Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transkripsiyon Tahlillerinin Temel Bileşenleri

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

İn vitro transkripsiyon testleri, Borreliella burgdorferi'deki transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını deşifre edebilir. Bu protokol, B. burgdorferi RNA polimerazını saflaştırma ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını gerçekleştirme adımlarını açıklar. İn vitro transkripsiyon testlerini kullanan deneysel yaklaşımlar, aktif RNA polimerazın güvenilir saflaştırılmasını ve depolanmasını gerektirir.

Abstract

Borreliella burgdorferi , sınırlı metabolik ve genomik repertuarlara sahip bakteriyel bir patojendir. B. burgdorferi , omurgalılar ve keneler arasında hücre dışı geçiş yapar ve enfeksiyon sırasında farklı ortamlarda hayatta kalmak için transkripsiyonel profilini çarpıcı bir şekilde yeniden şekillendirir. B. burgdorferi çalışmalarının odak noktası, bakterilerin transkripsiyonel değişiklikler yoluyla çevresine nasıl tepki verdiğini açıkça anlamaktır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyonel regülasyonun temel mekanizmalarının biyokimyasal olarak diseke edilmesine izin verir. Burada, B. burgdorferi RNA polimeraz saflaştırma ve depolama, sigma faktör saflaştırma, DNA şablon oluşturma ve in vitro transkripsiyon tahlillerini açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) 'den saflaştırılmış RNA polimerazın kullanımını açıklar. 5A4-RpoC, RNA polimerazın en büyük alt birimini kodlayan rpoC geni üzerinde 10XHis etiketi barındıran daha önce yayınlanmış bir suştur. İn vitro transkripsiyon testleri, 5A4-RpoC suşundan saflaştırılmış RNA polimerazdan, temizlik sigma faktörü RpoD'nin rekombinant bir versiyonundan ve PCR tarafından üretilen çift sarmallı bir DNA şablonundan oluşur. Protein saflaştırma teknikleri ve in vitro transkripsiyon tahlillerinin birleştirilmesine yönelik yaklaşımlar kavramsal olarak iyi anlaşılmış ve nispeten yaygın olsa da, RNA polimerazları için ele alma hususları genellikle organizmadan organizmaya farklılık gösterir. Burada sunulan protokol, B. burgdorferi RNA polimeraz üzerindeki enzimatik çalışmalar için tasarlanmıştır. Yöntem, transkripsiyon faktörlerinin, promotörlerin ve translasyonel sonrası modifikasyonların RNA polimerazın aktivitesi üzerindeki rolünü test etmek için uyarlanabilir.

Introduction

Lyme hastalığı ve tekrarlayan ateş, Borrelia ve Borreliella 1,2,3 cinslerindeki spiroket patojenlerinden kaynaklanır. Lyme hastalığı, Kuzey Amerika'da belirgin bir vektör kaynaklı hastalıktır ve sonuç olarak, Borreliella burgdorferi, spiroket biyolojisini incelemek için önde gelen bir model organizmadır 4,5. Transkripsiyonel düzenlemenin B. burgdorferi mekanizmalarına yönelik araştırmalar, kene vektörü ile memeli konakçıları arasında dönerken çevredeki değişikliklere adaptasyonlarını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır 6,7. pH, sıcaklık, ozmolarite, besin mevcudiyeti, kısa zincirli yağ asitleri, organik asitler ve çözünmüş oksijen ve karbondioksit seviyelerindeki değişiklikler, B. burgdorferi'nin eklembacaklı vektöründe hayatta kalması ve hayvanları enfekte etmesi için önemli olan genlerin ekspresyonunu modüle eder 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Bu tepkileri uyaranlara düzenleyici mekanizmalarla ilişkilendirmek, B. burgdorferi araştırmasının önemli bir yönü olmuştur19.

Transkripsiyon faktörleri ve sigma faktörleri, hücresel süreçleri gerçekleştiren genlerin transkripsiyonunu kontrol eder. Lyme ve tekrarlayan ateş spiroketleri, nispeten seyrek bir transkripsiyon faktörleri seti ve alternatif sigma faktörleri barındırır. Buna rağmen, B. burgdorferi'nin çevreye verdiği tepkileri yönlendiren karmaşık transkripsiyonel değişiklikler vardır20,21,22. Çevresel değişikliklere yanıt olarak B. burgdorferi'deki transkripsiyonel değişiklikleri yönlendiren spesifik mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyon faktörlerinin ve sigma faktörlerinin işlevini ve düzenleyici mekanizmalarını test etmek için biyokimyasal bir yaklaşım kullanmak için güçlü araçlardır23,24,25,26.

B. burgdorferi RNA polimerazı kullanan bir in vitro transkripsiyon tahlil sistemi yakın zamanda kurulmuştur24. Bakteriler genellikle benzersiz hücresel fizyolojilere sahip olduklarından, farklı türlerin ve cinslerin RNA polimerazları enzim saflaştırma, enzim depolama ve reaksiyon tamponu koşullarına farklı tepki verir27. B. burgdorferi ayrıca RNA polimerazlarının incelendiği birçok bakteri türünden genetik olarak uzaktır20. Lizis, yıkama ve elüsyon tamponu koşulları, depolama tamponu, in vitro transkripsiyon reaksiyon tamponu ve tahlil yapım yöntemi gibi enzim preparatının yönleri, RNA polimeraz aktivitesini değiştirebilir. Burada, RNA polimeraz ve sigma faktörü RpoD'nin saflaştırılması, doğrusal çift sarmallı DNA şablonunun üretimi ve bu sistemi kullanan laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için in vitro transkripsiyon testlerinin inşası için bir protokol sunuyoruz. RpoD'ye bağımlı transkripsiyon için doğrusal aralığı göstermek ve bu yaklaşımın sınırlamalarını ve alternatiflerini tartışmak için örnek bir reaksiyonu detaylandırıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RNA polimerazın saflaştırılması ve RNA polimeraz stoğunun hazırlanması

  1. Hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda (34 °C, %5 CO 2, %3 O 2) BSKII ortamında kültürlenmiş 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X'ten, daha önce tarif edilen hücre toplama protokolleri28,29'u kullanarak2-4 x 107 hücre/mL yoğunluğa kadar toplayın. 500 mL santrifüjlü şişelerde 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'de santrifüjleme yapın ve süpernatanı dökün.
  2. Hücreleri 30 mL buz gibi soğuk HN tamponunda (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0) yeniden askıya alın. Santrifüjleme adımını yukarıda açıklandığı gibi 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak tekrarlayın ve süpernatanı boşaltın.
    NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
  3. Hücreleri, lizatı ve saflaştırılmış proteinleri donmadıkça 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun. Bu protokolde kullanılan her tampona 2 mM konsantrasyonda taze hazırlanmış DTT ekleyerek RNA polimerazı indirgeyici bir ortamda tutun ve pH 8.0'ı koruyun.
  4. Kit talimatlarını izleyerek ticari bir bakteriyel lizis kiti kullanarak B. burgdorferi hücre peletinden lizat hazırlayın. Pelet, proteaz inhibitörü olmadan 10-15 mL oda sıcaklığı (RT) B-PER çözeltisinde tekrar askıya alın ve lizisin buz üzerinde 5 dakika ilerlemesine izin verin. Lizis hacmi, kit talimatlarında açıklandığı gibi hücre pelet boyutuna bağlıdır.
  5. Lizis çözeltisine proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin, ardından temsili sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi üç tur sonikasyon ekleyin.
    NOT: Alternatif olarak, hücreleri daha önce24'te açıklandığı gibi bir Fransız basınç hücresinde lize edin. 1.4 adımını atlayın. ve adım 1.5.
  6. Santrifüjleme ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Çözeltiye kobalt kolon yükleme tamponu (Tablo 1) ekleyerek tüpün hacmini en az 30 mL toplam hacme doldurun. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin.
  7. Süpernatantı 0,45 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
  8. Lizatı kobalt kolon yükleme tamponunda (Tablo 1) 1:10 nihai seyreltme oranı kullanarak seyreltin.
  9. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir kobalt veya nikel-reçine sütunu kullanarak arıtılmış hücre lizat süpernatantı üzerinde afinite kromatografisi yapın. Örnek için temsili sonuçlar bölümüne bakın. Tablo 1'de listelenen arabellekleri kullanın. Analiz için akış, yıkama ve elüsyon örneklerini toplayın.
  10. Elüsyon tampon çözeltisindeki RNA polimerazını, üreticinin talimatlarını izleyerek bir tampon değişim sütunu kullanarak derhal RNA polimeraz depolama tampon çözeltisine (Tablo 1) değiştirin.
  11. RNA polimerazını 10 kDa-cutoff santrifüj filtre üniteleri kullanarak spektrofotometri ile belirlenen 0.2-0.4 mg / mL'lik bir konsantrasyona yoğunlaştırarak dondurucu stoklarını hazırlayın (Yok olma katsayısı ayarı olmadan280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL−1]).
  12. Aliquot RNA polimeraz dondurucu, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve RNA polimerazı -80 ° C'de depolar.
  13. Afinite kromatografisinin kalitesini SDS-PAGE ile belirleyin ve toplam protein verimini spektrofotometri veya BCA testi ile ölçün. SDS-PAGE ile iyi çözünürlük için numuneleri 120 V'ta 50 dakika boyunca% 7.5'lik bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırın.

2. Rekombinant RpoD'nin saflaştırılması ve RpoD stoğunun hazırlanması

  1. BL21::MBP-RpoDBb'de Maltoz Bağlayıcı Protein etiketli rekombinant B. burgdorferi RpoD'nin (MBP-RpoD) ekspresyonunu kültüre alın ve indükleyin, Malzeme Tablosunda listelenen protein füzyon ve saflaştırma sistemi kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ve hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın.
    NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletlerini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
  2. Ticari bir bakteri hücresi lizis kiti veya Fransız basınç hücresi kullanarak lizis gerçekleştirin. Tablo 1'deki örnek lizis arabelleğine bakın.
  3. Santrifüjleme ve filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin. Süpernatantı 0,45 μm filtre kullanarak filtreleyin.
  4. Ekspresyon sistemi için bir protein ekstraksiyon protokolü kullanarak MBP-RpoD'yi ayıklayın. Uygulama ayrıntıları ve sonuçları gibi temsili sonuçlar bölümüne bakın.
  5. SDS-PAGE ile afinite kromatografisi işleminin ve elüsyonunun kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün (Yok olma katsayısı ayarı olmadan280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL−1]). SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  6. MBP-RpoD'yi 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak spektrofotometri ile belirlenen >2 mg/mL konsantrasyonuna konsantre edin.
  7. MBP'yi Faktör Xa bölünme bölgesinde RpoD'den ayırın. 2 mM'lik bir konsantrasyonda MBP-RpoD içeren afinite kromatografisi elüsyon fraksiyonlarına CaCl2 ekleyin. Her 30 mg saflaştırılmış protein için 200 μg Faktör Xa Proteaz ekleyin. RT'de bir gecede kuluçkaya yatın.
  8. MBP'nin RpoD'den SDS-PAGE ile tamamen ayrıldığını onaylayın. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  9. MBP ve RpoD içeren çözeltiyi, heparin bağlayıcı bir tamponla 1:10 oranında seyreltin.
  10. Heparin sütunundaki MBP ve RpoD'yi FPLC ile ayırın. FPLC ayarları için Tablo 2'ye bakın.
  11. SDS-PAGE ile afinite kromatografi ürünlerinin kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  12. RpoD içeren elüsyon fraksiyonlarını 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak 2-3 mL'lik son hacme kadar yoğunlaştırın.
  13. Tampon, konsantre RpoD elüsyon fraksiyonlarını bir jel filtrasyon sütunu kullanarak depolama tamponuna değiştirin.
  14. RpoD stoğunu, spektrofotometri ile belirlenen 0,2-0,8 mg/mL konsantrasyona kadar 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak konsantre edin.
  15. Aliquot RpoD, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve -80 ° C'de saklanır.

3. DNA şablon stoğunun hazırlanması

  1. PCR, 200 μL'lik bir reaksiyon kullanarak B. burgdorferi genomik DNA'sından RpoD tahrikli bir promotör bölgesini çevreleyen 500 bp bölgesini güçlendirir (Tablo 3).
  2. PCR ürünlerini ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Moleküler biyolojide DNA'yı H2O sınıfında elute edin.
  3. PCR tarafından üretilen DNA şablonlarının molar konsantrasyonunu, moleküler biyoloji sınıfH2O'da seyreltme ile 100 nM'ye ayarlayın.

4. Radyoaktif işaretli nükleotidlerin dahil edilmesiyle in vitro transkripsiyon gerçekleştirin

  1. Bir in vitro transkripsiyon deney planı hazırlayın. RNA polimeraz, RpoD ve DNA şablon konsantrasyonlarını belirleyin. Reaksiyon tüpleri için alikot hacimlerini ve pipetleme sıralarını belirleyin. Örnek için Tablo 4 ve Şekil 1'e bakınız.
    NOT: RNA polimeraz, alternatif polimeraz, şablon içermeyen reaksiyonlar veya alternatif şablonlar gibi kontrolleri deneysel plana dahil edin.
  2. Deney için gereken α-32P-ATP hacmini hesaplayın. Bunu deneysel plana dahil edin. Tipik olarak, fosfor ekran tespiti için in vitro transkripsiyon reaksiyonu başına 2 μCi aktivite ekleyin.
  3. Radyasyon kontaminasyon riskini azaltmak için radyasyon tezgahı da dahil olmak üzere çalışma yüzeylerini hazırlayın.
  4. RNA polimeraz, Rpo, 5x tampon NTP ve şablon stok çözeltilerinin taze alikotlarını buz üzerinde çözün. Pipetlemeden önce çözülmüş tüm dondurulmuş stokları iyice karıştırın.
  5. Deneysel plana göre radyoaktif işaretli nükleotidler için bir ana reaksiyon karışımı ve ayrı bir NTP karışımı hazırlayın.
  6. Kontrol reaksiyonlarını ve deney setlerini, reaksiyona radyoetiket eklemenin hazırlanmasında PCR tüplerine dağıtın. H2 O, reaksiyon anakarışımı, RNA polimeraz ve RpoD'yi belirlenmiş PCR tüplerine nazikçe dağıtın ve pipetleme ile karıştırın.
  7. Hazırlanan malzemeleri bir radyasyon tezgahına aktarın.
  8. NTP'ye α-32P-ATP ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
    DİKKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken, radyoaktif izotoplar için uygun koruyucu ekipman ve taşıma prosedürleri kullanın.
  9. Adım 4.6'dan itibaren in vitro transkripsiyon reaksiyon karışımlarını içeren tüplere NTP ekleyin.
  10. Bir DNA şablonunun eklenmesiyle in vitro transkripsiyon reaksiyonunu başlatın. Reaksiyon hacmini nazikçe pipetleyerek karıştırın.
  11. Tüpleri 37 ° C'de bir termosikler veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca inkübe edin.
  12. Reaksiyonları termosiklerden veya ısı bloğundan çıkarın ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını durdurmak için% 50 formamid içeren 2x RNA yükleme boyasını eşit bir reaksiyon hacmine ekleyin.
  13. Bir termosiklet veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca 65 ° C'de reaksiyonları inkübe ederek enzimleri denatüre edin.
  14. 30-45 dakika boyunca 180 V'ta% 10-15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak% 10 -% 15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak jel elektroforezi ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu karışımında RNA'yı ayırın.
    NOT: Jel elektroforezi koşullarına bağlı olarak, tampon çözeltisi radyoaktif işaretli nükleotitlerle kontamine olabilir veya jel, radyoaktif işaretli nükleotitlerin çoğunu veya tamamını içerebilir. Uygun radyoaktivite depolaması veya bertarafı için plan yapın.
  15. Radyoaktif işaretli ATP içeren jelin herhangi bir bölümünü çıkardıktan sonra fosfoekran kullanarak radyoaktif etiketli RNA'yı görüntüleyin. Jeli gece boyunca (16 saat) fosfoekrana maruz bırakın ve bir fosfoekran görüntüleyici (100 μm çözünürlük, 700 V PMT tüp voltajı) kullanarak görüntüyü görüntüleyin.
  16. Dansitometri yöntemlerini kullanarak verileri analiz etme24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reaksiyonun sınırlayıcı adımının sigma faktörü aracılı transkripsiyon başlangıcı olduğu bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda, transkripsiyon aktivitesi sigma faktörü miktarı ile doğrusal olarak artmalıdır. Radyoaktif işaretli nükleotidin RNA ürünlerine dahil edilmesinden kaynaklanan değişen sinyali gözlemlemek için iki RNA polimeraz konsantrasyonu ile birlikte bir dizi RpoD konsantrasyonunu test eden in vitro transkripsiyon deneylerinin hazırlanmasını sunuyoruz. RNA polimeraz, RpoD ve çift sarmallı DNA şablon stoklarının hazırlanmasının temsili sonuçları gösterilmiştir. Temsili in vitro transkripsiyon reaksiyonları, analiz için kabul edilebilir RNA polimeraz aktivite seviyelerinin bir örneği olarak hizmet eder.

RNA polimerazın saflaştırılması için, mikroaerofilik koşullar altında 34 ° C'de 4 L'lik bir B. burgdorferi RpoC-His10X kültürü yetiştirildi (% 5 CO2,% 3O2). Kültürler, karanlık alan mikroskobu kullanılarak spiroket yoğunluğu açısından yakından izlendi ve 4 x 107 spiroket / mL'den daha yüksek yoğunluklara ulaşmadan önce toplandı. Hücreler lizis için B-PER karışımında yeniden askıya alındı (Tablo 1). Hücre peleti pipetleme ile homojenize edildi, ardından RT'de 5 dakikalık inkübasyon yapıldı ve sonraki sonikasyon turları üçlü olarak 3 s boyunca gerçekleştirildi. Arıtılmış lizatlar, kobalt kolon yükleme tamponu ve 5 mL kobalt reçinesi ile toplam 180 mL hacme kadar seyreltildi. RpoC-His10X'in, karışımı 4 ° C'de 1 saat boyunca besleyerek kobalt reçinesine bağlanmasına izin verildi. Karışım bir yerçekimi akış kolonuna aktarıldı ve 40 mL kolon yıkama tamponu ile beş kez yıkandı. Bağlı protein, kolondan 5 mL elüsyon tamponu geçirilerek serbest bırakıldı ve elüpsiyon yedi kez tekrarlandı. Akış, yıkama ve elüsyon fraksiyonlarının örnekleri SDS-PAGE ile ayrıldı ve leke birleştirme ile görüntülendi (Şekil 1). RNA polimeraz çekirdek kompleksi, sırasıyla 154 kDa, 129 kDa ve 38.5 kDa boyutlarında RpoC, RpoB ve RpoA'dan oluşur. Şekil 1'de gösterilen temsili sonuç, RNA polimeraz kompleksini oluşturan üç peptidin boyutlarında üç belirgin bant göstermektedir. Afinite kromatografisinden gelen akış, 1.0 ile 1.7 arasında 260/280 oranına sahip 0.5-1 mg / mL protein içeriyordu ve bu da daha yüksek bir nükleik asit konsantrasyonunu gösteriyordu. Spektrofotometri ile belirlenen protein karışımının konsantrasyonunu takiben RNA polimeraz protein verimi 0.3 mg / mL idi.

RpoD protein stoklarını hazırlamak için, bir C-terminal Maltoz Bağlayıcı Protein etiketine sahip rekombinant RpoD, BL21 (DE3) pLysS E. coli'deki bir pMAL-C5X plazmidinden eksprese edildi. 2 L E. coli , 32 ° C'de 0.5 OD600nm'ye kadar yetiştirildi. Kültür daha sonra 1 saat boyunca RpoD ekspresyonunu indüklemek için 0.3 mM IPTG ile tedavi edildi. Hücreler santrifüjleme ile peletlendi ve B-PER'de lize edildi. Elde edilen 200 mL seyreltilmiş hücre lizatı, 10 mL amiloz reçinesi ile filtrelendi. Reçine, artık DNA ve peptitleri çıkarmak için sekiz kez 40 mL bağlayıcı tampon ile yıkandı. MBP etiketli RpoD, reçine kolonuna beş kez 5 mL elüsyon tamponu ile salındı. Bağlama ve yıkama basamaklarından ve elüsyon fraksiyonlarından gelen akış SDS-PAGE ile analiz edildi (Şekil 2A). Elüsyon fraksiyonundaki ana bileşen, MBP etiketli rekombinant B. burgdorferi RpoD'nin boyutuyla eşleşen ~ 115 kDa'lık bir peptittir. Elüsyon fraksiyonları birleştirildi, CaCl 2 konsantrasyonu2 mM'ye ayarlandı ve 40 mg saflaştırılmış proteine 100 μg FactorXa proteaz eklendi. Oda sıcaklığında gece boyunca sindirimi takiben, reaksiyon SDS-PAGE ile analiz edildi (Şekil 2B). Faktör Xa proteaz ile bölünmeyi takiben, karışımdaki iki ana ürün RpoD (73.6 kDa) ve MBP (45 kDa) idi. RpoD ve MBP proteinlerinin karışımı heparin afinite kromatografisi kullanılarak ayrıldı. Karışım, heparin bağlayıcı tamponda 1:10 oranında seyreltildi ve bir FPLC'de heparine bağlı bir reçine kolonuna yüklendi. RpoD, artan bir NaCl gradyanı ile 1 M'lik bir konsantrasyona salınıma edildi. Fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edildiğinde, elüzyon fraksiyonunda 400-600 mM NaCl aralığında 73.6 kDa büyüklüğünde majör bir bant belirgindi (Şekil 2C). Bazı bozulmuş RpoD parçaları birlikte saflaştırıldı. RpoD içeren fraksiyonlar birleştirildi, tampon RpoD depolama tamponuna dönüştürüldü ve daha sonra 10 kDa-kesme santrifüj filtresi kullanılarak konsantre edildi. Son RpoD konsantrasyonu, spektrofotometri ile belirlenen 0.67 mg / mL (9.1 mM) idi.

B. burgdorferi flgB'nin promotör bölgesini kapsayan çift sarmallı bir DNA şablonu PCR tarafından üretildi. FggB promotörü, 30 ng B. burgdorferi DNA'sı24,30 içeren 200 μL'lik bir reaksiyon kullanılarak promotörün yukarı ve aşağı akımına (Tablo 6) karşılık gelen primerler tarafından güçlendirildi. PCR ürünü %1 agaroz jel içinde jel elektroforezi ile analiz edildi (Şekil 3). PCR ürünü, belirgin homojenliğe sahip kabaca 500 bp büyüklüğündeydi. Önemli olarak, tuzlar ve hücre bileşeni kontaminasyonu, in vitro transkripsiyon reaksiyon sonuçlarının değişkenliğine katkıda bulunabilir; DNA şablonunun PCR saflaştırma sütununda tamamen tuzdan arındırılmasını sağlıyoruz.

Transkripsiyonun şablon DNA'nın eklenmesiyle başlatıldığı deneysel bir şema, promotör tanıma ve transkripsiyon başlatma oranını test edebilir. Temsili deneylerimizde, 16 nM-1 μM arasında değişen suda iki kat seyreltme ile bir seyreltme serisi RpoD proteini hazırlanmıştır. Aktivite için gerekli iki değerli katyonları içeren bir reaksiyon tamponunda RNA polimeraz içeren bir ana karışım oluşturuldu (Tablo 4 ve Tablo 5). RpoD ve master mix, buz üzerinde birlikte alıntılandı. RNA polimeraz ve RpoD içeren ana karışımın inkübe edilmesine izin verilirken, in vitro transkripsiyonun diğer adımları hazırlandı. Üç kontrol reaksiyonu ekledik: ana karışımdan ayrı olarak hazırlanan pozitif bir kontrol reaksiyonu, in vitro transkripsiyon sinyalinin şablona bağımlı olmasını sağlamak için şablon DNA içermeyen negatif bir kontrol reaksiyonu ve sinyalin RNA polimerazın bağımlı olmasını sağlamak için RNA polimeraz içermeyen negatif bir kontrol reaksiyonu. Radyoaktif işaretli nükleotidler, geri kazanılamayan hacimleri telafi etmek için 20 reaksiyon için yeterli aliquot oluşturmak için 5 μL (α-32P-ATP) ila 20 μL 10x NTP stok karışımı karıştırılarak reaksiyona eklendi. Son olarak, flgB promotörünü kodlayan şablon DNA, daha önce planlanan pipetleme sırasını izleyerek pipetleme yoluyla reaksiyon tüplerine tanıtıldı (Şekil 4).

İn vitro transkripsiyon ile üretilen RNA fragmanlarından gelen sinyal, jel elektroforezi ile ayrılmış RNA içeren TBE-üre jelinin 16 saatlik bir maruz kalma süresini takiben fosfor ekranı ile tespit edildi. 500 nM ila 16 nM aralığında 50 nM RNA polimeraz ve RpoD içeren bir deney, 250 bp'lik RNA ürünleri üretti (Şekil 5). RpoD konsantrasyonunun her iki kat seyreltilmesi için, daha düşük bir birikmiş RNA ürünü seviyesi vardı. Belirgin bandın altında ortaya çıkan, transkripsiyon durması veya parçalanmış DNA şablonu nedeniyle eksik RNA fragmanlarını gösteren bir dizi düşük bp ürünü vardı. RNA ürünleri, şablon kontrolü olmadan yoktu, bu da bu tahlildeki sinyale katkıda bulunan eksojen DNA fragmanlarının olmadığını gösteriyordu. RNA polimeraz kontrolünde hiçbir sinyal tespit edilmedi, bu da B. burgdorferi RNA polimerazının bu tahlilde RNA üretimine katkıda bulunan tek polimeraz olduğunu gösteriyor.

İkinci bir deneyde, daha düşük bir konsantrasyonda 25 nM RNA polimeraz kullandık (Şekil 6). Şekil 5'e kıyasla test edilen RpoD konsantrasyonları aralığında daha az RNA ürünü tespit edildi ve arka plan sinyal yoğunluğu daha yüksekti. Bu, dansitometri ile aşağı akış analizi için sorunludur. Fosfor görüntüsü dansitometri ile analiz edildiğinde (Şekil 7), fosfoekrandan elde edilen dansitometri sinyali, her iki deneyde de reaksiyonda bulunan RpoD miktarı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, yüksek arka plan sinyali ile yapılan deneyde, 25 nM RNA polimeraz ve 100 nM'den az RpoD içeren reaksiyon, göreceli transkripsiyon seviyesi karşılaştırmaları için güvenilmezdi.

Figure 1
Resim 1: Afinite kromatografisi ile saflaştırılan His-tagged B. burgdorferi RNA polimerazın ayrılması. Hücre lizatının akış fraksiyonu (şerit 1), ilk yıkama fraksiyonu (şerit 2), son yıkama fraksiyonu (şerit 3) ve beş elüsyon fraksiyonu (şerit 4-8) 2x numune yükleme tamponunda seyreltildi, kaynatıldı ve SDS-PAGE ile 200 V'ta bir gradyan poliakrilamid jel içinde 30 dakika boyunca ayrıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Jel elektroforezi ile RpoD saflaştırmasının analizi. (A) MBP etiketli RpoD'nin amiloz reçine afinite kromatografisi ile saflaştırılmasından havuzlanmış akış fraksiyonları (şerit 1 ve şerit 2), yıkama fraksiyonları (şerit 3-5) ve elüsyon fraksiyonları (şerit 6-10). (B) Faktör Xa proteaz kullanılarak MBP ve RpoD'nin bölünmesini takiben protein karışımı. (C) MBP ve RpoD'yi ayırmak için heparin afinite kromatografisinden artan bir NaCl gradyanı (şerit 2-9) ile akış çözeltisi (şerit 1) ve elüsyon fraksiyonları. Sunulan her jelde, numuneler 2x yükleme tamponu ile karıştırıldı, kaynatıldı ve 30 dakika boyunca 200 V'ta SDS-PAGE kullanılarak gradyan bir poliakrilamid jel içinde ayrıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İn vitro transkripsiyon şablonlarının PCR üretimi. 500 bp boyutunda amplikon içeren flgB promotörü (şerit 1 ve şerit 2) ve diğer promotör bölgelerin amplikonlarını içeren kontrol PCR reaksiyonları (şerit 3-4) gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Deneysel düzenleme ve pipetleme sıra planı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: B. burgdorferi RNA polimeraz kullanılarak in vitro transkripsiyon ile üretilen RNA'dan fosfor görüntü sinyalindeki RpoD'ye bağımlı değişkenlik. İn vitro transkripsiyon reaksiyonları 50 nM RNA polimeraz ve24 bantlarının üzerinde belirtilen değişen RpoD seviyelerini içeriyordu. RNA,% 10'luk bir TBE-üre jeli ile ayrıldı ve 16 saat boyunca radyoaktif bozunmadan gelen sinyali yakalamak için bir fosfor ekranı kullanıldı. Bu rakam Boyle ve arkadaşlarından değiştirilmiştir.24. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İn vitro transkripsiyon tarafından üretilen RNA'dan fosfor görüntü sinyalindeki RpoD'ye bağlı değişkenlik. İn vitro transkripsiyon, 25 nM RNA polimeraz ve bantların üzerinde belirtilen çeşitli seviyelerde RpoD içeriyordu. RNA,% 15'lik bir TBE-üre jeli ile ayrıldı ve 16 saat boyunca radyoaktif bozunmadan gelen sinyali yakalamak için bir fosfor ekranı kullanıldı. Daha düşük RNA polimeraz konsantrasyonu ve daha yüksek arka plan sinyali, doğru ölçümün zorluğunu arttırdı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: RpoD seviyelerinin artması ile in vitro transkripsiyon reaksiyonlarında radyoaktif işaretli RNA birikiminin artması. Fosfor ekran görüntülemede tespit edilen sinyaller, arka plan çıkarma olmaksızın dansitometri ile analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Medya tarifleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: FPLC ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: PCR reaksiyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: 50 nM RNA polimeraz deney planı ve hacim hesaplaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5: 25 nM RNA polimeraz deney planı ve hacim hesaplaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 6: Bu protokolde kullanılan suşlar ve oligonükleotidler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sunulan protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyon testleri yakın zamanda B. burgdorferi'de bir transkripsiyon faktörünün rolünü incelemek için kullanılmıştır ve diğer transkripsiyon faktörlerini, sigma faktörlerini ve molekülleri kullanarak benzer deneyler yapmak için uygulanabilir23. B. burgdorferi'den aktif RNA polimeraz elde edildikten ve aktivitesi tespit edildikten sonra, in vitro transkripsiyon tahlillerindeki bileşenler ve koşullar değiştirilebilir. Tahlil oldukça esnek ve değiştirilebilir. Reaksiyonlar modülerdir ve dondurulmuş stoklardan yapılmıştır ve deneysel parametreler seçildikten sonra çok az teslim süresi gerektirir. Yeterli stok verildiğinde, 1 gün içinde birden fazla deney yapılabilir.

Aktif RNA polimeraz elde etmek, in vitro transkripsiyon reaksiyonu preparatının en kritik yönüdür. Bu protokolde açıklandığı gibi orta logaritmik büyüme fazına kadar yetiştirilen hücrelerden RNA polimeraz toplanmasını öneririz. RNA polimerazın herhangi bir bakteriden arındırılmasında, büyüme hızının aktif RNA polimerazın saflaştırılmasında önemli bir faktör olduğu belirtilmiştir. RNA polimerazlar post-translasyonel modifikasyonları biriktirebilir ve büyümenin durağan fazında inhibitör transkripsiyon faktörleri ile ilişkili olabilir31. Sabit faza yetiştirilen B. burgdorferi kültürlerinden yüksek miktarda aktif RNA polimerazı saflaştırmayı başaramadık. Afinite kromatografisi yaklaşımı, fiziksel ayırma yaklaşımı32 ile karşılaştırıldığında, B. burgdorferi'den saflaştırma için de faydalıdır, çünkü organizma kültürde düşük yoğunluğa ulaşır ve büyük miktarlarda hücre kültürü biriktirmek nispeten maddi yoğundur.

Diğer bakteriyel RNA polimerazların saflaştırılması sırasında, sigma faktörleri saflaştırma yöntemine ve koşullarına bağlı olarak önemli miktarlarda birlikte saflaşabilir33,34,35,36. Sigma faktörlerinin birlikte saflaştırılması, alternatif sigma faktörlerini, modifiye sigma faktörlerini veya sigma faktörlerinin eksikliğini kullanarak aşağı akış deneylerini sınırlayabilir. Ayrıca, temizlik sigma faktörü RpoD ile takviye, sigma faktörü37'nin ilk birlikte saflaştırılmasından bağımsız olarak aktiviteyi tespit etmek için faydalıdır. Sigma faktörünü RNA polimeraz çekirdeğinden ayırma esnekliği nedeniyle, sigma faktörlerinin burada özetlenen His-afinite kromatografisi saflaştırma koşulları altında birlikte saflaştırılmamasının avantajlı olduğunu düşünüyoruz. Saflaştırma koşullarının, RpoD içeren daha sağlam ve aktif holoenzimler elde etmek için değiştirilmesi mümkündür. Örneğin, tuz konsantrasyonlarının çoklu alt birim enzimlerin stabilitesini etkilemesi muhtemeldir ve imidazol konsantrasyonunun B. burgdorferi RNA polimeraz kompleksinin stabilitesi veya iki değerli katyon katılımı üzerindeki etkisi de bilinmemektedir.

B. burgdorferi RNA polimeraz enzimatik aktivitesi, mevcut iki değerli katyonların tipine ve miktarına duyarlıdır24. Manganezin maksimum RNA polimeraz aktivitesi için gerekli olduğunu ve magnezyumun aktiviteye daha az katkıda bulunduğunu gördük. Sudaki kirletici iyonlar, RNA polimeraz enzimatik aktivitesine yüksek miktarda değişkenlik ekler. Sonuç olarak, moleküler biyoloji sınıfı, HPLC sınıfı ve az sayıda metal iyonu bulunan metal analiz sınıfıH2O gibi oldukça saf su, burada özetlenen protokolde daha yüksek RNA polimeraz aktivitesi için gereklidir. RNA polimerazlar ayrıca pH'a duyarlıdır ve saflaştırma sırasında bir indirgeme ortamı gerektirir27. Değişmiş pH veya BME'nin indirgeyici ajan olarak kullanılması, inaktif RNA polimeraz ile sonuçlanmıştır. Ticari olarak temin edilebilen E. coli RNA polimerazını, in vitro transkripsiyon tahlillerinin24 uygun şekilde yapılmasını sağlamak için bir kontrol olarak kullanmanızı öneririz. E. coli RNA polimeraz, nükleotidlerin yaşayabilirliğinin, şablon yapım yönteminin, radyoetiket birleştirmenin, RNA ayrımının ve sinyal algılama yönteminin test edilmesine izin verecektir. Bununla birlikte, B. burgdorferi RNA polimerazın E. coli'ye kıyasla spesifik iki değerli katyon, tampon ve promotör gereksinimlerine sahip olduğu belirtilmelidir.

İn vitro transkripsiyon reaksiyonları için çeşitli tespit yöntemleri mevcuttur. Boya birleştirme ve moleküler beacon testleri, radyoetiket tespit yöntemi38,39'a yaygın alternatiflerdir. Radyoaktif işaretli nükleotid katılımı şu anda en hassas RNA tespit yöntemidir. Alternatif analizler, radyoetiket analizlerine kıyasla ölçülebilir sinyal seviyelerine ulaşmak için daha fazla RNA polimeraz gerektirir. Ek olarak, boya birleştirme ve moleküler işaret yöntemleri tipik olarak sinyallerin hatalı olması için daha fazla yola sahiptir. Örneğin, DNaz kontaminasyonu, moleküler işaretlerin hedeflerinin yokluğunda bir sinyal yaymasına neden olabilir. Radyoetiket birleştirme kullanılarak, B. burgdorferi RNA polimeraz enziminin nispi aktivitesi, RNA polimeraz enzimleri ile yapılan ilk deneylere uygun olan düşük seviyelerde bile tespit edilebilir.

Reaksiyona dahil edilen B. burgdorferi RNA polimeraz enziminin konsantrasyonu spektrofotometri ile standartlaştırılırken, bu ölçüm bir değişkenlik kaynağı olabilir. RNA polimerazların spesifik aktivitesi, toplam protein karışımı40'ın bir parçası olan tam olarak oluşturulmuş aktif holoenzimlerin sayısına bağlı olabilir. Örneğin, sonuçlarımızda bildirilen 50 nM RNA polimerazın molar miktarı spektrofotometri ile belirlendi, ancak alt birim miktarlarının kantitatif batı lekelenmesi ile analizi, RpoA alt biriminin potansiyel RNA polimeraz holoenzimlerinin sayısında sınırlayıcı bir bileşen olduğunu ve karışımımızda maksimum 21 nM tam olarak oluşturulmuş RNA polimerazın mümkün olduğunu ortaya koydu24. RNA polimerazdaki ve in vitro transkripsiyon reaksiyonunun diğer bileşenlerindeki partiden partiye varyasyonu kontrol etmek için her zaman deneyler yapılmalıdır.

Şekil 5'te gösterilen temsili deneyimizde, RpoD seviyeleri değiştirildi ve RpoD ile tespit edilen sinyal arasında doğrusal bir ilişki gösterildi. İn vitro transkripsiyon, sunulan deneysel şablon kullanılarak kolayca değiştirilebilen çok yönlü bir yöntemdir (Tablo 4). Örneğin, alternatif sigma faktörleri veya alternatif DNA şablonları kolayca test edilebilir24. Alternatif şablonlar, üst sarılmış ve metillenmiş DNA özelliklerini tanıtmak için PCR veya hücrelerden saflaştırılmış plazmid tarafından üretilen farklı promotör bölgeleri içerebilir. Belirli bir RpoD, RNA polimeraz ve şablon seviyesi için, bir promotör23'ten aktivitenin inhibisyonunu veya arttırılmasını görmek için bir transkripsiyon faktörünün farklı seviyeleri eklenebilir. İn vitro transkripsiyon reaksiyonu içindeki bileşen ilavesinin sırası ve molar oranlar, reaksiyon başlangıcından önce transkripsiyon başlatma komplekslerinin oluşacağı şekilde değiştirilebilir; Bu reaksiyonlar transkripsiyon başlatma40 yerine transkripsiyon uzamasını ölçebilir. İn vitro transkripsiyon testi, B. burgdorferi biyolojisine yönelik çeşitli araştırmalara uyacak şekilde değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma Creighton Üniversitesi Sağlık Bilimleri Stratejik Yatırım Fonu Fakülte Geliştirme Hibesi ile desteklenmiştir. B. burgdorferi RpoC-His10X suşu Montana Üniversitesi'nden Dr. D. Scott Samuels tarafından nazikçe sağlanmıştır. Maltoz bağlayıcı protein etiketli rpoD alelini kodlayan pMAL-C5X plazmidini barındıran E. coli suşu, Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH'den Dr. Frank Gherardini tarafından nazikçe sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 185 Borrelia Borreliella in vitro transkripsiyon RNA polimeraz RpoD RpoC
<em>Borreliella</em> (<em>Borrelia</em>) <em>burgdorferi In Vitro</em> Transkripsiyon Tahlillerinin Temel Bileşenleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyle, W. K., Sorensen, H. N.,… More

Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter