Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

Questo video descrive un metodo per generare e utilizzare un microarray polimerico utilizzando una tecnica di fotopolimerizzazione su chip. I primi vetrini sono rivestiti per immersione in poliidrossietil, metacrilato o FEMA per produrre un substrato a basso fissaggio. I monomeri vengono miscelati a rapporti variabili per produrre una libreria di soluzioni monomeriche.

Le soluzioni vengono trasferite in un formato di vetrino utilizzando un dispositivo di stampa robotizzato e polimerizzate con irradiazione UV. Il monomero polimerizza e il solvente viene estratto sotto vuoto. Dopo la caratterizzazione della superficie ad alto rendimento, i microarray possono essere utilizzati per lo screening delle prestazioni dei materiali, come i saggi di attacco batterico.

L'analisi dei dati di attacco è un passo avanti verso la scoperta di nuovi biomateriali che evidenziano l'utilità del formato microarray polimerico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti in cui viene studiata la risposta biologica di diversi materiali, un materiale alla volta, è lo screening parallelo di centinaia di materiali, che possono essere facilmente manipolati su un singolo vetrino. Questa tecnica può essere facilmente adattata a vari saggi biologici, come lo screening di materiali che resistono all'attaccamento batterico o supportano l'espansione delle cellule staminali.

Questa tecnica ha contribuito a scoprire materiali con potenziali applicazioni per supportare l'espansione delle cellule staminali potenti per la medicina rigenerativa. Siamo anche molto entusiasti della recente scoperta di materiali che resistono all'attaccamento batterico con il potenziale di ridurre l'insorgenza di infezioni associate ai dispositivi medici. In generale, gli utenti che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a ottimizzare le condizioni necessarie per stampare un microarray perché è difficile prevedere le condizioni ottimali.

Sbagliare anche piccoli dettagli può portare a matrici non utilizzabili. È inoltre essenziale considerare quale ceppo batterico e la condizione colturale verranno utilizzati perché l'attaccamento e la morfologia del biofilm sono specifici della specie e del mezzo e possono quindi variare considerevolmente. Qui utilizziamo l'aerogeno come organismo modello e il mezzo chimico definito per un saggio di attacco ben controllato.

I nostri collaboratori del MIT hanno avuto per la prima volta l'idea di questo metodo attraverso il confronto con microarray di DNA e proteine. Questi sono ben consolidati per esplorare i rispettivi spazi combinatori biologici. Dan e Bob si sono resi conto che esisteva uno spazio di combinatore chimico simile che doveva essere esplorato da materiali che dimostrassero che una procedura sarà Andrew Hook e Chen Chang borsisti post-dottorato nel nostro progetto finanziato dal trust di benvenuto Inizia questa procedura preparando un fondo a basso attaccamento.

Si tratta di una superficie che resiste all'attaccamento di biomolecole, come proteine e cellule. Pesare due grammi di poliidrossietilmetacrilato o FEMA in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi portare il volume fino a 50 millilitri con il 95% di etanolo in acqua.

Quindi posizionare il tubo in un atore per circa 24 ore o fino a quando il FEMA non è completamente solubilizzato, tenendo la luce di vetro con una pinzetta. Immergere in vetro funzionale epossidico. Inserire la soluzione FEMA per averne tutti tranne cinque millimetri.

I gruppi epossidici formano legami covalenti con il rivestimento FEMA. La parte non rivestita può fungere da controllo positivo per un periodo di un secondo. Estrarre il vetrino dalla soluzione FEMA, quindi capovolgere il vetrino e posizionarlo in posizione quasi orizzontale per asciugarlo.

Una volta che il vetrino è asciutto, posizionarlo in un supporto per vetrini. Lasciare i vetrini rivestiti FEMA in condizioni atmosferiche per una settimana per consentire la completa evaporazione del solvente. Successivamente, per preparare le soluzioni monomeriche, pipettare cinque microlitri di soluzione fotoiniziatrice e 15 microlitri di monomeri solubili di metacrilato acrilato dimetilformammide in una piastra sorgente a 384 pozzetti.

Un volume totale di 20 microlitri è ideale per la formazione di macchie. Ora che le soluzioni sono state generate, per generare il microarray viene utilizzato un robot di stampa a contatto con uno stadio X, Y, Z. Il robot utilizza perni scanalati di 220 micrometri di diametro che contengono fessure che fungono da serbatoi per il trasferimento della soluzione.

Iniziare posizionando gli spilli e il supporto degli spilli in un atomizzatore contenente clorometano per 10 minuti. Quindi, dopo aver lasciato asciugare i perni, riattaccare il supporto alla testina di stampa. Quindi, caricare i perni nel supporto.

Quindi caricare 10 vetrini per la blotting e vetrini rivestiti FEMA nel robot. In genere su ogni vetrino vengono stampati tre array di replica. Quindi, utilizzando un tubo, collegare la stazione di lavaggio del robot a una bottiglia contenente 2,5 litri di dimetilformammide fresca.

Caricare la piastra contenente la soluzione monomerica nel robot. Riempi l'intera camera del robot con Argonne per ridurre il livello di ossigeno al di sotto di 2000 PPM. A questo basso livello di polimerizzazione, i radicali non devono essere spenti dall'ossigeno.

Utilizzando un dispositivo di regolazione dell'umidità, impostare l'umidità da mantenere tra il 30 e il 40% all'interno della camera del robot, compresa l'umidità che consente al FEMA di gonfiarsi, consentendo al polimero formato di compenetrare lo strato FEMA e rimanere fisicamente intrappolato sulla superficie. Per avviare la tiratura, premere vai sul software con il computer associato. I perni si abbasseranno quindi nelle soluzioni monomeriche a una velocità di 25 millimetri al secondo.

Quindi verranno tenuti in soluzione per 2,5 secondi e si ritireranno a una velocità di 25 millimetri al secondo. Successivamente, l'estremità del perno viene portata a contatto con i vetrini FEMA erogando circa 2,4 nanolitri di soluzione dalla parte trapuntata del perno. Il tempo totale di contatto per ogni contatto è di 10 millisecondi e la velocità di avvicinamento e ritiro è di 175 millimetri al secondo.

I perni vengono quindi tamponati entrando ripetutamente in contatto con i vetrini per rimuovere la soluzione monomerica dall'esterno del perno. La sequenza di blotting utilizzata consiste in 33 contatti con un vetrino pulito. Le prime quattro posizioni faranno rispettivamente 10, 5, 4 e tre contatti.

Le successive quattro posizioni effettueranno due contatti e le ultime tre posizioni effettueranno un contatto dopo la stampa. I perni vengono lavati in un bagno di flusso di DMF con agitazione per 30 secondi. Contemporaneamente, i vetrini stampati vengono irradiati con una sorgente UV a onde corte a 365 nanometri a una densità di 30 millivolt per centimetro quadrato.

Una volta completato il lavaggio e l'irradiazione, viene stampata la diapositiva successiva. Se la stampa sembra avere successo, irradiare gli array con UV a 365 nanometri per altri 10 minuti. Gli array appena stampati vengono posti in un forno a vuoto impostato a meno di 50 milli giri per una settimana per rimuovere i monomeri e i solventi non polimerizzati dopo la stampa e l'estrazione sotto vuoto.

Il successo della polimerizzazione delle macchie polimeriche può essere valutato mediante semplice microscopia ottica per identificare eventuali morfologie anomale delle macchie, tipicamente le macchie dovrebbero apparire circolari e uniformi come mostrato in questa figura a sinistra. La probabile causa di un cambiamento nella geometria è un perno danneggiato o sporco o un contaminante di polvere nelle soluzioni monomeriche. Se ciò accade, il processo dovrà essere ripetuto per un piccolo numero di combinazioni di monomeri.

Si possono vedere macchie deformi, ad esempio, una macchia centrale con un satellite di piccole macchie mostrate a destra o una forma di uovo fritto in cui c'è una macchia centrale sopra una grande macchia più piatta. Ciò può essere causato dalla separazione di fase prima della stampa, relativa alle differenze di viscosità, volatilità dell'idrofilia o tensione superficiale dei monomeri, e suggerisce che la combinazione di monomeri non è compatibile con questo formato. Un'ulteriore mappatura chimica degli spot polimerici è anche una fase importante e talvolta necessaria del controllo di qualità per determinare la distribuzione delle sostanze chimiche dei materiali tra gli spot e la caratterizzazione superficiale ad alta produttività dell'array o HTSC dei microarray generati.

L'utilizzo di questa tecnica consente anche di correlare le prestazioni biologiche con le proprietà fisico-chimiche. Ciò consente lo studio dell'interazione biologica tra i materiali. L'HTSC si avvale di misure dell'angolo di contatto con l'acqua, del tempo di volo, della spettrometria di massa degli ioni secondari, della microscopia a forza atomica e della spettroscopia fotoelettronica a raggi X.

In particolare, TOF sims fornisce un'analisi chimicamente ricca del campione che può essere utilizzata per correlare la risposta cellulare con una porzione molecolare. In alcuni casi, le prestazioni biologiche possono essere previste. Gli spettri TOF SIM dimostrano la dipendenza chimica di un'interazione biologica tra materiali e informano lo sviluppo di materiali HI.

Una volta che la superficie del microarray polimerico è stata caratterizzata, può essere utilizzata per lo studio delle interazioni biologiche. Qui dimostriamo l'uso del microarray nell'esecuzione di un saggio di attacco batterico. Iniziare inoculando 10 millilitri di LB con una singola colonia di pseudomonas marcata con GFP.

L'aerogeno cresce a 37 gradi Celsius con 200 giri/min agitati durante la notte. Misurare l'OD 600 della coltura batterica notturna e diluire la coltura a un OD 600 di 0,01 in 15 millilitri di RPMI 1640. Nel frattempo, lavare i vetrini dell'array e sterilizzare l'acqua distillata per 10 minuti per rimuovere eventuali componenti solubili dagli array, come il monomero non polimerizzato, tutti i legamenti e il solvente.

Quindi asciugare all'aria i vetrini in un armadio per il flusso d'aria. Successivamente, posizionare i vetrini lavati in una capsula di Petri pulita e sterilizzarli con UV per 10 minuti. Quando la coltura batterica è pronta, trasferire il vetrino con l'array in una capsula di Petri e aggiungere 15 millilitri del terreno RPMI 1640 inoculato.

Posizionare un altro vetrino array in una seconda piastra di Petri e aggiungere 15 millilitri di RPMI 1640 sterile come controllo. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 72 ore con agitazione a 60 giri/min dopo l'incubazione. Lavare i vetrini tre volte con 15 millilitri di PBS sterile per cinque minuti a 100 giri/min.

Quindi lavare i vetrini due volte con 15 millilitri di acqua distillata sterile per rimuovere il sale fosfato. Dopo il lavaggio. Lasciare asciugare i vetrini all'aria in una cabina per il flusso d'aria.

Una volta che le diapositive sono asciutte. Devono essere letti da uno scanner fluorescente il prima possibile per evitare il decadimento della GFP utilizzando la tecnologia di imaging e il software appropriati. La fluorescenza dovuta all'adesione batterica viene calcolata sottraendo la fluorescenza dal solo controllo del terreno dal campione inoculato per identificare i materiali che resistono all'adesione batterica.

Sono stati generati microarray e sono stati eseguiti saggi di adesione batterica secondo i metodi descritti in questo video. Come si vede qui, il microarray polimerico contiene materiali con bassa adesione batterica, che hanno una bassa fluorescenza, e un'alta adesione batterica, che hanno un'alta fluorescenza. I tre array mostrati qui sono repliche quando i valori di fluorescenza delle tre repliche vengono mediati e presentati come rappresentazione 3D.

Come mostrato qui, l'interpretazione visiva quantitativa è semplificata. La scala di intensità a destra rappresenta i valori dei dati di fluorescenza. A livello di base, l'identificazione dei materiali con bassa fluorescenza fornisce un mezzo per identificare rapidamente i materiali che soddisfano una specifica applicazione biologica, come resistere all'attaccamento batterico.

Tuttavia, questi risultati possono anche essere combinati con l'HTSC per studiare le correlazioni tra particolari proprietà dei materiali e le loro prestazioni biologiche. Questa analisi può chiarire le relazioni tra struttura e funzione, identificando così i meccanismi alla base dell'interazione biologica con i materiali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e stampare un microarray polimerico e anche avere un'idea del modo in cui i microarray polimerici possono essere utilizzati per sondare la risposta batterica ai materiali.

Una volta padroneggiato, un micro array polimerico può essere stampato in due giorni se eseguito correttamente. La preparazione dei monomeri richiede circa un giorno e la stampa dell'array richiede circa sei ore. Il test di attacco batterico richiede cinque giorni, il che aumenta il tempo per far crescere la coltura di sovrapposizione come inoculare Nell'incubazione della luce a raggi microfonici nella coltura batterica per 72 ore e nel rilevamento della foresta e del segnale utilizzando lo scanner a raggi micro, Ok, mentre si tenta questa procedura, è importante mantenere puliti il perno e i supporti dei perni.

È molto frustrante se a metà di una corsa il perno si blocca in posizione verticale e non può più entrare in contatto con la superficie perché il perno o il supporto del perno non sono stati puliti a sufficienza. Non dimenticare che lavorare con DMF e monomeri tossici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'estrazione dovrebbero sempre essere incluse nella procedura.