरएनए पोलीमरेज़ स्टॉक की तैयारी

  1. पहले वर्णित सेल संग्रह प्रोटोकॉल28,29 का उपयोग करके 2-4 x 107 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए एक माइक्रोएरोफिलिक वातावरण (34 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 3% ओ 2) में बीएसकेआईआई माध्यम में संवर्धित बी बर्गडॉर्फरी आरपीओसी-एचआईएस 10 एक्स के2-4 एल से सेल गोली एकत्र करें। 500 एमएल केन्द्रापसारक बोतलों में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें और सतह पर तैरने वाला डालें।
  2. बर्फ-ठंडे एचएन बफर (10 एमएम एचईपीईएस, 10 एमएम एनएसीएल, पीएच 8.0) के 30 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके ऊपर वर्णित सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराएं और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    नोट: स्टॉपिंग पॉइंट। कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक संग्रहीत करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली को फ्रीज करें या तुरंत सेल लाइसिस के लिए आगे बढ़ें।
  3. कोशिकाओं, लाइसेट और शुद्ध प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर बनाए रखें जब तक कि ठंड न हो। आरएनए पोलीमरेज़ को इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक बफर में 2 एमएम की एकाग्रता पर ताजा तैयार डीटीटी जोड़कर और पीएच 8.0 बनाए रखकर कम करने वाले वातावरण में रखें।
  4. किट निर्देशों का पालन करते हुए एक वाणिज्यिक बैक्टीरियल लाइसिस किट का उपयोग करके बी बर्गडॉर्फेरी सेल पेलेट से लाइसेट तैयार करें। प्रोटीज अवरोधक के बिना कमरे के तापमान (आरटी) बी-पीईआर समाधान के 10-15 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और लाइसिस को बर्फ पर 5 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें। लाइसिस की मात्रा सेल गोली के आकार पर निर्भर करती है, जैसा कि किट निर्देशों में वर्णित है।
  5. लाइसिस समाधान में प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल जोड़ें, इसके बाद सोनिकेशन के तीन दौर, जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक फ्रांसीसी दबाव सेल में कोशिकाओं को लाइज़ करें जैसा कि पहले24 वर्णित है। चरण 1.4 को छोड़ दें। और चरण 1.5.
  6. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन का उपयोग करके सेल लाइसेट को स्पष्ट करें। समाधान में कोबाल्ट कॉलम लोडिंग बफर (तालिका 1) जोड़कर ट्यूब की मात्रा को कम से कम 30 एमएल कुल मात्रा में भरें। 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल मलबे को पेलेट करें।
  7. 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें।
  8. 1: 10 अंतिम कमजोर पड़ने के अनुपात का उपयोग करके कोबाल्ट कॉलम लोडिंग बफर (तालिका 1) में लाइसेट को पतला करें।
  9. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कोबाल्ट या निकल-राल कॉलम का उपयोग करके स्पष्ट सेल लाइसेट सुपरनैटेंट पर आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी करें। एक उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें। तालिका 1 में सूचीबद्ध बफर का उपयोग करें। विश्लेषण के लिए प्रवाह-दर, धोने और क्षालन नमूने एकत्र करें।
  10. निर्माता के निर्देशों के बाद बफर एक्सचेंज कॉलम का उपयोग करके आरएनए पोलीमरेज़ स्टोरेज बफर समाधान (तालिका 1) में क्षालन बफर समाधान में आरएनए पोलीमरेज़ का तुरंत आदान-प्रदान करें।
  11. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित 0.2-0.4 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके आरएनए पोलीमरेज़ को केंद्रित करके फ्रीजर स्टॉक तैयार करें (विलुप्त होने के गुणांक समायोजन के बिना280 एनएम [1 सेमी पर 1 एब्स = 1 मिलीग्राम -एमएल -1])।
  12. एलिकोट आरएनए पोलीमरेज़ फ्रीजर पीसीआर ट्यूबों में 20-50 μL वॉल्यूम में स्टॉक करता है और आरएनए पोलीमरेज़ को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
  13. एसडीएस-पेज द्वारा आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी की गुणवत्ता निर्धारित करें और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या बीसीए परख द्वारा कुल प्रोटीन उपज को मापें। एसडीएस-पेज द्वारा अच्छे रिज़ॉल्यूशन के लिए 50 मिनट के लिए 120 वी पर 7.5% पॉलीक्रिलामाइड जेल पर नमूने चलाएं।

2. पुनः संयोजक आरपीओडी का शुद्धिकरण और आरपीओडी स्टॉक की तैयारी

  1. बीएल 21 में माल्टोज बाइंडिंग प्रोटीन-टैग किए गए पुनः संयोजक बी बर्गडॉर्फेरी आरपीओडी (एमबीपी-आरपीओडी) की अभिव्यक्ति को कल्चर और प्रेरित करना: एमबीपी-आरपीओडीबीबी, जैसा कि सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध प्रोटीन संलयन और शुद्धिकरण प्रणाली निर्देश मैनुअल द्वारा वर्णित है, और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करता है।
    नोट: स्टॉपिंग पॉइंट। कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक संग्रहीत करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों को फ्रीज करें या तुरंत सेल लाइसिस के लिए आगे बढ़ें।
  2. एक वाणिज्यिक बैक्टीरियल सेल लाइसिस किट या फ्रेंच प्रेशर सेल का उपयोग करके लाइसिस करें। तालिका 1 में उदाहरण लाइसिस बफर देखें।
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन का उपयोग करके सेल लाइसेट को स्पष्ट करें। 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल मलबे को पेलेट करें। 0.45 μm फ़िल्टर का उपयोग कर के सतह पर तैरने वाला फ़िल्टर करें।
  4. अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके एमबीपी-आरपीओडी निकालें। उदाहरण के लिए कार्यान्वयन विवरण और परिणाम के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।
  5. एसडीएस-पेज द्वारा आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रक्रिया और क्षालन की गुणवत्ता निर्धारित करें और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रोटीन उपज को मापें (विलुप्त होने के गुणांक समायोजन के बिना ए280 एनएम [1 सेमी पर 1 एब्स = 1 मिलीग्राम -एमएल -1])। एसडीएस-पेज में पृथक्करण के लिए 30 मिनट के लिए 200 वी पर 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल का उपयोग करें।
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित >2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके एमबीपी-आरपीओडी पर ध्यान केंद्रित करें।
  7. फैक्टर एक्सए क्लीवेज साइट पर आरपीओडी से एमबीपी को छोड़ दें। 2 एमएम की एकाग्रता पर एमबीपी-आरपीओडी युक्त आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी क्षालन अंशों में सीएसीएल2 जोड़ें। शुद्ध प्रोटीन के प्रत्येक 30 मिलीग्राम के लिए फैक्टर एक्सए प्रोटीज के 200 μg जोड़ें। आरटी में रात भर इनक्यूबेट करें।
  8. SDS-PAGE द्वारा RPOD से MBP की पूर्ण दरार की पुष्टि करें। एसडीएस-पेज में पृथक्करण के लिए 30 मिनट के लिए 200 वी पर 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल का उपयोग करें।
  9. हेपरिन-बाइंडिंग बफर के साथ 1: 10 के अनुपात में एमबीपी और आरपीओडी युक्त समाधान को पतला करें।
  10. एफपीएलसी द्वारा हेपरिन कॉलम पर एमबीपी और आरपीओडी को अलग करें। FPLC सेटिंग्स के लिए तालिका 2 देखें।
  11. एसडीएस-पेज द्वारा आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी उत्पादों की गुणवत्ता निर्धारित करें और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रोटीन उपज को मापें। एसडीएस-पेज में पृथक्करण के लिए 30 मिनट के लिए 200 वी पर 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल का उपयोग करें।
  12. 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके आरपीओडी युक्त क्षालन अंशों को 2-3 एमएल की अंतिम मात्रा में केंद्रित करें।
  13. बफर जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग करके भंडारण बफर में केंद्रित आरपीओडी क्षालन अंशों का आदान-प्रदान करता है।
  14. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित 0.2-0.8 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके आरपीओडी स्टॉक को केंद्रित करें।
  15. पीसीआर ट्यूबों में 20-50 μL वॉल्यूम पर Alicot RPOD स्टॉक और -80 °C पर स्टोर करें।

3. डीएनए टेम्पलेट स्टॉक की तैयारी

  1. पीसीआर 200 μL प्रतिक्रिया (तालिका 3) का उपयोग करके B. बर्गडॉर्फरी जीनोमिक डीएनए से एक RPOD संचालित प्रमोटर साइट के आसपास के 500 bp क्षेत्र को बढ़ाता है।
  2. एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें। आणविक जीव विज्ञान ग्रेड एच2ओ में डीएनए का पता लगाएं।
  3. आणविक जीव विज्ञान ग्रेड एच2ओ में कमजोर पड़ने से पीसीआर-जनित डीएनए टेम्प्लेट की दाढ़ एकाग्रता को 100 एनएम तक समायोजित करें।

4. रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड ्स को शामिल करने के साथ इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन करें

  1. एक इन विट्रो प्रतिलेखन प्रयोगात्मक योजना तैयार करें। आरएनए पोलीमरेज़, आरपीओडी और डीएनए टेम्पलेट सांद्रता निर्धारित करें। प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए एलिकोट वॉल्यूम और पाइपिंग ऑर्डर निर्धारित करें। उदाहरण के लिए तालिका 4 और चित्र 1 देखें।
    नोट: प्रयोगात्मक योजना में नियंत्रण शामिल करें, जैसे कि आरएनए पोलीमरेज़, वैकल्पिक पोलीमरेज़, कोई टेम्पलेट या वैकल्पिक टेम्पलेट युक्त प्रतिक्रियाएं।
  2. प्रयोग के लिए आवश्यक α-32पी-एटीपी की मात्रा की गणना करें। इसे प्रयोगात्मक योजना में शामिल करें। आमतौर पर, फॉस्फोर स्क्रीन का पता लगाने के लिए प्रति इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में 2 μCi गतिविधि शामिल करें।
  3. विकिरण संदूषण जोखिम को कम करने के लिए विकिरण बेंच सहित काम की सतहों को तैयार करें।
  4. बर्फ पर आरएनए पोलीमरेज़, आरपीओ, 5एक्स बफर एनटीपी और टेम्प्लेट स्टॉक समाधान के ताजा एलिकोट पिघलाएं। पाइपिंग से पहले सभी पिघले हुए जमे हुए स्टॉक को अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. प्रयोगात्मक योजना के अनुसार रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड के लिए एक मास्टर प्रतिक्रिया मिश्रण और एक अलग एनटीपी मिश्रण तैयार करें।
  6. प्रतिक्रिया में रेडियोलेबल जोड़ने की तैयारी में पीसीआर ट्यूबों में नियंत्रण प्रतिक्रियाओं और प्रयोगात्मक सेटों को वितरित करें। धीरे से एच2ओ, रिएक्शन मास्टर मिक्स, आरएनए पोलीमरेज़ और आरपीओडी को नामित पीसीआर ट्यूबों में वितरित करें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें।
  7. तैयार सामग्री को एक विकिरण बेंच में स्थानांतरित करें।
  8. एनटीपी में α-32पी-एटीपी जोड़ें और नरम पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    चेतावनी: रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करते समय, रेडियोधर्मी आइसोटोप के लिए उपयुक्त सुरक्षात्मक उपकरण और हैंडलिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करें।
  9. चरण 4.6 से इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण वाले ट्यूबों में एनटीपी जोड़ें।
  10. डीएनए टेम्पलेट के अतिरिक्त इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया शुरू करें। धीरे से पाइप िंग करके प्रतिक्रिया की मात्रा मिलाएं।
  11. थर्मोसाइकलर या हीट ब्लॉक में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब ों को इनक्यूबेट करें।
  12. थर्मोसाइकलर या हीट ब्लॉक से प्रतिक्रियाओं को हटा दें और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए समान प्रतिक्रिया मात्रा में 50% फॉर्मामाइड युक्त 2एक्स आरएनए लोडिंग डाई जोड़ें।
  13. थर्मोसाइकलर या हीट ब्लॉक में 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इंजेक्ट करके एंजाइमों को निष्क्रिय करें।
  14. 30-45 मिनट के लिए 180 वी पर 10% -15% टीबीई यूरिया पॉलीक्रिलामाइड जैल का उपयोग करके जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया मिश्रण में आरएनए को अलग करें।
    नोट: जेल वैद्युतकणसंचलन स्थितियों के आधार पर, बफर समाधान रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड से दूषित हो सकता है या जेल में अधिकांश या सभी रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड हो सकते हैं। उचित रेडियोधर्मिता भंडारण या निपटान के लिए योजना बनाएं।
  15. अनिगमित रेडियोलेबल एटीपी वाले जेल के किसी भी हिस्से को हटाने के बाद फॉस्फोस्क्रीन का उपयोग करके रेडियोलेबल आरएनए की छवि बनाएं। जेल को रात भर (16 घंटे) फॉस्फोस्क्रीन पर उजागर करें और फॉस्फोस्क्रीन इमेजर (100 μm रिज़ॉल्यूशन, 700 V PMT ट्यूब वोल्टेज) का उपयोग करके छवि बनाएं।
  16. डेंसिटोमेट्री विधियों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें24.

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Representative Results

एक इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में जिसमें प्रतिक्रिया का सीमित चरण सिग्मा कारक-मध्यस्थता प्रतिलेखन दीक्षा है, प्रतिलेखन गतिविधि को सिग्मा कारक की मात्रा के साथ रैखिक रूप से बढ़ना चाहिए। हम आरएनए उत्पादों में रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड निगमन से परिणामी अलग-अलग संकेत का निरीक्षण करने के लिए आरएनए पोलीमरेज़ की दो सांद्रता के साथ आरपीओडी सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करने वाले इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रयोगों की तैयारी प्रस्तुत करते हैं। आरएनए पोलीमरेज़, आरपीओडी और डबल-फंसे डीएनए टेम्पलेट स्टॉक की तैयारी के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं। प्रतिनिधि इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाएं विश्लेषण के लिए स्वीकार्य आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि स्तरों के एक उदाहरण के रूप में काम करती हैं।

आरएनए पोलीमरेज़ के शुद्धिकरण के लिए, बी बर्गडॉर्फरी आरपीओसी-एचआईएस 10 एक्स की 4 एल संस्कृति को माइक्रोएरोफिलिक स्थितियों (5% सीओ 2, 3% ओ2) के तहत 34 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्पाइरोकेट घनत्व के लिए संस्कृतियों की बारीकी से निगरानी की गई और 4 x 107 स्पाइरोकेट्स / एमएल से अधिक घनत्व तक पहुंचने से पहले एकत्र किया गया। कोशिकाओं को लाइसिस के लिए बी-पीईआर मिश्रण में पुन: निलंबित कर दिया गया था (तालिका 1)। सेल गोली को पाइपिंग द्वारा समरूप किया गया था, इसके बाद आरटी में 5 मिनट इनक्यूबेशन किया गया था, और बाद में तीन प्रतियों में 3 सेकंड के लिए सोनिकेशन के दौर किए गए थे। स्पष्ट लाइसेट को कोबाल्ट कॉलम लोडिंग बफर और 5 एमएल कोबाल्ट राल के साथ 180 एमएल की कुल मात्रा में पतला किया गया था। आरपीओसी-एचआईएस 10 एक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण को पौष्टिक करके कोबाल्ट राल से बांधने की अनुमति दी गई थी। मिश्रण को एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में स्थानांतरित किया गया था और 40 एमएल कॉलम वॉश बफर के साथ पांच बार धोया गया था। बाध्य प्रोटीन को कॉलम के माध्यम से 5 एमएल क्षालन बफर को पारित करके जारी किया गया था, और क्षालन को सात बार दोहराया गया था। प्रवाह-थ्रू, वॉश और क्षालन अंशों के नमूने एसडीएस-पेज द्वारा अलग किए गए थे और दाग निगमन द्वारा चित्रित किए गए थे (चित्रा 1)। आरएनए पोलीमरेज़ कोर कॉम्प्लेक्स आरपीओसी, आरपीओबी और आरपीओए से बना है, जिसका आकार क्रमशः 154 केडीए, 129 केडीए और 38.5 केडीए है। चित्रा 1 में प्रदर्शित प्रतिनिधि परिणाम आरएनए पोलीमरेज़ कॉम्प्लेक्स की रचना करने वाले तीन पेप्टाइड्स के आकार में तीन प्रमुख बैंड दिखाता है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी से प्रवाह में 1.0 और 1.7 के बीच 260/280 अनुपात के साथ 0.5-1 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन होता है, जो न्यूक्लिक एसिड की उच्च सांद्रता को दर्शाता है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित प्रोटीन मिश्रण की एकाग्रता के बाद आरएनए पोलीमरेज़ प्रोटीन उपज 0.3 मिलीग्राम /

आरपीओडी प्रोटीन स्टॉक तैयार करने के लिए, सी-टर्मिनल माल्टोज़ बाइंडिंग प्रोटीन टैग के साथ पुनः संयोजक आरपीओडी को बीएल 21 (डीई 3) पीएलआईएस ई कोलाई में पीएमएएल-सी 5 एक्स प्लास्मिड से व्यक्त किया गया था। ई कोलाई के 2 एल को 32 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 के ओडी 600एनएम तक उगाया गया था। संस्कृति को तब 1 घंटे के लिए आरपीओडी की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 0.3 एमएम आईपीटीजी के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पेलेट किया गया था और बी-पीईआर में लाइज्ड किया गया था। परिणामस्वरूप 200 एमएल पतला सेल लाइसेट को 10 एमएल एमाइलोज राल के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। अवशिष्ट डीएनए और पेप्टाइड्स को हटाने के लिए राल को आठ बार 40 एमएल बाइंडिंग बफर के साथ धोया गया था। एमबीपी-टैग किए गए आरपीओडी को राल कॉलम में पांच बार 5 एमएल क्षालन बफर के साथ जोड़ा गया था। बाइंडिंग और वॉशिंग स्टेप्स और क्षालन अंशों से प्रवाह का विश्लेषण एसडीएस-पेज (चित्रा 2 ए) द्वारा किया गया था। क्षालन अंश में प्रमुख घटक ~ 115 केडीए का एक पेप्टाइड है, जो एमबीपी-टैग किए गए पुनः संयोजक बी बर्गडॉर्फरी आरपीओडी के आकार से मेल खाता है। क्षालन अंशों को जोड़ा गया, सीएसीएल 2 एकाग्रता को2 एमएम में समायोजित किया गया, और 40 मिलीग्राम शुद्ध प्रोटीन में फैक्टरएक्सा प्रोटीज के 100 μg को जोड़ा गया। कमरे के तापमान पर रात भर के पाचन के बाद, प्रतिक्रिया का विश्लेषण एसडीएस-पेज (चित्रा 2 बी) द्वारा किया गया था। फैक्टर एक्सए प्रोटीज के साथ दरार के बाद, मिश्रण में दो प्रमुख उत्पाद आरपीओडी (73.6 केडीए) और एमबीपी (45 केडीए) थे। आरपीओडी और एमबीपी प्रोटीन के मिश्रण को हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अलग किया गया था। मिश्रण को हेपरिन-बाइंडिंग बफर में 1: 10 के अनुपात में पतला किया गया था और एफपीएलसी में हेपरिन-बाध्य राल कॉलम में लोड किया गया था। आरपीओडी को एनएसीएल की बढ़ती ढाल के साथ 1 मीटर की एकाग्रता के साथ जोड़ा गया था। जब एसडीएस-पेज द्वारा अंशों का विश्लेषण किया गया, तो 73.6 केडीए आकार का एक प्रमुख बैंड 400-600 एमएम एनएसीएल (चित्रा 2 सी) की सीमा में क्षालन अंश में स्पष्ट था। कुछ अवक्रमित आरपीओडी टुकड़ों को सह-शुद्ध किया गया था। आरपीओडी युक्त अंशों को जोड़ा गया, बफर को आरपीओडी स्टोरेज बफर में आदान-प्रदान किया गया, और फिर 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके केंद्रित किया गया। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित अंतिम आरपीओडी एकाग्रता 0.67 मिलीग्राम / एमएल (9.1 एमएम) थी।

पीसीआर द्वारा बी बर्गडॉर्फरी एफएलजीबी की प्रमोटर साइट को शामिल करते हुए एक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न किया गया था। एफएलजीबी प्रमोटर को प्राइमरों द्वारा प्रवर्धित किया गया था जो प्रमोटर (तालिका 6) के 250 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम से मेल खाते थे, जिसमें 200 μL प्रतिक्रिया का उपयोग किया गया था जिसमें 30 एनजी बी बर्गडोर्फरी डीएनए24,30 था। पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण 1% एगारोस जेल (चित्रा 3) में जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था। पीसीआर उत्पाद स्पष्ट समरूपता के साथ आकार में लगभग 500 बीपी था। महत्वपूर्ण रूप से, लवण और सेल घटक संदूषण इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया परिणामों की परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं; हम यह सुनिश्चित करते हैं कि डीएनए टेम्पलेट पीसीआर शुद्धिकरण कॉलम पर अच्छी तरह से डीसाल्ट किया गया है।

एक प्रयोगात्मक योजना जिसमें टेम्पलेट डीएनए के अतिरिक्त प्रतिलेखन शुरू किया जाता है, प्रमोटर मान्यता और प्रतिलेखन दीक्षा की दर का परीक्षण कर सकता है। हमारे प्रतिनिधि प्रयोगों में, आरपीओडी प्रोटीन की एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला 16 एनएम -1 μM से पानी में दो गुना कमजोर पड़ने से तैयार की गई थी। एक मास्टर मिश्रण बनाया गया था जिसमें आरएनए पोलीमरेज़ एक प्रतिक्रिया बफर में गतिविधि के लिए आवश्यक द्विसंयोजक पिंजरों से युक्त था (तालिका 4 और तालिका 5)। आरपीओडी और मास्टर मिक्स को बर्फ पर एक साथ उद्धृत किया गया था। आरएनए पोलीमरेज़ और आरपीओडी युक्त मास्टर मिक्स को इनक्यूबेट करने की अनुमति दी गई थी, जबकि इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के अन्य चरण तैयार किए गए थे। हमने तीन नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को शामिल किया: मास्टर मिक्स से अलग तैयार एक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया, एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया जिसमें कोई टेम्पलेट डीएनए नहीं था यह सुनिश्चित करने के लिए कि इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन सिग्नल टेम्पलेट निर्भर था, और आरएनए पोलीमरेज़ के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिग्नल आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर था। रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स को 10x NTP स्टॉक मिश्रण के 5 μL (α-32P-ATP) से 20 μL को मिलाकर प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था ताकि अप्राप्य मात्रा की भरपाई के लिए 20 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त एलिकोट बनाया जा सके। अंत में, एफएलजीबी प्रमोटर को एन्कोडिंग करने वाले टेम्प्लेट डीएनए को पहले से नियोजित पाइपिंग ऑर्डर (चित्रा 4) का पालन करके पाइपिंग द्वारा प्रतिक्रिया ट्यूबों में पेश किया गया था।

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा उत्पन्न आरएनए टुकड़ों से संकेत का पता फॉस्फोर स्क्रीन द्वारा टीबीई-यूरिया जेल के 16 घंटे की एक्सपोजर अवधि के बाद लगाया गया था, जिसमें जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग आरएनए होता है। 500 एनएम से 16 एनएम रेंज में आरएनए पोलीमरेज़ और आरपीओडी के 50 एनएम युक्त एक प्रयोग ने 250 बीपी के आरएनए उत्पादों को उत्पन्न किया (चित्रा 5)। आरपीओडी एकाग्रता के प्रत्येक दोहरे कमजोर पड़ने के लिए, संचित आरएनए उत्पाद का निम्न स्तर था। निचले बीपी उत्पादों की एक श्रृंखला थी जो प्रमुख बैंड के नीचे दिखाई दी, जो प्रतिलेखन ठहराव या खंडित डीएनए टेम्पलेट के कारण अपूर्ण आरएनए टुकड़े का संकेत देती है। आरएनए उत्पाद नो टेम्प्लेट नियंत्रण से अनुपस्थित थे, यह दर्शाता है कि इस परख में संकेत में योगदान देने वाले कोई बहिर्जात डीएनए टुकड़े नहीं थे। नो आरएनए पोलीमरेज़ कंट्रोल में कोई संकेत नहीं पाया गया था, यह दर्शाता है कि बी बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ इस परख में आरएनए के उत्पादन में योगदान देने वाला एकमात्र पोलीमरेज़ था।

एक दूसरे प्रयोग में, हमने 25 एनएम आरएनए पोलीमरेज़ (चित्रा 6) की कम सांद्रता का उपयोग किया। चित्रा 5 की तुलना में परीक्षण किए गए आरपीओडी सांद्रता की सीमा में कम आरएनए उत्पादों का पता लगाया गया था, और पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता अधिक थी। यह डेंसिटोमेट्री द्वारा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए समस्याग्रस्त है। जब फॉस्फोर छवि का विश्लेषण डेंसिटोमेट्री (चित्रा 7) द्वारा किया गया था, तो फॉस्फोस्क्रीन से प्राप्त डेंसिटोमेट्री सिग्नल ने दोनों प्रयोगों में प्रतिक्रिया में मौजूद आरपीओडी की मात्रा के बीच एक रैखिक संबंध का संकेत दिया। हालांकि, उच्च पृष्ठभूमि संकेत के साथ प्रयोग में, 25 एनएम आरएनए पोलीमरेज़ और आरपीओडी के 100 एनएम से कम वाली प्रतिक्रिया सापेक्ष प्रतिलेखन स्तर की तुलना के लिए अविश्वसनीय थी।

Figure 1
बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ का पृथक्करण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया। सेल लाइसेट (लेन 1), फर्स्ट वॉश फ्रैक्शन (लेन 2), लास्ट वॉश फ्रैक्शन (लेन 3), और पांच क्षालन अंशों (लेन 4-8) के फ्लो-थ्रू अंश को 2एक्स सैंपल लोडिंग बफर में पतला किया गया, उबाला गया, और एसडीएस-पेज द्वारा 30 मिनट के लिए 200 वी पर ग्रेडिएंट पॉलीक्रिलामाइड जेल में अलग किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा आरपीओडी शुद्धिकरण का विश्लेषण। (ए) एमाइलोज राल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा एमबीपी-टैग किए गए आरपीओडी के शुद्धिकरण से पूल किए गए प्रवाह-माध्यम अंश (लेन 1 और लेन 2), वॉश अंश (लेन 3-5), और क्षालन अंश (लेन 6-10)। (बी) फैक्टर एक्सए प्रोटीज का उपयोग करके एमबीपी और आरपीओडी के दरार के बाद प्रोटीन मिश्रण। (सी) हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी से अलग एमबीपी और आरपीओडी के लिए एनएसीएल (लेन 2-9) की बढ़ती ढाल के साथ फ्लोथ्रू समाधान (लेन 1) और क्षालन अंश। प्रस्तुत प्रत्येक जेल में, नमूने को 2x लोडिंग बफर के साथ मिलाया गया, उबला हुआ, और 30 मिनट के लिए 200 V पर SDS-PAGE का उपयोग करके एक ढाल पॉलीक्रिलामाइड जेल में अलग किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन टेम्प्लेट की पीसीआर पीढ़ी। 500 बीपी आकार के एम्प्लिकॉन जिसमें एफएलजीबी प्रमोटर (लेन 1 और लेन 2) होता है और अन्य प्रमोटर साइटों (लेन 3-4) के एम्प्लिकॉन युक्त नियंत्रण पीसीआर प्रतिक्रियाएं दिखाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रयोगात्मक व्यवस्था और पाइपिंग अनुक्रम योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बी बर्गडॉर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा उत्पन्न आरएनए से फॉस्फोर छवि संकेत में आरपीओडी-निर्भर परिवर्तनशीलता। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में 50 एनएम आरएनए पोलीमरेज़ और आरपीओडी के अलग-अलग स्तर शामिल थे जो बैंड24 के ऊपर इंगित किए गए थे। आरएनए को 10% टीबीई-यूरिया जेल द्वारा अलग किया गया था, और 16 घंटे में रेडियोधर्मी क्षय से संकेत को पकड़ने के लिए एक फॉस्फोर स्क्रीन का उपयोग किया गया था। इस आंकड़े को बॉयल एट अल से संशोधित किया गया है।24. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा उत्पन्न आरएनए से फॉस्फोर छवि संकेत में आरपीओडी-निर्भर परिवर्तनशीलता। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में आरएनए पोलीमरेज़ के 25 एनएम और बैंड के ऊपर इंगित आरपीओडी के अलग-अलग स्तर शामिल थे। आरएनए को 15% टीबीई-यूरिया जेल द्वारा अलग किया गया था, और 16 घंटे में रेडियोधर्मी क्षय से संकेत को पकड़ने के लिए एक फॉस्फोर स्क्रीन का उपयोग किया गया था। कम आरएनए पोलीमरेज़ एकाग्रता और उच्च पृष्ठभूमि संकेत ने सटीक माप की कठिनाई को बढ़ा दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: आरपीओडी स्तर में वृद्धि के साथ इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं में रेडियोलेबल आरएनए संचय में वृद्धि। फॉस्फोर स्क्रीन इमेजिंग में पाए गए संकेतों का विश्लेषण डेंसिटोमेट्री द्वारा बिना किसी पृष्ठभूमि घटाव के किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मीडिया व्यंजनों. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एफपीएलसी सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: पीसीआर प्रतिक्रियाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4: 50 एनएम आरएनए पोलीमरेज़ प्रयोगात्मक योजना और मात्रा गणना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 5: 25 एनएम आरएनए पोलीमरेज़ प्रयोगात्मक योजना और मात्रा गणना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 6: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपभेदों और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्मित इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख का उपयोग हाल ही में बी बर्गडॉर्फरी में प्रतिलेखन कारक की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया गया था और इसे अन्य प्रतिलेखन कारकों, सिग्मा कारकों और अणुओं23 का उपयोग करके इसी तरह के प्रयोगों का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है। एक बार जब बी बर्गडॉर्फरी से सक्रिय आरएनए पोलीमरेज़ प्राप्त किया जाता है और इसकी गतिविधि का पता लगाया जाता है, तो इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख के भीतर घटकों और स्थितियों को संशोधित किया जा सकता है। परख अत्यधिक लचीला और परिवर्तनीय है। प्रतिक्रियाएं मॉड्यूलर होती हैं और जमे हुए स्टॉक से निर्मित होती हैं और प्रयोगात्मक मापदंडों को चुने जाने के बाद बहुत कम लीड समय की आवश्यकता होती है। पर्याप्त स्टॉक को देखते हुए, 1 दिन में कई प्रयोग किए जा सकते हैं।

सक्रिय आरएनए पोलीमरेज़ प्राप्त करना इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया तैयारी का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है। हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित मध्य-लघुगणकीय विकास चरण में विकसित कोशिकाओं से आरएनए पोलीमरेज़ की कटाई की सलाह देते हैं। किसी भी बैक्टीरिया से आरएनए पोलीमरेज़ को शुद्ध करने में, सक्रिय आरएनए पोलीमरेज़ को शुद्ध करने में वृद्धि की दर को एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में नोट किया गया है। आरएनए पोलीमरेज़ पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को जमा कर सकते हैंऔर विकास के स्थिर चरण में निरोधात्मक प्रतिलेखन कारकों से जुड़े हो सकते हैं। हम स्थिर चरण में विकसित बी बर्गडॉर्फरी संस्कृतियों से सक्रिय आरएनए पोलीमरेज़ की उच्च मात्रा को शुद्ध करने में सफल नहीं हुए हैं। भौतिक पृथक्करण दृष्टिकोण32 की तुलना में आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण, बी बर्गडॉर्फेरी से शुद्धिकरण के लिए भी फायदेमंद है क्योंकि जीव संस्कृति में कम घनत्व तक पहुंचता है, और बड़ी मात्रा में सेल संस्कृति जमा करना अपेक्षाकृत सामग्री गहन है।

अन्य बैक्टीरियल आरएनए पोलीमरेज़ के शुद्धिकरण के दौरान, सिग्मा कारक शुद्धिकरण विधि और स्थितियों33,34,35,36 के आधार पर महत्वपूर्ण मात्रा में सह-शुद्ध कर सकते हैं। सिग्मा कारकों का सह-शुद्धिकरण वैकल्पिक सिग्मा कारकों, संशोधित सिग्मा कारकों या सिग्मा कारकों की कमी का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम प्रयोगों को सीमित कर सकता है। इसके अलावा, हाउसकीपिंग सिग्मा फैक्टर आरपीओडी के साथ पूरक सिग्मा कारक37 के प्रारंभिक सह-शुद्धिकरण की परवाह किए बिना गतिविधि का पता लगाने के लिए फायदेमंद है। आरएनए पोलीमरेज़ कोर से सिग्मा कारक को अलग करने के लचीलेपन के कारण, हम इसे लाभप्रद मानते हैं कि सिग्मा कारक यहां उल्लिखित हिस-एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण स्थितियों के तहत सह-शुद्ध नहीं होते हैं। यह संभव है कि आरपीओडी युक्त अधिक बरकरार और सक्रिय होलोएंजाइम उत्पन्न करने के लिए शुद्धिकरण की स्थिति को बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, नमक सांद्रता कई सबयूनिट एंजाइमों की स्थिरता को प्रभावित करने की संभावना है, और बी बर्गडोर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ कॉम्प्लेक्स की स्थिरता या इसके द्विसंयोजक केशन निगमन पर इमिडाज़ोल एकाग्रता का प्रभाव भी अज्ञात है।

बी. बर्गडॉर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइमेटिकगतिविधि मौजूद द्विसंयोजक पिंजरों के प्रकार और मात्रा के प्रति संवेदनशील है। हमने पाया कि अधिकतम आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि के लिए मैंगनीज की आवश्यकता होती है, और मैग्नीशियम कुछ हद तक गतिविधि में योगदान देता दिखाई देता है। पानी में दूषित आयन आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइमेटिक गतिविधि में उच्च मात्रा में परिवर्तनशीलता जोड़ते हैं। नतीजतन, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड, एचपीएलसी ग्रेड, और धातु विश्लेषण ग्रेडएच 2ओ जैसे अत्यधिक शुद्ध पानी में कुछ धातु आयन मौजूद हैं, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में उच्च आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि के लिए आवश्यक है। आरएनए पोलीमरेज़ पीएच के प्रति भी संवेदनशील होते हैं और शुद्धिकरण के दौरान कम करने वाले वातावरण की आवश्यकता होतीहै। परिवर्तित पीएच या कम करने वाले एजेंट के रूप में बीएमई के उपयोग के परिणामस्वरूप निष्क्रिय आरएनए पोलीमरेज़ हुआ है। हम इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख24 के उचित निर्माण को सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ई कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करने की सलाह देते हैं। ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ न्यूक्लियोटाइड की व्यवहार्यता, टेम्पलेट निर्माण विधि, रेडियोलेबल निगमन, आरएनए पृथक्करण और सिग्नल डिटेक्शन विधि के परीक्षण की अनुमति देगा। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बी बर्गडॉर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ में ई कोलाई की तुलना में विशिष्ट द्विसंयोजक केशन, बफर और प्रमोटर आवश्यकताएं हैं।

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं के लिए कई पहचान विधियां उपलब्ध हैं। डाई निगमन और आणविक बीकन परख रेडियोलेबल पहचान विधि38,39 के सामान्य विकल्प हैं। रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड निगमन वर्तमान में सबसे संवेदनशील आरएनए पहचान विधि है। रेडियोलेबल परख की तुलना में मापने योग्य संकेत स्तर तक पहुंचने के लिए वैकल्पिक परख को अधिक आरएनए पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, डाई निगमन और आणविक बीकन विधियों में आमतौर पर संकेतों के गलत होने के अधिक तरीके होते हैं। उदाहरण के लिए, DNase संदूषण आणविक बीकन को उनके लक्ष्य की अनुपस्थिति में एक संकेत जारी करने का कारण बन सकता है। रेडियोलेबल निगमन का उपयोग करके, बी बर्गडॉर्फेरी आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की सापेक्ष गतिविधि को निम्न स्तर पर भी पता लगाया जा सकता है, जो आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइमों के साथ प्रारंभिक प्रयोग के अनुरूप है।

जबकि प्रतिक्रिया में शामिल बी बर्गडॉर्फरी आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की एकाग्रता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मानकीकृत है, यह माप परिवर्तनशीलता का स्रोत हो सकता है। आरएनए पोलीमरेज़ की विशिष्ट गतिविधि पूरी तरह से गठित सक्रिय होलोएंजाइम की संख्या पर निर्भर कर सकती है, जो कुल प्रोटीन मिश्रण40 का एक हिस्सा है। उदाहरण के लिए, हमारे परिणामों में रिपोर्ट किए गए आरएनए पोलीमरेज़ के 50 एनएम की दाढ़ मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित की गई थी, लेकिन मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता द्वारा सबयूनिट मात्रा के विश्लेषण से पता चला कि आरपीओए सबयूनिट संभावित आरएनए पोलीमरेज़ होलोएंजाइम की संख्या में एक सीमित घटक था, और हमारे मिश्रण में पूरी तरह से गठित आरएनए पोलीमरेज़ का अधिकतम21 एनएम संभव था।. आरएनए पोलीमरेज़ और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के अन्य घटकों में बैच-टू-बैच भिन्नता को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग हमेशा आयोजित किए जाने चाहिए।

चित्रा 5 में दिखाए गए हमारे प्रतिनिधि प्रयोग में, आरपीओडी स्तरों को बदल दिया गया था, और आरपीओडी और पता लगाए गए सिग्नल के बीच एक रैखिक संबंध का प्रदर्शन किया गया था। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन एक बहुमुखी विधि है जिसे प्रस्तुत प्रयोगात्मक टेम्पलेट का उपयोग करके आसानी से बदला जा सकता है (तालिका 4)। उदाहरण के लिए, वैकल्पिक सिग्मा कारक या वैकल्पिक डीएनए टेम्प्लेट का आसानी से परीक्षण किया जा सकताहै। वैकल्पिक टेम्प्लेट में पीसीआर या प्लास्मिड द्वारा उत्पन्न विभिन्न प्रमोटर क्षेत्रों को शामिल किया जा सकता है जो सुपरकॉइलऔर मिथाइलेटेड डीएनए सुविधाओं को पेश करने के लिए कोशिकाओं से शुद्ध होते हैं। आरपीओडी, आरएनए पोलीमरेज़ और टेम्प्लेट के दिए गए स्तर के लिए, प्रमोटर23 से गतिविधि के अवरोध या वृद्धि को देखने के लिए प्रतिलेखन कारक के विभिन्न स्तरों को जोड़ा जा सकता है। इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के भीतर घटक जोड़ और दाढ़ अनुपात के क्रम को इस तरह से बदला जा सकता है कि प्रतिक्रिया दीक्षा से पहले प्रतिलेखन दीक्षा परिसर बनते हैं; ये प्रतिक्रियाएं प्रतिलेखन दीक्षा40 के बजाय प्रतिलेखन बढ़ाव को माप सकती हैं। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन परख को बी बर्गडॉर्फरी जीव विज्ञान में विभिन्न प्रकार की जांच के अनुरूप बदला जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को क्रेटन विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान रणनीतिक निवेश कोष संकाय विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। मोंटाना विश्वविद्यालय के डॉ डी स्कॉट सैमुअल्स द्वारा बी बर्गडॉर्फरी आरपीओसी-हिस 10 एक्स स्ट्रेन प्रदान किया गया था। माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन-टैग किए गए आरपीओडी एलील को एन्कोडिंग करने वाले पीएमएएल-सी 5 एक्स प्लास्मिड को आश्रय देने वाले ई कोलाई स्ट्रेन को रॉकी माउंटेन लेबोरेटरीज, एनआईएआईडी, एनआईएच के डॉ फ्रैंक घेरर्डिनी द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

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References

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Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

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