Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

Este procedimento baseia-se em plantas que expressam GFP em tipos celulares específicos, os quais podem então ser isolados do restante das células vegetais utilizando a triagem celular ativada por fluorescência ou FACS. Este exemplo utiliza duas linhagens marcadoras que expressam em tipos celulares específicos de Arabidopsis. Plântulas de raiz de Arabidopsis são cultivadas em bandejas fito ou em placas de ágar.

As raízes são colhidas e tratadas com enzimas digestoras da parede celular. Após uma hora, a solução é filtrada para remover detritos grandes. Em seguida, a solução é centrifugada e o sobrenatante é removido.

Os protoplastos positivos para GFP são subsequentemente separados por FACS. O material classificado pode ser usado para análises específicas de tipo celular, como perfis transcricionais em todo o genoma. Olá, sou Basian Barman do laboratório de Ken Birnbaum do Departamento de Biologia da Universidade de Nova York.

Hoje vamos mostrar um procedimento para classificação de células por ativação de fluorescência de protoplastos vegetais. Neste exemplo, vamos separar dois tipos celulares específicos na raiz de Arabidopsis. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar perfis transcricionais específicos de tipos celulares.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, cultive plântulas do tipo selvagem, bem como plântulas que expressem GFP de forma específica em determinados tipos celulares. O promotor scarecrow que dirige a expressão de GFP marca a endoderme radicular e o centro de quiescência em um grupo de plântulas.

E em outro grupo, o centro de quiescência da raiz é marcado pelo promotor walks five que expressa GFP. As plântulas são cultivadas hidroponicamente em placas FIA sobre um filtro de náilon, o que permite que as raízes cresçam através do filtro e penetrem no meio de crescimento. Alternativamente, as plantas podem ser cultivadas sobre uma malha de náilon e placas verticais de ágar 1%.

Além de auxiliar na colheita das raízes, os filtros permitem a transferência em massa das plântulas para novas bandejas fito ou placas de ágar, onde podem ser suplementadas com um catalisador de interesse. Isso pode ser feito para estudar respostas transcricionais específicas de tipos celulares a nutrientes, hormônios ou tratamentos de estresse. Verifique ao microscópio de fluorescência para confirmar que o marcador fluorescente está sendo expresso conforme esperado.

Certifique-se de que o padrão de expressão do marcador seja consistente sob as condições de tratamento aplicadas, pois ele pode mudar como resultado do tratamento. Prossiga para colher e preparar os protoplastos. Comece preparando a solução de protoplastos.

Combine 1,25% peso por volume de celulase, 0,3% peso por volume de maser zyme, 0,4 molar de D-manitol, 20 milimolar de MES e 20 milimolar de KCl em água desmineralizada e ajuste o pH para 5,7 com tris HCl 1 molar em pH 7,5. Esta solução será levemente turva. Em seguida, aqueça a solução a 55 graus Celsius por 10 minutos.

A solução ficará límpida; deixe esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, adicione BSA a 0,1% peso por volume, cloreto de cálcio 10 milimolar e beta-mercaptoetanol 5 milimolar. Colete plântulas com uma semana de idade de uma bandeja de fito. No caso da linhagem GFP scarecrow ou de oito placas de plântulas GFP 5G com quatro dias de idade, raspe as raízes da malha de náilon com um bisturi e, então, depositá-las em um recipiente com solução de protoplastos.

Utilize aproximadamente 10 mililitros de solução de protoplastos para cada 1500 plântulas. Agite suavemente os frascos a 75 rpm, em temperatura ambiente, durante uma hora. Um tempo de incubação mais longo pode aumentar o rendimento de protoplastos, mas também intensificará o efeito dos próprios protoplastos na expressão gênica.

Agora que os protoplastos foram liberados, utilize um filtro de células de 40 micrômetros para filtrar a solução e dividir a suspensão de protoplastos entre tubos cónicos de 15 ml. É importante obter uma suspensão limpa de protoplastos, com o mínimo de debris possível, para evitar entupimento do facts e minimizar o tempo necessário para classificar as células. Centrifugue os tubos em uma centrífuga de rotor pendular a 500 ×g por 10 minutos à temperatura ambiente.

Observe que a velocidade de centrifugação depende da constituição da seção vegetal que fornece os protoplastos e da quantidade de detritos celulares produzidos durante o tratamento enzimático. Após a centrifugação, remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet contendo os protoplastos no pequeno volume restante da solução de protoplastos. Por fim, conte os protoplastos utilizando um hemocitômetro e determine sua densidade para calcular o rendimento e definir os parâmetros do experimento.

Após a contagem, inspecione os protoplastos. Verifique sua integridade, o nível de expressão de GFP e a presença de debris celulares contaminantes. Em seguida, prossiga para fax.

Se não for prosseguir diretamente para fax. Os protoplastos podem ser lavados, ressuspendidos e armazenados em uma solução de incubação, como a solução de protoplaqueamento sem as enzimas adicionadas ou a solução W cinco. Ligue o classificador de células e o computador da estação de trabalho.

Aqui utilizamos um fria fabricado pela Becton Dixon and Company. Utilize um XPBS como fluido de envolvimento e execute o procedimento de inicialização do sistema fluidico. Instale um bico de 100 micrômetros e defina uma pressão de envolvimento de 20 PSI.

Configure um fluxo estável e calibre o atraso da gota. Observe que a calibração não é mostrada neste procedimento. Suspensões de protoplastos com uma densidade de até 10 milhões de células por mililitro podem ser separadas com sucesso.

Para evitar a sedimentação dos protoplastos, utilize a opção de agitação da amostra no facts. Se o entupimento do facts for um problema, existem três etapas possíveis de disparo. Primeiro, realize uma lavagem reversa da linha de amostra.

Segundo, dilua a suspensão de protoplastos para reduzir a densidade. Terceiro, purifique a solução de protoplastos repetindo a etapa de filtração após a centrifugação e ressuspensão. Apenas quatro parâmetros são utilizados para distinguir protoplastos GFP positivos de protoplastos GFP negativos e debris celular após excitação por um laser de 488 nanômetros: dispersão para frente é um indicador do tamanho das partículas, dispersão lateral como indicador da granularidade das partículas.

Emissão em 530 nanômetros como medida de fluorescência verde e emissão em 610 nanômetros como medida de autofluorescência no espectro vermelho. Comece configurando um gráfico de dispersão de espalhamento para frente versus espalhamento lateral. Aplique a configuração de tensão para que os eventos medidos fiquem centralizados no gráfico.

PROTOPLASTOS GFP positivos podem ser diferenciados pela sua maior razão entre emissão verde e vermelha em comparação com eventos com autofluorescência. Configure apenas um gráfico de dispersão com fluorescência verde versus autofluorescência no espectro vermelho. Aplique ajustes de voltagem de forma que os eventos medidos gerem uma única população diagonal no gráfico.

Ao observar uma suspensão de protoplastos do tipo selvagem, os PROTOPLASTOS positivos para GFP devem produzir uma população distinta de eventos fluorescentes verdes nunca observada em amostras do tipo selvagem. Ajuste as restrições de compensação para corrigir a sobreposição espectral entre a fluorescência verde e a autofluorescência no espectro vermelho. Utilizando uma suspensão de PROTOPLASTOS positivos para GFP, configurações adequadas de restrições de compensação permitirão uma melhor separação dos protoplastos positivos para GFP dos protoplastos negativos para GFP e dos detritos, permitindo definir um gate para identificar eventos positivos para GFP.

É aconselhável incluir PROTOPLASTOS não GFP toda vez que você preparar um experimento de separação para auxiliar na definição dos limites da porta. Por fim, defina um valor limite de corte para dispersão para a frente, a fim de excluir pequenos detritos da análise. A visualização dos eventos positivos para GFP no gráfico de dispersão para a frente versus dispersão lateral ajudará a determinar onde o limite deve ser definido.

Os parâmetros configurados neste primeiro ensaio podem ser reutilizados para análises futuras. Serão necessários pequenos ajustes para o uso diário do FATS. Para extração de RNA, prepare tubos de coleta contendo tampão de extração de RNA, usando como orientação um volume de separação de até 100 microlitros para 350 microlitros de tampão de extração.

20.000 eventos de separação resultam em um volume total de separação de aproximadamente 100 microlitros. Agora que os parâmetros do fax e os modos de operação estão configurados e os tubos de coleta estão prontos, inicie a separação dos protoplastos quando a separação estiver concluída. Misture os tubos de coleta da amostra, pois a suspensão celular pode acumular-se no topo; tão poucos quanto 500 eventos separados podem ser utilizados para análise em microarranjo após extração de RNA e amplificação de DNAc.

Aqui utilizamos o kit de microextração RNEZ, o sistema de amplificação de RNA WT Ovation PICO e o módulo de biotina CD NA Fl Ovation V dois. Abaixo estão resultados típicos de citometria de fluxo para protoplastos derivados de plântulas não GFP Scarecrow, GFP e W 5G FP. Cem mil eventos são apresentados em cada gráfico de dispersão, com a fluorescência verde no eixo X versus a fluorescência vermelha no eixo Y. Os eventos que caem dentro do gate de classificação GFP são destacados em verde.

Este é um resumo do rendimento típico de protoplastos obtidos de plântulas expressando GFP sob o promotor scarecrow, que marca a endoderme radicular e o centro de quiescência, ou walks 5G FP, que marca o centro de quiescência radicular. Há menos células no centro de quiescência radicular em comparação com a endoderme radicular. Portanto, apesar de se iniciar com um maior número de protoplastos, o rendimento de células expressando GFP é menor na separação com walks 5G FP em comparação com a separação com scarecrow GFP. Os resultados mostrados aqui são típicos das extrações de RNA realizadas em amostras triplicadas.

Cada amostra corresponde ao RNA extraído de 10.000 eventos. O RNA extraído é analisado em um bioanalisador, mostrando os picos ribossomais para as amostras de GFP do scarecrow na parte superior e as amostras de walks 5G FP na parte inferior. O RNA extraído pode ser utilizado posteriormente para análise de microarray. Este gráfico de dispersão dos níveis de expressão log dois demonstra a semelhança entre duas réplicas.

Acabamos de mostrar como realizar a classificação de protoplastos vegetais ativada por fluorescência para análise específica de tipo celular. Esta técnica é aplicável a muitos tecidos e espécies vegetais diferentes. Rendimentos elevados com baixo teor de detritos e protoplastos saudáveis proporcionarão melhores resultados em análises transcricionais, bem como em outras análises.

Lembre-se também de que é importante manter as condições de crescimento do material vegetal idênticas para a comparação entre as amostras separadas. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.