Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

Um método para isolar tipos específicos de células a partir de material vegetal é demonstrada. Esta técnica emprega linhas marcador transgênicos expressando proteínas fluorescentes em tipos de células particular, celular dissociação e classificação de fluorescência celular ativado. Além disso, uma instalação de crescimento é estabelecido aqui que facilita o tratamento de

Este procedimento depende de plantas que expressam GFP em tipos específicos de células, que podem então ser isoladas do resto das células vegetais usando classificação de células ativadas por fluorescência ou fatos. Este exemplo usa duas linhas marcadoras expressas em tipos específicos de células da Arabidopsis. As mudas de raiz de Aliana são cultivadas em bandejas de fito ou em placas de ágar.

Suas raízes são colhidas e tratadas com enzimas de digestão da parede celular. Após uma hora, a solução é filtrada para remover detritos grandes. A solução é então centrifugada e o sobrenadante é removido.

Os protoplastos positivos para GFP são posteriormente separados por fax. O material classificado pode ser usado para análise específica do tipo de célula, como perfis transcricionais de todo o genoma. Olá, sou Basian Barman do laboratório de Ken Birnbaum no Departamento de Biologia da Universidade de Nova York.

Hoje mostraremos um procedimento para classificação de células ativadas por fluorescência de protoplastos vegetais. Neste exemplo, classificaremos dois tipos específicos de células na rota Arabidopsis. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar perfis transcricionais específicos do tipo de célula.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, cultive mudas do tipo selvagem, bem como mudas que tenham expressão específica de GFP do tipo de célula. O promotor do espantalho que impulsiona a GFP marca a endoderme da raiz e o centro quiescente em um grupo de mudas.

E em outro grupo, o centro quiescente da raiz é marcado pelas caminhadas cinco promotores que conduzem a GFP. As mudas são cultivadas hidroponicamente e bandejas FIA em cima de um filtro de náilon, que permite que as raízes cresçam até o meio de crescimento. Alternativamente, as plantas podem ser cultivadas em cima de uma malha de nylon e placas de ágar 1% posicionadas verticalmente.

Além de ajudar na colheita das raízes, os filtros permitem que as mudas sejam transferidas em massa para novas bandejas de fito ou placas de ágar, onde podem ser complementadas com um catalisador de interesse. Isso pode ser feito para estudar as respostas transcricionais específicas do tipo de célula a nutrientes, hormônios ou tratamentos contra o estresse. Verifique ao microscópio de fluorescência se o marcador fluorescente é expresso conforme o esperado.

Certifique-se de que o padrão de expressão do marcador seja consistente nas condições de tratamento aplicadas, pois pode mudar como resultado do tratamento. Prossiga para a colheita e prepare os protoplastos. Comece preparando a solução de protoplastos.

Combine 1,25% de peso por volume de celulase 0,3% de peso por volume, maser zyme 0,4 molar D manitol 20 milimolar, MES e 20 milimolar KCL em água desmineralizada e ajuste o pH para 5,7 com um molar tris HCL em pH 7,5. Esta solução será um pouco turva. Em seguida, aqueça a solução a 55 graus Celsius por 10 minutos.

A solução ficará clara, deixe esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 0,1% de peso por volume BSA 10 milimolares de cloreto de cálcio e cinco milimolares beta me capto etanol colha mudas de uma semana de idade de uma bandeja de fito. No caso do espantalho da linha GFP ou oito placas de quatro dias de idade caminha mudas 5G FP. Raspe as raízes da malha de náilon com um bisturi e deposite-as em um recipiente com uma solução de protoplastos.

Use aproximadamente 10 mililitros de solução de protoplastos por 1500 mudas. Agitar suavemente os balões a 75 rpm à temperatura ambiente durante uma hora. Um tempo de incubação mais longo pode aumentar o rendimento dos protoplastos, mas também aumentará o efeito dos próprios protoplastos na expressão gênica.

Agora que os protoplastos são liberados, use um filtro de células de 40 micrômetros para filtrar a solução e divida a suspensão dos protoplastos entre tubos cônicos de 15 mil. É importante gerar protuberâncias limpas em suspensão sem muitos detritos para evitar o entupimento dos fatos e minimizar o tempo necessário para classificar as células. Centrifugue os tubos em uma centrífuga de balde oscilante a 500 G por 10 minutos em temperatura ambiente.

Observe que a velocidade de centrifugação depende da constituição da seção da planta que produz os protoplastos e da quantidade de detritos celulares produzidos durante o tratamento enzimático. Após a centrifugação, remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet contendo os protoplastos no pequeno volume de solução de protoplastos restante. Finalmente, conte os protoplastos usando um hemocitômetro e determine sua densidade para calcular o rendimento e decidir sobre os parâmetros de execução dos fatos.

Após a contagem, inspecione os protoplastos. Verifique sua integridade, o nível de expressão de GFP e o conteúdo de detritos celulares contaminantes. Em seguida, prossiga para o fax.

Se não estiver indo diretamente para o fax. Os protoplastos podem ser lavados, ressuspensos e armazenados em uma solução de incubação, como solução protoplating, sem as enzimas adicionadas ou solução W five. Ligue o classificador de células e o computador da estação de trabalho.

Aqui usamos uma fria fabricada pela Becton Dixon and Company. Use um XPBS como fluido de bainha e execute o procedimento de inicialização fluídica. Instale um bico de 100 micrômetros e defina uma pressão de bainha de 20 PSI.

Configure um fluxo de fluxo estável e calibre o atraso de queda. Observe que a calibração não é mostrada neste procedimento. Suspensões de protoplastos com densidade de até 10 milhões de células por mil podem ser classificadas com sucesso.

Para evitar a sedimentação dos protoplastos, use a opção de agitação da amostra nos fatos. Se o entupimento dos fatos for um problema, existem três etapas possíveis de filmagem. Primeiro, execute uma retrolavagem da linha de amostra.

Em segundo lugar, dilua a suspensão de protoplastos para reduzir a densidade. Terceiro, limpe a solução de protoplastos repetindo a etapa de filtração após a centrifugação e suspensão do resus. Apenas quatro parâmetros são usados para distinguir protoplastos positivos GFP de protoplastos negativos GFP e detritos celulares após excitação por um laser de 488 nanômetros, a dispersão direta é um indicador do tamanho da partícula, a dispersão lateral como um indicador da granularidade da partícula.

Emissão a 530 nanômetros como medida de fluorescência verde e emissão a 610 nanômetros como medida de autofluorescência do espectro vermelho. Comece configurando um gráfico de pontos para dispersão direta versus dispersão lateral. Aplique a configuração de tensão para que os eventos medidos sejam centralizados no gráfico.

Os PROTOPLASTOS positivos para GFP podem ser distinguidos por sua maior proporção de emissão verde para vermelha em comparação com eventos com autofluorescência. Configure apenas um gráfico de pontos com fluorescência verde versus autofluorescência de espectro vermelho. Aplique as configurações de tensão de forma que os eventos medidos dêem origem a uma única população diagonal no gráfico.

Ao olhar para uma suspensão de protoplastos do tipo selvagem, os PROTOPLASTOS positivos para GFP devem produzir uma população clara de eventos fluorescentes verdes nunca vistos em amostras do tipo selvagem. Defina restrições de compensação para ajustar a sobreposição espectral entre fluorescência verde e autofluorescência de espectro vermelho. Usando uma suspensão de PROTOPLASTS positivos para GFP, as configurações adequadas de restrições de compensação permitirão uma melhor separação dos protoplastos positivos para GFP dos protoplastos não GFP e os detritos configuram um portão para identificar eventos positivos para GFP.

É aconselhável levar PROTOPLASTOS não GFP cada vez que você preparar um experimento de classificação para ajudar a definir os limites do portão. Por fim, defina um limite de dispersão direta para deixar pequenos detritos fora da análise. A visualização de eventos positivos de GFP no gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral ajudará a determinar onde o limite deve ser definido.

Os parâmetros configurados nesta execução inicial de fatos podem ser reutilizados para classificações futuras. Pequenos ajustes serão necessários para o uso diário dos fatos. Para extração de RNA, prepare tubos de coleta contendo tampão de extração de RNA, no máximo use um volume de classificação de 100 microlitros para um tampão de extração de 350 microlitros como guia.

20.000 eventos de classificação produzem um volume total de classificação de aproximadamente 100 microlitros. Agora que os parâmetros de fax e os modos de operação estão definidos e os tubos de coleta estão prontos, comece a classificar os protoplastos quando a classificação estiver concluída. Misture os tubos de coleta de amostras, pois a suspensão celular pode se acumular no topo, apenas 500 eventos classificados podem ser usados para análise de microarray após extração de RNA e amplificação de CD NA.

Aqui usamos o kit de microextração RNEZ, o sistema de amplificação de RNA WT ovation PICO e o módulo de biotina CD NA de ovação V dois. Aqui estão os resultados típicos de fax para protoplastos derivados de mudas não GFP Scarecrow, GFP e W 5G FP 100.000 eventos são apresentados em cada gráfico de pontos de fluorescência verde no eixo x versus fluorescência vermelha. No eixo Y, os eventos que se enquadram no portão de classificação GFP são destacados em verde.

Este é um resumo do rendimento típico dos protoplastos das mudas que expressam o espantalho GFP marcando a endoderme radicular e o centro quiescente ou caminha 5G FP marcando o centro quiescente radicular. Há menos células no centro quiescente da raiz em comparação com a endoderme da raiz. Portanto, apesar de começar com mais protoplastos, o rendimento das células que expressam GFP é menor no tipo 5G FP de caminhadas em comparação com o tipo GFP do espantalho mostrado aqui são resultados típicos de extração de RNA de amostras triplicadas.

Cada amostra corresponde ao RNA extraído de 10.000 eventos. O RNA extraído é analisado em um bioanalisador mostrando os picos ribossômicos para as amostras GFP do espantalho no topo e as amostras de 5G FP abaixo do RNA extraído podem ser usadas posteriormente para análise de microarray. Este gráfico de dispersão de log dois níveis de expressão demonstra a semelhança entre duas replicações.

Acabamos de mostrar como realizar a classificação de células ativadas por fluorescência de protoplastos de plantas para análise específica do tipo de célula. Esta técnica é aplicável a muitos tecidos e espécies vegetais diferentes. Bons rendimentos com baixo teor de detritos e protoplastos saudáveis darão melhores resultados a jusante em análises transcricionais e outras.

Lembre-se também de que é importante manter as condições de crescimento do material vegetal idênticas para comparação entre as amostras classificadas. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.