Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

O objetivo geral deste procedimento é determinar o conteúdo de glicogênio em cianobactérias usando uma hidrólise seletiva baseada em enzimas e ensaio. Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo das cianobactérias, como fisiologia, genética molecular e bioengenharia de diferentes cepas de cianobactérias sob investigação. A principal vantagem desta técnica é que ela é adaptada a uma pequena escala, é fácil de executar e altamente sensível e específica ao glicogênio.

Embora esse método possa fornecer informações sobre cianobactérias, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos que acumulam glicogênio ou amido, como E.Coli, leveduras, microalgas e vários microrganismos heterotróficos e fototróficos. Comece este protocolo com a preparação de culturas de cianobactérias conforme descrito no protocolo de texto. Transfira um mililitro de cultura de cianobactérias ou suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue a 6.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante antes de ressuspender o sedimento num mililitro de 50 milimolares Tris-HCL pH oito. Centrifugue o pellet ressuspenso como antes.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular uma segunda vez no tampão Tris-HCL. Centrifugue os tubos como antes e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda completamente o pellet em 500 microlitros de tampão Tris-HCL de 50 milimolares pH oito.

É crucial ter o pellet bem suspenso para uma lise eficiente. Mantenha a ressuspensão no gelo. Lise as células ressuspensas a quatro graus Celsius por 30 ciclos de ultrassom, com cada ciclo consistindo de 30 segundos a uma frequência de 20 kilohertz com uma amplitude máxima, seguidos por 90 segundos sem.

Centrifugar o tubo que contém o lisado a 6 000 vezes g e a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Após a centrifugação, o pellet deve ser composto principalmente por detritos de células grandes e o sobrenadante é usado para análise posterior. Neste ponto, determine a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína.

Remova a clorofila a do lisado celular misturando 900 microlitros de etanol e 100 microlitros do sobrenadante obtido em um tubo de tampa de rosca de 1,5 mililitro. Depois de fechar a tampa, aqueça o tubo a 90 graus Celsius por 10 minutos, usando um bloco de aquecimento de laboratório padrão. Em seguida, incube o tubo no gelo por 30 minutos.

Em seguida, centrifugue o tubo a 20.000 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante. O pellet contém glicogênio.

Seque levemente o pellet ao ar para remover o excesso de etanol. Não seque excessivamente o pellet para evitar dificuldade em dissolvê-lo. Medir a absorvância a 666 nanómetros do sobrenadante obtido para determinar o teor de clorofila a.

O valor pode ser usado para normalizar o conteúdo de glicogênio. Dissolver o grânulo em 100 microlitros de acetato de sódio 50 milimolares pH cinco. Misture bem esses materiais, usando um vórtice.

A mistura por pipetagem não é recomendada porque a mistura é viscosa. Adicione também 50 microlitros de oito unidades por mililitro de amiloglucosidase e 50 microlitros de duas unidades por mililitro de alfa-amilase. Em seguida, incube a mistura a 60 graus Celsius em um bloco de aquecimento por duas horas para permitir a digestão do glicogênio em moléculas de glicose.

Após a incubação, centrifugar a amostra a 20 000 vezes g durante cinco minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Medir a concentração de glicose no sobrenadante após hidrólise enzimática, utilizando o reagente GOD-POD. Transfira 100 microlitros do sobrenadante da etapa de precipitação de glicogênio para um poço em uma placa de 96 poços.

Como controle negativo, use 100 microlitros de acetato de sódio 50 milimolar pH cinco. Para gerar a curva de calibração, medir também as soluções-padrão de glicose. Adicione 150 microlitros de reagente GOD-POD a cada amostra e misture rapidamente por pipetagem.

Incube a placa a 25 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, registre o valor de absorbância em 510 nanômetros, usando um leitor de placas. Calcular a quantidade de glicogénio como equivalente de glicose, utilizando uma curva de calibração obtida a partir dos padrões de glicose.

O conteúdo de glicogênio em synechocystis é mostrado aqui. As duas cepas mutantes, delta pmg A e delta pmg R, que são conhecidas por hiperacumular glicogênio, foram comparadas com a cepa do tipo selvagem. Como esperado, as cepas mutantes apresentaram níveis elevados de glicogênio.

Por outro lado, um mutante que não possui glicogênio sintase não acumulou glicogênio. As cepas usadas aqui foram projetadas para produzir manitol. Notavelmente, o mutante glicogênio sintase produziu mais manitol do que a cepa controle, o que sugere que o carboidrato sintetizado pela fotossíntese é redirecionado para manitol na cepa mutante sem a capacidade de sintetizar glicogênio.

Depois de assistir a este vídeo, você poderá determinar quantitativamente o conteúdo de glicogênio nas cianobactérias em cinco horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ressuspender completamente as células e solubilizar os pellets de glicogênio para obter resultados confiáveis. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de atividade enzimática metabólica, podem ser realizados usando os lisados celulares restantes para responder a perguntas adicionais, como como o metabolismo de carboidratos é regulado em cianobactérias.