Name: Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a determinar o conteúdo de glicogênio em cianobactérias usando hidrólise enzimática seletiva. Este método sensível e específico facilita pesquisas em fisiologia, genética molecular e bioengenharia de cepas selvagens e geneticamente modificadas.

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Os autores reconhecem a Nordic Energy Research (AquaFEED, projeto nº 24), Innovationfonden Dinamarca (Pant Power, projeto nº 12-131844) e Villum Fonden (projeto nº 13363)

1. Preparação <ol><li> Cianobacterias <ol><li> Grow Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C em meio líquido BG11 8 , com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO 2 . Ilumine as culturas continuamente com luz em uma densidade de fluxo fotônico fotossintético de 50 μmol de fotão / m 2 / s. </li><li> Grow Synechococcus sp. PCC 7002 em meio líquido A + 23 (meio BG11 também pode ser usado), com um fornecimento constante de ar suplementado com 1% (v / v) de CO 2 . A temperatura deve ser de 37 ° C. Ilumine as culturas continuamente com luz em uma densidade de fluxo fotônico fotossintético de 150 μmol de fotão / m 2 / s. </li><li> Medir a densidade óptica (OD) da cultura a 730 nm usando uma cuvete com um caminho de luz de 1 cm. Se o valor da OD estiver acima de 0,8, faça diluições apropriadas para obter medições de OD que sejam proporcionais aConcentração de célula e. NOTA: Os protocolos apresentados abaixo são adequados para culturas líquidas, com uma densidade celular correspondente a um valor de OD 730nm de 2 ou superior. Quando as culturas na fase de crescimento exponencial são desejadas, que tipicamente têm um valor de OD 730nm abaixo de 1, concentre a densidade celular por centrifugação e ressuspensão em um tampão ou meio para atingir um valor de OD 730nm de 2 ou superior. </li></ol></li><li> Buffers e reagentes <ol><li> Faça um tampão Tris-HCl 50 mM a pH 8. </li><li> Faça um tampão de acetato de sódio 50 mM a pH 5. </li><li> Faça uma solução de reserva de 8 U / mL de amiloglucosidase em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5. </li><li> Faça uma solução-mãe de 2 U / mL de a-amilase em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5. </li><li> Usando água destilada, soluções padronizadas de formaglucose em concentrações variando entre 0 e 100 μg / mL. </li><li> Prepare o reagente GOD-POD do kit D-Glucose Assay Kit (Formato GODPOD), fConforme as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Determinação do peso seco da célula (opcional) <ol><li> Transferir 2 mL de uma cultura ou uma ressuspensão celular (ver passo 1.1) para um tubo de 2,0 mL e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 5 min. Descarte o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 mL de água e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 0,5 mL de água. </li><li> Transfira a suspensão para uma bandeja de alumínio pré-pesada. Transfira a bandeja para um forno de secagem a 105 ° C para secar durante a noite (aproximadamente 18 h). CRÍTICO: É importante que a bandeja seja manipulada com fórceps para evitar a transferência de material dos dedos. Seque uma bandeja de alumínio vazia pré-pesada nas mesmas condições para determinar qualquer perda de peso das bandejas durante a secagem. </li><li> Após a secagem, retire a bandeja do forno e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente.5 min antes de pesá-lo com uma precisão de 0,0001 g. NOTA: O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênio em uma base celular-seca. </li></ol> 3. Lysis of Cyanobacterial Cells <ol><li> Transfira 1 mL de uma cultura ou uma ressuspensão celular (ver passo 1.1) para um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 6000 xg e 4 ° C durante 10 min. Descarte o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o grânulo em 1 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8 e centrifugar a 6.000 xg e 4 ° C durante 10 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 mL do tampão Tris-HCl. Repita o processo. </li><li> Ressuspender completamente o grânulo em 500 μL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8. CRÍTICO: ressuspenda o sedimento bem para uma lise celular eficiente. Mantenha a ressuspensão no gelo. </li><li> Lyse as células ressuspensas a 4 ° C realizando 30 ciclos de ultra-sonografia, sendo cada ciclo constituído por 30 s a uma frequência de 20 kHz com a amplitude máxima,Seguido por 90 s sem. NOTA: Este método pode lidar eficazmente Synechococcus sp. PCC 7002. <ol><li> Alternativamente, transfira a ressuspensão da célula para um tubo de tampa de rosca e adicione contas de óxido de zircônio ao tubo, seguindo as instruções do fabricante. Coloque o tubo em um homogeneizador de tecido e lise as células a 4 ° C realizando 2 ciclos de batida, cada ciclo consistindo de 5 min na configuração de freqüência de 5. NOTA: Este método pode liar eficientemente Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> Centrifugar o tubo contendo o lisado durante 10 minutos a 6.000 xg e 4 ° C. NOTA: O grânulo deve consistir principalmente em detritos de células grandes. Se houver um número significativo de células ininterruptas, repita o passo 3.4. Mantenha o sobrenadante no gelo. </li><li> Determine a concentração de proteína usando um kit comercial de teste de proteína BCA. NOTA: O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênioEm base de conteúdo protéico. </li></ol> 4. Precipitação de glicogênio <ol><li> Remova a clorofila a partir do lisado celular misturando 900 μL de etanol a 96% (v / v) e 100 μL do sobrenadante do passo 3.5 num tubo de tampa roscada de 1,5 mL. Depois de fechar a tampa, aqueça o tubo a 90 ° C durante 10 minutos usando um bloco de aquecimento de laboratório padrão. </li><li> Incube o tubo sobre gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugue o tubo a 20.000 xg e 4 ° C durante 30 min e remova cuidadosamente o sobrenadante; O sedimento contém glicogênio. Secar levemente a pastilha no ar para remover o excesso de etanol. CRÍTICO: A secagem excessiva do grânulo deve ser evitada, caso contrário torna-se difícil solubilizar no passo 5.1. </li><li> OPCIONAL: Medir a absorvância do sobrenadante obtido no passo 4.3 a 664 nm para determinar o teor de clorofila a . Use um coeficiente de absorção de 84,6 L / g / cm 24 . NOTA: O valor pode ser usado para normalizarE o conteúdo de glicogênio. </li></ol> 5. Determinação da hidrólise enzimática e do glicogênio <ol><li> Solubilizar o grânulo obtido no passo 4.3 em 100 μL de acetato de sódio 50 mM, pH 5, e adicionar 50 μL de 8 U / mL de amiloglucosidase e 50 μL de 2 U / mL de a-amilase. Misture estes materiais bem usando um vórtice. NOTA: A mistura por pipetagem não é recomendada porque a bolacha de glicogênio é viscosa. </li><li> Incubar a mistura a 60 ° C em um bloco de aquecimento durante 2 h para permitir a digestão de glicogênio em moléculas de glicose. </li><li> Centrifugar a amostra a 10 000 xg durante 5 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. </li></ol> 6. Determinação do conteúdo total de glicose usando o Reagente GOD-POD <ol><li> Medir a concentração de glicose no sobrenadante obtido no passo 5.3 usando o reagente GOD-POD. Transfira 100 μL do sobrenadante do passo 5.3 para um poço numa placa de 96 poços. Como um controle negativo,Use 100 μL de acetato de sódio 50 mM, pH 5. Para gerar uma curva de calibração, também mede as soluções padrão de glicose. </li><li> Adicione 150 μL de reagente GOD-POD a cada amostra e rapidamente misture por pipetagem. </li><li> Incubar a placa estaticamente a 25 ° C durante 30 min. Registre o valor de absorvância a 510 nm usando um leitor de placas. </li><li> Calcule a concentração de glicose usando uma curva de calibração obtida a partir dos padrões de glicose. NOTA: A concentração de glicogênio no lisado celular é expressa como a concentração de glicose (μg / mL). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os passos críticos dentro do protocolo são a precipitação de glicogênio e ressuspensão. Após centrifugação após precipitação com etanol, o glicogênio forma uma pastilha translúcida que se adhere vagamente às paredes dos tubos de microcentrífuga. Portanto, ao remover o sobrenadante, é necessário prestar atenção especial para não remover o grânulo. O pellet de glicogênio é pegajoso, e a solubilização pode ser difícil se se dissolver. Note-se que a solubilização completa da pastilha de glicogênio é importante porque a solu...

As cianobactérias acumulam glicogênio como a principal reserva de carboidratos de carbono do CO 2 fixado na luz através da fotossíntese. O glicogênio é um glicano constituído por glucano linear a-1,4-ligado com ramos criados por ligações de glucosilo ligadas a a-1,6. A biossíntese de glicogênio em cianobactérias começa com a conversão de glicose-6-fosfato em ADP-glicose através da ação seqüencial da fosfoglucomutase e da pirofosforilase de ADP-glicose. A fração de glicose em ADP-glucose é transferida para a extremidade não redutora do esqueleto a-1,4-glucano do glicogênio por uma ou mais sintases de glicogênio (GlgA). Posteriormente, uma enzima de ramificação introduz a ligação de glucosilo ligada a a-1,6, que é ampliada para gerar a partícula de glicogênio. No escuro, o glicogênio é dividido por glicogênio fosforilase, enzimas de desmantelamento de glicogênio, α-glucanotransferase e malto-dextrina fosforilase em glicose fosforilada e glicose livre. Esses feed intOu caminhos catabólicos, incluindo a via oxidativa de fosfato de pentose, a via de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólise) e a via Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . O metabolismo de glicogênio em cianobactérias aumentou o interesse nos últimos anos devido ao potencial de cianobactéria se desenvolver em fábricas de células microbianas conduzidas pela luz solar para produzir produtos químicos e combustíveis. O metabolismo do glicogênio pode ser modificado para aumentar o rendimento dos produtos, porque o glicogênio é o maior grupo de carbono flexível dessas bactérias. Um exemplo é a cianobactéria Synechococcus sp. PCC 7002, que foi manipulado geneticamente para produzir manitol; A interrupção genética da síntese de glicogênio aumenta o rendimento de manitol 3 vezes 5 . Outro exemplo é a produção de bioetanol a partir de cargas carregadas com glicogênioYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . O conteúdo de glicogênio celular de tipo selvagem pode ser até 60% do peso seco da célula durante a fome de nitrogênio 6 . Nossa compreensão do metabolismo e regulação do glicogênio também se expandiu nos últimos anos. Enquanto o glicogênio é conhecido por se acumular na luz e ser catabolizado no escuro, a cinética detalhada do metabolismo do glicogênio durante o ciclo diel foi revelada apenas recentemente em Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Além disso, vários genes que afetam a acumulação de glicogênio foram identificados. Um exemplo notável é a descoberta de que a putativa histidina quinase PmgA e o RNA PmgR1 não codificante formam uma cascata regulatória e controlam o acúmulo de glicogênio. Interessantemente, os mutantes de deleção e PMGA pmgR1 acumular duas vezes mais glicogénio como a estirpe de tipo selvagem de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Outros elementos reguladores também são conhecidos por afetar o acúmulo de glicogênio, incluindo o fator de sigma alternativo E e o fator de transcrição CyAbrB2 10 , 11 . À medida que o interesse na regulação do glicogênio e no metabolismo cresce, um modelo detalhado que descreve a determinação do conteúdo de glicogênio é garantido. Vários métodos são usados ​​na literatura. A hidrólise ácida seguida pela determinação do teor de monossacarídeos através de cromatografia líquida de permuta aniónica de alta pressão acoplada a um detector amperométrico pulsado ou a uma determinação espectrométrica após tratamentos com ácido e fenol são métodos amplamente utilizados para aproximar o teor de glicogênio 9 , 10 , 12 , 13 . No entanto, uma cromatografia líquida de permuta de aniões de alta pressãoO instrumento c é muito caro e não discrimina a glicose derivada do glicogênio da derivada de outros glicoconjugados contendo glicose, tais como sacarose 14 , glucosilglicerol 15 e celulose 16 , 17 , 18 , que são conhecidos por se acumularem em algumas espécies de cianobactérias. O método ácido-fenol pode ser realizado utilizando equipamento de laboratório padrão. No entanto, ele usa reagentes altamente tóxicos e não distingue a glicose derivada de diferentes glicoconjugados, nem distingue a glicose de outros monossacarídeos que constituem materiais celulares, como glicolípidos, lipopolissacarídeos e matrizes extracelulares 12 . Notavelmente, o ensaio a quente de ácido-fenol é freqüentemente usado para a determinação do teor total de carboidratos em vez de para a determinação específica do teor de glicose 12 . Enzymatic hyA hidrólise de glicogênio em glicose pela α-amiloglucosidase seguida da detecção de glicose através de um ensaio acoplado a enzima gera uma leitura colorimétrica altamente sensível e específica à glicose derivada de glicogênio. A especificidade pode ser melhorada ainda mais com a precipitação preferencial de glicogênio a partir de lisados ​​celulares pelo etanol 5 , 8 , 19 . Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um ensaio baseado em enzimas do teor de glicogênio em duas das espécies cianobacterianas mais estudadas, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nas variedades de tipo selvagem e mutante. A fim de assegurar a hidrólise eficiente, é utilizado um cocktail de α-amilase e α-amiloglucosidase 8 . A α-amilase de ação endo hidroliza as ligações a-1,4 em vários glucanos em dextrinas, que são ainda hidrolisadas tO glicose por α-amiloglucosidase 20 de ação exo. Os efeitos sinérgicos destas enzimas são bem conhecidos, e essas enzimas são rotineiramente usadas para a hidrólise seletiva do amido, que é um glucano semelhante a um glicogênio, sem afetar outros glicoconjugadores, como a celulose, na biomassa vegetal 21 . A glicose liberada é detectada quantitativamente após um ensaio acoplado a enzima consistindo em glucose oxidase - que catalisa a redução de oxigênio para peróxido de hidrogênio e a oxidação da glicose para uma lactona e peroxidase - que produz um corante de quinoneimina cor de rosa de peróxido de hidrogênio, Um composto fenólico e 4-aminoantipirina 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Leitor de Microplacas&nbsp;</td>Leitor <td>de placas Eliza da</td> <td>Molecular Devices</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Next</td><td>Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Batedor de contas</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV/Visível Ultrospec 3100 pro Espectrofotômetro</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>Ajuste de pH</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>amiloglicosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Enzima Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>para despolimerização de glicogênio</td></tr><tr><td>&alfa;-Amilase, termoestável (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzima para despolimerização de glicogênio</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Padrão para o ensaio de glicose</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>Para determinação de concentrações de proteína</td></tr><tr><td>Bandejas de secagem de alumínio, descartáveis</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>Para determinação de pesos secos celulares</td></tr><tr><td>Kit de ensaio D-Glucose (formato GODPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>Para determinação de concentrações de glicose</td></tr><tr><td>Pães de óxido de zircônio, 0,15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Grânulos para lise celular em um Tubos Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO</td><td>Tubos Next Advance</td><td>NA</td><td>para lise celular em um Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

As cianobactérias acumulam glicogênio como um armazenamento intracelular importante de carbono e energia durante a fotossíntese. Desenvolvimentos recentes na pesquisa têm destacado mecanismos complexos de metabolismo de glicogênio, incluindo o ciclo diel de biossíntese e catabolismo, regulação redox e o envolvimento de ARN não codificante. Ao mesmo tempo, estão sendo feitos esforços para redirecionar o carbono do glicogênio aos produtos desejáveis ​​em cianobactérias geneticamente modificadas para aumentar os rendimentos do produto. Vários métodos são usados ​​para determinar os teores de glicogênio em cianobactérias, com precisões variáveis ​​e complexidades técnicas. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a determinação confiável do conteúdo de glicogênio em cianobactérias que podem ser realizadas em um laboratório padrão de ciências da vida. O protocolo implica a precipitação seletiva de glicogênio a partir do lisado celular e a despolimerização enzimática de glicogênio para gerar monómeros de glicose, que são detectados por um boi de glicoseIdase-peroxidase (GOD-POD) ensaio acoplado enzimático. O método foi aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, duas espécies modelo de cianobactérias que são amplamente utilizadas na engenharia metabólica. Além disso, o método mostrou com sucesso diferenças nos teores de glicogênio entre o tipo selvagem e mutantes defeituosos em elementos reguladores ou genes biossintéticos de glicogênio.

10 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 foram cultivados sob condições fotoautotróficas até o valor de OD 730nm atingir aproximadamente 0,8. As células foram colhidas e ressuspensas em Tris-HCl 50 mM, pH 8. O valor de OD730nm foi ajustado para 2-3. O teor de glicogênio foi analisado seguindo o protocolo descrito acima. O teor de glicogênio por OD 730nm foi de 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12). O teor de glicogênio em relação a...

Aqui, apresentamos um ensaio confiável e fácil para medir o teor de glicogênio em células cianobacterianas. O procedimento implica a precipitação, despolimerização selecionável e a detecção de resíduos de glicose. Este método é adequado para ambas as variedades de tipo selvagem e geneticamente modificado e pode facilitar a engenharia metabólica de cianobactérias.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o teor de glicogênio em cianobactérias utilizando uma hidrólise seletiva baseada em enzimas e ensaio. Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área de cianobactérias, como a fisiologia, genética molecular e bioengenharia de diferentes cepas de cianobactérias em estudo. A principal vantagem desta técnica é que ela é adaptada para pequena escala, é fácil de realizar e altamente sensível e específica para glicogênio.Embora este método possa fornecer informações sobre cianobactérias, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos que acumulam glicogênio ou amido, como E.Coli, leveduras, microalgas e diversos microrganismos heterotróficos e fototróficos. Inicie este protocolo com o preparo de culturas de cianobactérias conforme descrito no protocolo textual. Transfira um mililitro de cultura de cianobactérias ou suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, centrifugue a 6.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em um mililitro de Tris-HCl 50 milimolar, pH 8. Centrifugue o pellet ressuspenso como anteriormente.Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular uma segunda vez no tampão Tris-HCl. Centrifugue os tubos como antes e descarte o sobrenadante. Em seguida, re-suspenda completamente o pellet em 500 microlitros de tampão Tris-HCl 50 milimolar, pH 8.É fundamental que o pellet esteja bem suspenso para uma lise eficiente. Mantenha a ressuspensão em gelo. Lisar as células ressuspensas a quatro graus Celsius por 30 ciclos de ultrassonicação, sendo cada ciclo composto por 30 segundos a uma frequência de 20 kilohertz com amplitude máxima, seguido por 90 segundos sem ultrassonicação.Centrifugue o tubo contendo o lisado a 6.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, o pellet deve conter principalmente grandes fragmentos celulares, e o sobrenadante é utilizado para análises posteriores. Neste momento, determine a concentração de proteína utilizando o kit de ensaio de proteína.Remova a clorofila a do lisado celular misturando 900 microlitros de etanol e 100 microlitros do sobrenatante obtido em um tubo de tampa rosqueável de 1,5 mililitro. Após fechar a tampa, aqueça o tubo a 90 graus Celsius por 10 minutos, utilizando um bloco de aquecimento laboratorial padrão. Em seguida, incube o tubo em gelo por 30 minutos.Em seguida, centrifugue o tubo a 20.000 ×g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante. O pellet contém glicogênio.Seque levemente o pellet ao ar para remover o etanol em excesso. Não seque excessivamente o pellet para evitar dificuldade na sua dissolução. Meça a absorbância a 666 nanômetros do sobrenadante obtido para determinar o teor de clorofila a.O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênio. Dissolva o precipitado em 100 microlitros de acetato de sódio 50 milimolar, pH 5. Misture esses materiais cuidadosamente, utilizando um vórtex.A mistura por pipetagem não é recomendada porque a solução é viscosa. Adicione também 50 microlitros de amiloglicosidase a oito unidades por mililitro e 50 microlitros de alfa-amilase a duas unidades por mililitro. Em seguida, incube a mistura a 60 graus Celsius em um bloco térmico por duas horas para permitir a digestão do glicogênio em moléculas de glicose.Após a incubação, centrifugue a amostra a 20.000 vezes g durante cinco minutos e transfira o sobrenatante para um novo tubo de 1,5 mililitro. Meça a concentração de glicose no sobrenatante após hidrólise enzimática, utilizando o reagente GOD-POD. Transfira 100 microlitros do sobrenatante da etapa de precipitação de glicogênio para um poço em uma placa de 96 poços.Como controle negativo, utilize 100 microlitros de acetato de sódio 50 milimolar pH 5. Para gerar a curva de calibração, meça também as soluções padrão de glicose. Adicione 150 microlitros do reagente GOD-POD a cada amostra e misture rapidamente por pipetagem.Incube a placa a 25 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, registre o valor de absorbância em 510 nanômetros, utilizando um leitor de placas. Calcule a quantidade de glicogênio como o equivalente em glicose, utilizando uma curva de calibração obtida a partir dos padrões de glicose.Os conteúdos de glicogênio em Synechocystis são mostrados aqui. As duas linhagens mutantes, delta pmg A e delta pmg R, que são conhecidas por hiperacumular glicogênio, foram comparadas à linhagem selvagem. Como esperado, as linhagens mutantes apresentaram níveis elevados de glicogênio.Por outro lado, um mutante que não possui a glicogênio sintase não acumulou glicogênio. As linhagens utilizadas aqui foram modificadas para produzir manitol. Notavelmente, o mutante de glicogênio sintase produziu mais manitol do que a linhagem controle, o que sugere que o carboidrato sintetizado pela fotossíntese é redirecionado para o manitol na linhagem mutante que não possui a capacidade de sintetizar glicogênio.Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de determinar quantitativamente o teor de glicogênio em cianobactérias em cinco horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ressuspender completamente as células e solubilizar os pellets de glicogênio para obter resultados confiáveis. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de atividade de enzimas metabólicas, podem ser realizados utilizando os lisados celulares remanescentes, a fim de responder a questões adicionais, como a forma como o metabolismo de carboidratos é regulado em cianobactérias.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um ensaio espectrofotométrico para a estimativa da atividade da glicogênio sintase. O método baseia-se na redução da absorbância do NADH com o tempo e indica a atividade da glicogênio sintase.

Ensaio espectrofotométrico para determinar a atividade da glicogênio sintase

Neste vídeo, descrevemos um ensaio espectrofotométrico qualitativo para determinar a extensão da ramificação em uma amostra de glicogênio com uma estrutura não caracterizada. A comparação dos máximos de absorbância da amostra não caracterizada com os de polissacarídeos com estruturas ramificadas conhecidas indica a presença de ramificação na amostra não caracterizada.

Ensaio de ramificação de glicogênio para medir o grau de ramificação de glicogênio

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Técnicas para medir a atividade de enzimas-chave do metabolismo do glicogênio são apresentadas, usando um espectrofotômetro simples operando na faixa visível.

Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

No presente protocolo, a técnica de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE) é usada para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD) e o comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio.

Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Aprenda a determinar o conteúdo de glicogênio em cianobactérias usando hidrólise enzimática seletiva. Este método sensível e específico facilita pesquisas em fisiologia, genética molecular e bioengenharia de cepas selvagens e geneticamente modificadas.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

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