Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Composants essentiels des tests de transcription in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

Les tests de transcription in vitro peuvent déchiffrer les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Borreliella burgdorferi. Ce protocole décrit les étapes pour purifier l’ARN polymérase de B. burgdorferi et effectuer des réactions de transcription in vitro. Les approches expérimentales utilisant des tests de transcription in vitro nécessitent une purification et un stockage fiables de l’ARN polymérase active.

Abstract

Borreliella burgdorferi est un pathogène bactérien avec des répertoires métaboliques et génomiques limités. B. burgdorferi transite extracellulaire entre les vertébrés et les tiques et remodèle radicalement son profil transcriptionnel pour survivre dans des environnements disparates pendant l’infection. L’un des objectifs des études sur B. burgdorferi est de comprendre clairement comment la bactérie réagit à son environnement par des changements transcriptionnels. Les essais de transcription in vitro permettent de disséquer biochimiquement les mécanismes de base de la régulation transcriptionnelle. Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant la purification et le stockage de l’ARN polymérase de B. burgdorferi , la purification du facteur sigma, la génération de modèles d’ADN et les tests de transcription in vitro . Le protocole décrit l’utilisation de l’ARN polymérase purifiée à partir de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC est une souche précédemment publiée hébergeant un marqueur 10XHis sur le gène rpoC codant pour la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase. Les tests de transcription in vitro consistent en l’ARN polymérase purifiée à partir de la souche 5A4-RpoC, une version recombinante du facteur sigma d’entretien RpoD et un modèle d’ADN double brin généré par PCR. Bien que les techniques de purification des protéines et les approches d’assemblage des tests de transcription in vitro soient conceptuellement bien comprises et relativement courantes, les considérations de manipulation des ARN polymérases diffèrent souvent d’un organisme à l’autre. Le protocole présenté ici est conçu pour des études enzymatiques sur l’ARN polymérase de B. burgdorferi. La méthode peut être adaptée pour tester le rôle des facteurs de transcription, des promoteurs et des modifications post-traductionnelles sur l’activité de l’ARN polymérase.

Introduction

La maladie de Lyme et la fièvre récurrente sont causées par des spirochètes pathogènes des genres Borrelia et Borreliella 1,2,3. La maladie de Lyme est une maladie à transmission vectorielle importante en Amérique du Nord et, par conséquent, Borreliella burgdorferi est un organisme modèle important pour étudier la biologie des spirochètes 4,5. Les recherches sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle de B. burgdorferi visent à mieux comprendre ses adaptations aux changements de l’environnement lorsqu’il circule entre son vecteur tique et ses hôtes mammifères 6,7. Les changements de pH, de température, d’osmolarité, de disponibilité des nutriments, d’acides gras à chaîne courte, d’acides organiques et d’oxygène dissous et de dioxyde de carbone modulent l’expression de gènes importants pour la survie de B. burgdorferi dans son vecteur arthropode et pour infecter les animaux 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Relier ces réponses à des stimuli avec des mécanismes de régulation a été un aspect important de la recherche sur B. burgdorferi 19.

Les facteurs de transcription et les facteurs sigma contrôlent la transcription des gènes qui effectuent des processus cellulaires. Les spirochètes de la maladie de Lyme et de la fièvre récurrente abritent un ensemble relativement clairsemé de facteurs de transcription et de facteurs sigma alternatifs. Malgré cela, il existe des changements transcriptionnels complexes qui dirigent les réponses de B. burgdorferi à l’environnement20,21,22. Les mécanismes spécifiques à l’origine des changements transcriptionnels chez B. burgdorferi en réponse aux changements environnementaux restent incertains. Les tests de transcription in vitro sont des outils puissants pour utiliser une approche biochimique pour tester la fonction et les mécanismes de régulation des facteurs de transcription et des facteurs sigma23,24,25,26.

Un système de dosage de transcription in vitro utilisant l’ARN polymérase de B. burgdorferi a récemment été mis en place24. Comme les bactéries ont souvent une physiologie cellulaire unique, les ARN polymérases de différentes espèces et genres réagissent différemment à la purification enzymatique, au stockage enzymatique et aux conditions tampons de réaction27. B. burgdorferi est également génétiquement éloigné des nombreuses espèces bactériennes chez lesquelles les ARN polymérases ont été étudiées20. Des aspects de la préparation enzymatique tels que les conditions tampons de lyse, de lavage et d’élution, le tampon de stockage, le tampon de réaction de transcription in vitro et la méthode de construction du test peuvent tous modifier l’activité de l’ARN polymérase. Ici, nous fournissons un protocole pour la purification de l’ARN polymérase et du facteur sigma RpoD, la production d’un modèle d’ADN double brin linéaire et la construction de tests de transcription in vitro pour faciliter la reproductibilité entre les laboratoires utilisant ce système. Nous détaillons un exemple de réaction pour démontrer la plage linéaire pour la transcription dépendante de RpoD et discutons des limites et des alternatives à cette approche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Purification de l’ARN polymérase et préparation du stock d’ARN polymérase

  1. Prélever la pastille cellulaire de 2 à 4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivé dans un milieu BSKII dans un environnement microaérophile (34 °C, 5 % CO 2, 3 %O2) jusqu’à une densité de2 à 4 x 107 cellules/ml en utilisant les protocoles de collecte cellulairedécrits précédemment 28,29. Effectuer une centrifugation à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min dans des flacons centrifuges de 500 ml et verser le surnageant.
  2. Resuspendre les cellules dans 30 mL de tampon HN glacé (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Répétez l’étape de centrifugation décrite ci-dessus à l’aide d’un tube à centrifuger de 50 ml et décanter le surnageant.
    NOTE: Point d’arrêt. Congeler la pastille cellulaire à -80 °C pour stocker les cellules jusqu’à 2 semaines ou procéder immédiatement à la lyse cellulaire.
  3. Maintenir les cellules, le lysat et les protéines purifiées à 4 °C ou sur de la glace à moins de congélation. Conserver l’ARN polymérase dans un environnement réducteur en ajoutant du DTT fraîchement préparé à une concentration de 2 mM à chaque tampon utilisé dans ce protocole et maintenir un pH de 8,0.
  4. Préparer le lysat à partir de la pastille de cellules de B. burgdorferi à l’aide d’une trousse de lyse bactérienne commerciale en suivant les instructions de la trousse. Remettez la pastille en suspension dans 10-15 mL de solution de B-PER à température ambiante (RT) sans inhibiteur de protéase et laissez la lyse se dérouler pendant 5 minutes sur glace. Le volume de lyse dépend de la taille de la pastille de cellule, comme décrit dans les instructions du kit.
  5. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase à la solution de lyse, suivi de trois cycles de sonication, comme décrit dans la section des résultats représentatifs.
    NOTE: Alternativement, lyser les cellules dans une cellule de pression française comme décrit précédemment24. Ignorez l’étape 1.4. et l’étape 1.5.
  6. Clarifier le lysat cellulaire par centrifugation et filtration à l’aide d’un tube à centrifuger de 50 mL. Remplir le volume du tube à au moins 30 mL de volume total en ajoutant un tampon de chargement de colonne de cobalt (tableau 1) à la solution. Enduire les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 30 min.
  7. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.
  8. Diluer le lysat dans un tampon de chargement de colonne de cobalt (tableau 1) en utilisant un taux de dilution final de 1:10.
  9. Effectuer une chromatographie d’affinité sur le surnageant de lysat cellulaire clarifié à l’aide d’une colonne de cobalt ou de résine de nickel en suivant les instructions du fabricant. Voir la section des résultats représentatifs pour un exemple. Utilisez les tampons répertoriés dans le tableau 1. Prélever les échantillons d’écoulement, de lavage et d’élution pour analyse.
  10. Remplacer immédiatement l’ARN polymérase contenue dans la solution tampon d’élution dans une solution tampon de stockage de l’ARN polymérase (tableau 1) à l’aide d’une colonne d’échange tampon en suivant les instructions du fabricant.
  11. Préparer les stocks de congélation en concentrant l’ARN polymérase à l’aide d’unités filtrantes centrifuges à coupure de 10 kDa à une concentration de 0,2-0,4 mg/mL déterminée par spectrophotométrie (A280 nm sans ajustement du coefficient d’extinction [1 abs à 1 cm = 1 mg·mL−1]).
  12. L’ARN polymérase aliquote stocke des stocks dans des volumes de 20 à 50 μL dans des tubes de PCR et stocke l’ARN polymérase à -80 °C.
  13. Déterminer la qualité de la chromatographie d’affinité par SDS-PAGE et mesurer le rendement total en protéines par spectrophotométrie ou dosage BCA. Faites passer les échantillons sur un gel de polyacrylamide à 7,5% à 120 V pendant 50 min pour une bonne résolution par SDS-PAGE.

2. Purification du RpoD recombinant et préparation du stock de RpoD

  1. Cultiver et induire l’expression de B. burgdorferi RpoD recombinant marqué à la protéine de liaison au maltose (MBP-RpoD) dans BL21::MBP-RpoDBb, tel que décrit dans le manuel d’instructions du système de fusion et de purification des protéines répertorié dans le tableau des matériaux, et collecter les cellules par centrifugation.
    NOTE: Point d’arrêt. Congeler les pastilles cellulaires à -80 °C pour stocker les cellules jusqu’à 2 semaines ou procéder immédiatement à la lyse cellulaire.
  2. Effectuer la lyse à l’aide d’un kit de lyse cellulaire bactérienne commercial ou d’une cellule de pression française. Voir l’exemple de tampon de lyse dans le tableau 1.
  3. Clarifier le lysat cellulaire en utilisant la centrifugation et la filtration. Enduire les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 30 min. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
  4. Extraire MBP-RpoD à l’aide d’un protocole d’extraction de protéines pour le système d’expression. Voir la section des résultats représentatifs pour obtenir des exemples de détails et de résultats de la mise en œuvre.
  5. Déterminer la qualité du processus de chromatographie d’affinité et d’élution par SDS-PAGE et mesurer le rendement en protéines par spectrophotométrie (A280nm sans ajustement du coefficient d’extinction [1 abs à 1 cm = 1 mg·mL−1]). Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  6. Concentrer le MBP-RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa à une concentration de >2 mg/mL déterminée par spectrophotométrie.
  7. Clivage du MBP de RpoD au site de clivage du facteur Xa. Ajouter CaCl 2 aux fractions d’élution de chromatographie d’affinité contenant du MBP-RpoD à une concentration de2 mM. Ajouter 200 μg de facteur Xa protéase pour chaque 30 mg de protéine purifiée. Incuber pendant la nuit chez RT.
  8. Confirmer le clivage complet du MBP de RpoD par SDS-PAGE. Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  9. Diluer la solution contenant du MBP et du RpoD dans un rapport de 1:10 avec un tampon liant l’héparine.
  10. Séparer MBP et RpoD sur la colonne héparine par FPLC. Voir le Tableau 2 pour les paramètres FPLC.
  11. Déterminer la qualité des produits de chromatographie d’affinité par SDS-PAGE et mesurer le rendement en protéines par spectrophotométrie. Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  12. Concentrer les fractions d’élution contenant du RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa jusqu’à un volume final de 2-3 mL.
  13. Le tampon échange les fractions d’élution concentrées de RpoD vers le tampon de stockage à l’aide d’une colonne de filtration sur gel.
  14. Concentrer le stock de RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa à une concentration de 0,2 à 0,8 mg/mL, déterminée par spectrophotométrie.
  15. Aliquote RpoD stocke à des volumes de 20 à 50 μL dans des tubes de PCR et stocke à −80 °C.

3. Préparation du stock de modèles d’ADN

  1. La PCR amplifie la région de 500 pb entourant un site promoteur piloté par RpoD à partir de l’ADN génomique de B. burgdorferi en utilisant une réaction de 200 μL (tableau 3).
  2. Purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR commercial. Éluer l’ADN en biologie moléculaire gradeH2O.
  3. Ajuster la concentration molaire des matrices d’ADN générées par PCR à 100 nM par dilution dans un grade de biologie moléculaireH2O.

4. Effectuer une transcription in vitro avec incorporation de nucléotides radiomarqués

  1. Préparer un plan expérimental de transcription in vitro . Déterminer les concentrations de l’ARN polymérase, de la RpoD et de la matrice d’ADN. Déterminer les volumes aliquotes et les ordres de pipetage pour les tubes de réaction. Voir le tableau 4 et la figure 1 pour un exemple.
    REMARQUE : Inclure des contrôles dans le plan expérimental, tels que des réactions ne contenant pas d’ARN polymérase, de polymérase alternative, pas de matrice ou d’autres gabarites.
  2. Calculer le volume de α-32P-ATP requis pour l’expérience. Incorporez cela dans le plan expérimental. En règle générale, inclure 2 μCi d’activité par réaction de transcription in vitro pour la détection par écran phosphoreux.
  3. Préparer les surfaces de travail, y compris le banc de radiation, afin de réduire le risque de contamination par les radiations.
  4. Décongeler des aliquotes fraîches d’ARN polymérase, de Rpo, de NTP tampon 5x et de solutions mères matricielles sur de la glace. Bien mélanger tous les bouillons congelés décongelés avant de les pipeter.
  5. Préparer un mélange réactionnel principal et un mélange NTP séparé pour les nucléotides radiomarqués conformément au plan expérimental.
  6. Distribuer les réactions de contrôle et les ensembles expérimentaux dans des tubes de PCR en préparation de l’ajout de radiomarquage dans la réaction. Distribuer délicatement H2O, mélange maître réactionnel, ARN polymérase et RpoD dans des tubes PCR désignés et mélanger par pipetage.
  7. Transférer les matériaux préparés sur un banc de radiation.
  8. Ajouter α-32P-ATP au NTP et mélanger par pipetage doux.
    ATTENTION : Lorsque vous travaillez avec des matières radioactives, utilisez l’équipement de protection et les procédures de manipulation appropriés pour les isotopes radioactifs.
  9. Ajouter du NTP aux tubes contenant les mélanges réactionnels de transcription in vitro de l’étape 4.6.
  10. Commencez la réaction de transcription in vitro avec l’ajout d’un modèle d’ADN. Mélanger le volume de réaction en pipetant doucement.
  11. Incuber les tubes à 37 °C pendant 5 min dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
  12. Retirez les réactions du thermocycleur ou du bloc thermique et ajoutez le colorant de chargement d’ARN 2x contenant 50% de formamide à un volume de réaction égal pour arrêter les réactions de transcription in vitro .
  13. Dénaturer les enzymes en incubant des réactions à 65 °C pendant 5 min dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
  14. Séparer l’ARN dans le mélange réactionnel de transcription in vitro par électrophorèse sur gel en utilisant des gels de polyacrylamide d’urée TBE à 10%-15% à 180 V pendant 30-45 min.
    REMARQUE: Selon les conditions d’électrophorèse sur gel, la solution tampon peut être contaminée par des nucléotides radiomarqués ou le gel peut contenir la plupart ou la totalité des nucléotides radiomarqués. Planifiez le stockage ou l’élimination appropriés de la radioactivité.
  15. Imagez l’ARN radiomarqué à l’aide d’un phosphoscreen après avoir retiré toute partie du gel contenant de l’ATP radiomarqué non incorporé. Exposez le gel au phosphoscreen pendant la nuit (16 h) et imagez à l’aide d’un imageur phosphoscreen (résolution 100 μm, tension du tube PMT de 700 V).
  16. Analyser les données à l’aide de méthodes de densitométrie24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dans une réaction de transcription in vitro dans laquelle l’étape limite de la réaction est l’initiation de la transcription médiée par le facteur sigma, l’activité de transcription devrait augmenter linéairement avec la quantité de facteur sigma. Nous présentons la préparation d’expériences de transcription in vitro testant une gamme de concentrations de RpoD ainsi que deux concentrations d’ARN polymérase pour observer le signal variable résultant de l’incorporation de nucléotides radiomarqués dans les produits d’ARN. Des résultats représentatifs de la préparation de l’ARN polymérase, de la RpoD et des stocks matriciels d’ADN double brin sont présentés. Les réactions représentatives de transcription in vitro servent d’exemple de niveaux d’activité de l’ARN polymérase acceptables pour l’analyse.

Pour la purification de l’ARN polymérase, une culture de 4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X a été cultivée à 34 °C dans des conditions microaérophiles (5% CO 2, 3% O2). Les cultures ont été étroitement surveillées pour la densité des spirochètes à l’aide de la microscopie à fond noir et prélevées avant d’atteindre des densités supérieures à 4 x 107 spirochètes/mL. Les cellules ont été remises en suspension dans le mélange B-PER pour la lyse (tableau 1). La pastille de cellule a été homogénéisée par pipetage, suivie d’une incubation de 5 minutes à RT, et des cycles ultérieurs de sonication effectués pendant 3 s en triplicate. Les lysats clarifiés ont été dilués avec un tampon de chargement de colonne de cobalt et 5 mL de résine de cobalt pour un volume total de 180 mL. On a laissé RpoC-His10X se lier à la résine de cobalt en nutifiant le mélange pendant 1 h à 4 °C. Le mélange a été transféré dans une colonne d’écoulement par gravité et lavé cinq fois avec 40 ml de tampon de lavage de colonne. La protéine liée a été libérée en faisant passer 5 mL de tampon d’élution à travers la colonne, et l’élution a été répétée sept fois. Des échantillons des fractions d’écoulement, de lavage et d’élution ont été séparés par SDS-PAGE et imagés par incorporation de coloration (figure 1). Le complexe central de l’ARN polymérase est composé de RpoC, RpoB et RpoA, dimensionnés respectivement 154 kDa, 129 kDa et 38,5 kDa. Le résultat représentatif affiché à la figure 1 montre trois bandes proéminentes à la taille des trois peptides composant le complexe ARN polymérase. L’écoulement continu de la chromatographie d’affinité contenait 0,5-1 mg/mL de protéines avec un rapport de 260/280 entre 1,0 et 1,7, indiquant une concentration plus élevée d’acides nucléiques. Le rendement de la protéine ARN polymérase après la concentration du mélange de protéines déterminée par spectrophotométrie était de 0,3 mg/mL.

Pour préparer des souches de protéines RpoD, RpoD recombinant avec une étiquette de protéine de liaison au maltose C-terminal a été exprimée à partir d’un plasmide pMAL-C5X dans BL21 (DE3) pLysS E. coli. 2 L d’E. coli ont été cultivés à 32 °C jusqu’à une OD600nm de 0,5. La culture a ensuite été traitée avec 0,3 mM IPTG pour induire l’expression de RpoD pendant 1 h. Les cellules ont été granulées par centrifugation et lysées dans B-PER. Les 200 mL de lysat de cellules diluées qui en ont résulté ont été filtrés à travers 10 mL de résine d’amylose. La résine a été lavée huit fois avec 40 ml de tampon de liaison pour éliminer l’ADN résiduel et les peptides. Le RpoD marqué au MBP a été élué cinq fois avec 5 mL de tampon d’élution dans la colonne de résine. L’écoulement continu des étapes de liaison et de lavage et les fractions d’élution ont été analysés par SDS-PAGE (figure 2A). Le composant principal de la fraction d’élution est un peptide de ~115 kDa, correspondant à la taille du B. burgdorferi RpoD recombinant marqué MBP. Les fractions d’élution ont été combinées, la concentration de CaCl 2 a été ajustée à2 mM et 100 μg de protéase FactorXa ont été ajoutés à 40 mg de protéine purifiée. Après digestion nocturne à température ambiante, la réaction a été analysée par SDS-PAGE (Figure 2B). Après le clivage avec la protéase du facteur Xa, les deux principaux produits du mélange étaient le RpoD (73,6 kDa) et le MBP (45 kDa). Le mélange de protéines RpoD et MBP a été séparé par chromatographie d’affinité à l’héparine. Le mélange a été dilué dans un rapport de 1:10 dans un tampon liant l’héparine et chargé dans une colonne de résine liée à l’héparine dans un FPLC. RpoD a été élué avec un gradient croissant de NaCl à une concentration de 1 M. Lorsque les fractions ont été analysées par SDS-PAGE, une bande majeure de taille de 73,6 kDa était apparente dans la fraction d’élution comprise entre 400 et 600 mM de NaCl (figure 2C). Certains fragments de RpoD dégradés ont été co-purifiés. Les fractions contenant du RpoD ont été combinées, le tampon échangé dans le tampon de stockage RpoD, puis concentré à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa. La concentration finale de RpoD était de 0,67 mg/mL (9,1 mM), déterminée par spectrophotométrie.

Un modèle d’ADN double brin englobant le site promoteur de B. burgdorferi flgB a été généré par PCR. Le promoteur flgB a été amplifié par des amorces correspondant à 250 pb en amont et en aval du promoteur (tableau 6) en utilisant une réaction de 200 μL contenant 30 ng d’ADN de B. burgdorferi 24,30. Le produit de PCR a été analysé par électrophorèse sur gel dans un gel d’agarose à 1 % (figure 3). Le produit de PCR avait une taille d’environ 500 pb avec une homogénéité apparente. Il est important de noter que la contamination par les sels et les composants cellulaires peut contribuer à la variabilité des résultats des réactions de transcription in vitro; nous veillons à ce que le gabarit d’ADN soit soigneusement dessalé sur la colonne de purification PCR.

Un schéma expérimental dans lequel la transcription est initiée par l’ajout d’ADN modèle peut tester le taux de reconnaissance du promoteur et d’initiation de la transcription. Dans nos expériences représentatives, une série de dilutions de la protéine RpoD a été préparée par deux dilutions dans de l’eau allant de 16 nM-1 μM. Un mélange maître contenant de l’ARN polymérase a été créé dans un tampon réactionnel contenant les cations divalents nécessaires à l’activité (tableaux 4 et 5). Le RpoD et le mélange principal ont été aliquotes ensemble sur la glace. Le mélange principal contenant de l’ARN polymérase et du RpoD a été autorisé à incuber pendant que d’autres étapes de la transcription in vitro étaient préparées. Nous avons incorporé trois réactions de contrôle : une réaction de contrôle positive préparée séparément du mélange maître, une réaction de contrôle négative ne contenant pas d’ADN modèle pour s’assurer que le signal de transcription in vitro dépendait du modèle, et une réaction de contrôle négative sans ARN polymérase pour s’assurer que le signal était dépendant de l’ARN polymérase. Des nucléotides radiomarqués ont été ajoutés à la réaction en mélangeant 5 μL de (α-32P-ATP) à 20 μL de mélange de 10x NTP pour créer suffisamment d’aliquotes pour 20 réactions afin de compenser les volumes irrécupérables. Enfin, l’ADN modèle codant pour le promoteur flgB a été introduit dans les tubes de réaction par pipetage suivant l’ordre de pipetage précédemment prévu (Figure 4).

Le signal des fragments d’ARN générés par transcription in vitro a été détecté par criblage au phosphore après une période d’exposition de 16 heures du gel TBE-urée contenant de l’ARN séparé par électrophorèse sur gel. Une expérience contenant 50 nM d’ARN polymérase et de RpoD dans la gamme de 500 nM à 16 nM a généré des produits d’ARN de 250 pb (Figure 5). Pour chaque dilution double de la concentration de RpoD, il y avait un niveau plus faible de produit d’ARN accumulé. Il y avait une série de produits bp inférieurs qui apparaissaient sous la bande proéminente, indiquant des fragments d’ARN incomplets en raison de l’arrêt de la transcription ou de la fragmentation du modèle d’ADN. Les produits d’ARN étaient absents du contrôle sans matrice, ce qui indique qu’il n’y avait pas de fragments d’ADN exogènes contribuant au signal dans ce test. Aucun signal n’a été détecté dans le témoin sans ARN polymérase, ce qui indique que l’ARN polymérase de B. burgdorferi était la seule polymérase contribuant à la production d’ARN dans ce test.

Dans une deuxième expérience, nous avons utilisé une concentration plus faible de 25 nM ARN polymérase (Figure 6). Moins de produits d’ARN ont été détectés dans toute la gamme de concentrations de RpoD testées par rapport à la figure 5, et l’intensité du signal de fond était plus élevée. Ceci est problématique pour l’analyse en aval par densitométrie. Lorsque l’image du phosphore a été analysée par densitométrie (Figure 7), le signal de densitométrie obtenu à partir du phosphocrible a indiqué une relation linéaire entre la quantité de RpoD présente dans la réaction dans les deux expériences. Cependant, dans l’expérience avec un signal de fond élevé, la réaction contenant 25 nM d’ARN polymérase et moins de 100 nM de RpoD n’était pas fiable pour les comparaisons de niveaux de transcription relatifs.

Figure 1
Figure 1 : Séparation de l’ARN polymérase de B. burgdorferi marquée par His, purifiée par chromatographie d’affinité. La fraction d’écoulement continu du lysat cellulaire (voie 1), la fraction de premier lavage (voie 2), la fraction de dernier lavage (voie 3) et cinq fractions d’élution (voie 4-8) ont été diluées dans un tampon de chargement d’échantillon 2x, bouillies et séparées par SDS-PAGE dans un gel de polyacrylamide gradient à 200 V pendant 30 minutes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse de la purification du RpoD par électrophorèse sur gel. (A) Fractions d’écoulement continu regroupées (voie 1 et voie 2), fractions de lavage (voies 3 à 5) et fractions d’élution (voies 6 à 10) provenant de la purification du RpoD marqué MBP par chromatographie d’affinité de résine amylose. (B) Mélange de protéines après clivage du MBP et du RpoD à l’aide de la protéase du facteur Xa. (C) Solution d’écoulement continu (voie 1) et fractions d’élution avec un gradient croissant de NaCl (voies 2 à 9) de la chromatographie d’affinité de l’héparine à la séparation du MBP et du RpoD. Dans chaque gel présenté, les échantillons ont été mélangés avec un tampon de chargement 2x, bouillis et séparés dans un gel de polyacrylamide à gradient à l’aide de SDS-PAGE à 200 V pendant 30 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Génération par PCR de modèles de transcription in vitro. Un amplicon de 500 pb contenant le promoteur flgB (voie 1 et voie 2) et des réactions PCR de contrôle contenant des amplicons d’autres sites promoteurs (voies 3-4) sont représentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Disposition expérimentale et plan de séquence de pipetage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Variabilité dépendante de RpoD du signal d’image phosphoreux de l’ARN généré par transcription in vitro à l’aide de l’ARN polymérase de B. burgdorferi. Les réactions de transcription in vitro contenaient 50 nM d’ARN polymérase et des niveaux variables de RpoD indiqués au-dessus des bandes24. L’ARN a été séparé par un gel de TBE-urée à 10%, et un écran au phosphore a été utilisé pour capturer le signal de la désintégration radioactive sur 16 heures. Ce chiffre a été modifié à partir de Boyle et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Variabilité dépendante de RpoD du signal d’image phosphoreux provenant de l’ARN généré par transcription in vitro. La transcription in vitro contenait 25 nM d’ARN polymérase et divers niveaux de RpoD indiqués au-dessus des bandes. L’ARN a été séparé par un gel d’urée TBE à 15%, et un écran au phosphore a été utilisé pour capturer le signal de la désintégration radioactive sur 16 heures. La concentration plus faible d’ARN polymérase et le signal de fond plus élevé ont augmenté la difficulté d’une mesure précise. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Augmentation de l’accumulation d’ARN radiomarqué dans les réactions de transcription in vitro avec l’augmentation des niveaux de RpoD. Les signaux détectés dans l’imagerie sur écran au phosphore ont été analysés par densitométrie sans soustraction de fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recettes médiatiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Paramètres FPLC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Réactions de PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Plan expérimental de la polymérase ARN 50 nM et calcul du volume. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Plan expérimental de la polymérase ARN 25 nM et calcul du volume. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Souches et oligonucléotides utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Des tests de transcription in vitro construits à l’aide du protocole présenté ont récemment été utilisés pour étudier le rôle d’un facteur de transcription chez B. burgdorferi et peuvent être appliqués pour construire des expériences similaires en utilisant d’autres facteurs de transcription, facteurs sigma et molécules23. Une fois que l’ARN polymérase active de B. burgdorferi a été obtenue et que son activité a été détectée, les composants et les conditions des tests de transcription in vitro peuvent être modifiés. Le test est très flexible et modifiable. Les réactions sont modulaires et construites à partir de stocks congelés et nécessitent peu de temps une fois les paramètres expérimentaux choisis. Avec un stock suffisant, plusieurs expériences peuvent être réalisées en 1 jour.

L’obtention d’ARN polymérase active est l’aspect le plus critique de la préparation de la réaction de transcription in vitro . Nous recommandons de récolter l’ARN polymérase à partir de cellules cultivées jusqu’à la phase de croissance logarithmique moyenne, comme décrit dans ce protocole. Lors de la purification de l’ARN polymérase de toute bactérie, le taux de croissance a été noté comme un facteur important dans la purification de l’ARN polymérase active. Les ARN polymérases peuvent accumuler des modifications post-traductionnelles et peuvent être associées à des facteurs de transcription inhibiteurs à la phase stationnaire de croissance31. Nous n’avons pas réussi à purifier de grandes quantités d’ARN polymérase active à partir de cultures de B. burgdorferi cultivées en phase stationnaire. L’approche de chromatographie d’affinité, par rapport à une approche de séparation physique32, est également bénéfique pour la purification de B. burgdorferi parce que l’organisme atteint une faible densité en culture et que l’accumulation de grandes quantités de culture cellulaire est relativement exigeante en matériaux.

Lors des purifications d’autres ARN polymérases bactériennes, les facteurs sigma peuvent co-purifier en quantités importantes en fonction de la méthode de purification et des conditions33,34,35,36. La co-purification des facteurs sigma peut limiter les expériences en aval en utilisant des facteurs sigma alternatifs, des facteurs sigma modifiés ou un manque de facteurs sigma. De plus, la supplémentation avec le facteur sigma d’entretien RpoD est bénéfique pour détecter l’activité indépendamment de la co-purification initiale du facteur sigma37. En raison de la flexibilité de séparation du facteur sigma du noyau de l’ARN polymérase, nous considérons qu’il est avantageux que les facteurs sigma ne se co-purifient pas dans les conditions de purification par chromatographie d’affinité His décrites ici. Il est possible que les conditions de purification puissent être modifiées pour produire plus d’holoenzymes intactes et actives contenant du RpoD. Par exemple, les concentrations de sel sont susceptibles d’affecter la stabilité de plusieurs enzymes sous-unitaires, et l’effet de la concentration d’imidazole sur la stabilité du complexe ARN polymérase de B. burgdorferi ou son incorporation cationique divalente est également inconnu.

B. burgdorferi L’activité enzymatique de l’ARN polymérase est sensible au type et à la quantité de cations divalents présents24. Nous avons constaté que le manganèse est nécessaire pour une activité maximale de l’ARN polymérase, et le magnésium semblait contribuer à l’activité dans une moindre mesure. Les ions contaminants dans l’eau ajoutent une grande variabilité à l’activité enzymatique de l’ARN polymérase. Par conséquent, l’eau très pure telle que la qualité biologie moléculaire, la qualité HPLC et la qualité d’analyse des métaux H2O avec peu d’ions métalliques présents est essentielle pour une activité ARN polymérase plus élevée dans le protocole décrit ici. Les ARN polymérases sont également sensibles au pH et nécessitent un environnement réducteur lors de la purification27. La modification du pH ou l’utilisation de BME comme agent réducteur a entraîné une ARN polymérase inactive. Nous recommandons d’utiliser l’ARN polymérase E. coli disponible dans le commerce comme témoin pour assurer la construction correcte des tests de transcription in vitro 24. E. coli L’ARN polymérase permettra de tester la viabilité des nucléotides, la méthode de construction du modèle, l’incorporation du radiomarqueur, la séparation de l’ARN et la méthode de détection du signal. Cependant, il convient de noter que l’ARN polymérase de B. burgdorferi a des exigences spécifiques en cations, tampons et promoteurs divalents par rapport à E. coli.

Il existe plusieurs méthodes de détection pour les réactions de transcription in vitro. L’incorporation de colorants et les essais de balises moléculaires sont des solutions de rechange courantes à la méthode de détection par radiomarquage38,39. L’incorporation de nucléotides radiomarqués est actuellement la méthode de détection d’ARN la plus sensible. Les tests alternatifs nécessitent plus d’ARN polymérase pour atteindre des niveaux de signal mesurables par rapport aux tests radiomarqués. De plus, les méthodes d’incorporation de colorant et de balise moléculaire ont généralement plus de moyens pour que les signaux soient erronés. Par exemple, la contamination par la DNase peut amener les balises moléculaires à émettre un signal en l’absence de leur cible. En utilisant l’incorporation de radiomarque, l’activité relative de l’enzyme ARN polymérase de B. burgdorferi peut être détectée même à de faibles niveaux, ce qui convient à l’expérimentation initiale avec les enzymes ARN polymérase.

Bien que la concentration de l’enzyme ARN polymérase de B. burgdorferi incluse dans la réaction soit normalisée par spectrophotométrie, cette mesure peut être une source de variabilité. L’activité spécifique des ARN polymérases peut dépendre du nombre d’holoenzymes actives entièrement formées, qui constituent une partie du mélange totalde protéines 40. Par exemple, la quantité molaire de 50 nM d’ARN polymérase rapportée dans nos résultats a été déterminée par spectrophotométrie, mais une analyse des quantités de sous-unités par transfert Western quantitatif a révélé que la sous-unité RpoA était un composant limitant dans le nombre d’holoenzymes potentielles de l’ARN polymérase, et un maximum de seulement 21 nM d’ARN polymérase entièrement formée était possible dans notre mélange24. Des expériences doivent toujours être menées pour contrôler la variation d’un lot à l’autre de l’ARN polymérase et d’autres composants de la réaction de transcription in vitro .

Dans notre expérience représentative illustrée à la figure 5, les niveaux de RpoD ont été modifiés et une relation linéaire entre RpoD et le signal détecté a été démontrée. La transcription in vitro est une méthode polyvalente qui peut être facilement modifiée à l’aide du modèle expérimental présenté (tableau 4). Par exemple, d’autres facteurs sigma ou des modèles d’ADN alternatifs peuvent être facilement testés24. D’autres modèles pourraient inclure différentes régions promotrices générées par PCR ou un plasmide purifié à partir de cellules pour introduire des caractéristiques d’ADN superenroulé et méthylé. Pour un niveau donné de RpoD, d’ARN polymérase et de matrice, différents niveaux d’un facteur de transcription peuvent être ajoutés pour voir l’inhibition ou l’amélioration de l’activité d’un promoteur23. L’ordre d’addition des composants et les rapports molaires dans la réaction de transcription in vitro peuvent être modifiés de sorte que les complexes d’initiation de la transcription se forment avant le début de la réaction; Ces réactions pourraient mesurer l’allongement de la transcription au lieu de l’initiation de la transcription40. Le test de transcription in vitro peut être modifié pour convenir à une variété d’enquêtes sur la biologie de B. burgdorferi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention de perfectionnement du corps professoral du Fonds d’investissement stratégique en sciences de la santé de l’Université Creighton. La souche RpoC-His10X de B. burgdorferi a été aimablement fournie par le Dr D. Scott Samuels de l’Université du Montana. La souche E. coli hébergeant le plasmide pMAL-C5X codant pour un allèle rpoD marqué par une protéine de liaison au maltose a été aimablement fournie par le Dr Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Tags

Ce mois-ci dans JoVE numéro 185 Borrelia Borreliella transcription in vitro ARN polymérase RpoD RpoC
Composants essentiels des tests de transcription <em>in vitro de</em> <em>Borreliella (Borrelia</em>) burgdorferi<em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyle, W. K., Sorensen, H. N.,… More

Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter