ポリメラーゼ連鎖反応およびゲル電気泳動法と環境微生物の検出

Environmental Microbiology

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ

ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、土壌・水・大気の環境に存在する微生物を検出するために使用される技術です。DNA の特定のセクションを増幅することによって PCR は種、株と血清型/pathovar レベルまで対象微生物の同定を促進できます。手法は、サンプル中の微生物のコミュニティ全体の特性評価に利用できます。

特殊な成長媒体を使って研究室微生物の培養は老舗の技術、環境試料中の微生物の検出のための使用に残ります。自然環境に多くの微生物、生きている間代謝活性および/または倍加時間の低水準を維持し、従って呼ばれます非人為的 (VBNC) 生物が、実行可能です。単独で文化ベースの技術の使用はこれらの微生物を検出できないし、したがって、サンプルで微生物集団の徹底的な評価は行いません。PCR の使用、VBNC 生物の培養微生物の検出のためでき環境試料の存在がもはや生きているか、アクティブな遺伝子配列の増幅一般的に微生物の前濃縮を必要としないもの。ただし、PCR は生存率および活動の前述の状態を区別できません。1 つまたは複数のカルチャ ベース技術と組み合わせると、微生物の特定のサブセットの実行可能性はまだ決定されるかもしれない。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. ポリメラーゼ連鎖反応およびゲル電気泳動法と環境微生物の検出. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

PCR の基本的な前提は、DNA の指数関数的増幅を達成するために連続した温度変化の繰り返しのサイクルを使用します。好熱菌(Taq) などの温泉地に住んでいる細菌から得られる DNA のポリメラーゼの酵素によって DNA 合成が行われます。これらのポリメラーゼは、熱安定性、PCR の間に使用される高温に耐えるように。

私アンプリコン、として知られているターゲット シーケンスは、「プライマー」として知られているヌクレオチドの 2 つの不足分の伸張を使用して DNA のテンプレートから増幅されています。相補的な核酸結合の高い特異性、ためプライマーは、関心の非常に特定のシーケンスのターゲットの増幅できます。興味の生物からのみ一意のシーケンス (またはシーケンスの一意の組み合わせ) を増幅するプライマーを設計することにより、特異的遺伝物質が複雑な環境試料中に存在するすべての生物の DNA の存在を検出する PCR を使用できます。

PCR を行う、たちとして知られているマシンは反応に必要な異なる温度を自動的に進めるためです。各サイクルは、3 つのフェーズに分かれています。最初に、「変性」として知られている、通常、上記の 92 ° C と続く約 30 s. 変性増幅反応を続行を許可するための単一繊維 DNA の分子に分割するために使用設定。

「熱処理」、2 番目のフェーズは、以下の 2 つのプライマーは、通常 50-65 ° C と間も続く約 30 s. 溶融温度は二本鎖 DNA の 50% が単一繊維に分離およびアニーリング ・ ステップできるようにプライマーが DNA テンプレートのターゲット サイトに結合する温度の融点の低い 2 ~ 3 ° C を設定されています。

PCR のサイクルの第 3 段階は、「伸び」や「拡張」, DNA ポリメラーゼは、プライマー テンプレート二重にバインドし、製品の合成を触媒します。Taq のポリメラーゼのための 72 ° C に設定すると、このフェーズの期間によって異なります私アンプリコン、通常 30 の長さ s/500 bp。各サイクル後増幅された DNA 変性はもう一度、PCR の製品の量の急激な増加につながる新しいテンプレートとして提供しています。

反応が完了したら、PCR の製品は電気泳動と呼ばれるプロセス、ポリマー agarose の通常作られて「ゲル」でサイズによって解決できます。Dna のバックボーンで負電荷フィールドの肯定的な端の方に移住する原因し、電界が、ゲルの上で適用されます。一般的に言えば、大きい線形 DNA の分子はゲルのマトリックスを通して旅行がかかります。

Procedure

<>

1. サンプル コレクション

  1. オーガーを使用して土壌を収集または決められた深さまでシャベルします。根圏 (土周辺と植物の根とその関連付けられている微生物によって影響の狭い地域) から土壌を収集する場合のみから直接収集植物の根の周りコレクション バレルに土を押すことで。
  2. 水の中に浸漬の棒の端を押しながら滅菌プラスチック ボトルを浸すことによって水のサンプルを収集します。

2. 核酸抽出と準備

  1. サンプルから有機体およびウイルスを収集し、それらから DNA や RNA を抽出します。詳細については、ゼウスの科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
  2. ラベル付き microfuge の管に抽出した DNA を格納します。DNA は、一晩、または時間の長い期間保存する必要があります、-20 ° C で凍結し、常温使用の準備ができたら、チューブを解凍します。
  3. 試金するのに遺伝物質は (かどうかそれは RNA のウイルスのゲノムや細胞生物の転写 RNA)、RNA は PCR に進む前に相補的 DNA (cDNA) を作成するサンプルの逆のトランスクリプション (RT) を実行します。詳細については、ゼウスの理科の RT-PCR のビデオを参照してください。

3. ポリメラーゼ チェーン反応

  1. 氷上 PCR 酵素を (例えばTaqのポリメラーゼ) を置き、室温で指定された「クリーン」フードの中その他の試薬 (PCR のバッファー、dNTPs、プライマー) に解凍します。酵素は-20 ° C で保存されているが、フリーズすることはありません。温度に敏感でありのでクールなと最小周囲温度への露出を保たれなければなりません。
  2. すべての反応 (表 1) の間で一定しているすべての試薬の「マスター ミックス"を作るために必要な各試薬の量を計算します。(例えば、ターゲット地域を含んでいるテンプレート) の肯定的なアカウントの確認と計算に否定的な (例えば、テンプレートなし) コントロール。ピペッティング誤差を考慮する最終的なボリュームに追加の 10% を追加します。プライマー ボリュームによって異なります特定の有機体のための試金適切な値の公表された資料を参照してください。
  3. チューブは、プラスチック製の壁に試薬分子の付着を最小限に抑える、低結合および microfuge を使用して各試薬マスター ミックスを組み立てるための計算されたボリュームを追加します。優しく渦、追加する前に各試薬を遠心力場します。一度マスター ミックスを調製、渦をミックスし、遠心分離によって収集
  4. 8 チューブ PCR ストリップを準備します。各サンプルでは、正と負のコントロールを含むための管を指定します。
  5. ストリップの各チューブに pcr の適切な量を分注します。
  6. それぞれの PCR チューブにから、サンプルと同様、肯定的なテンプレートの 5 μ L、5 μ L グレードの分子水のネガティブ コントロールとしての DNA のテンプレートの適切なボリュームを追加します。
  7. Minicentrifuge を使用して、数秒間キャップを 8 管ストリップと遠心分離機で配置します。
  8. 場所、たちで 8 チューブ ストリップ
  9. 適切な PCR プログラム、たちに実行するを設定します。典型的なプログラムは、以下のとおり
    1. 変性 94 ° C、3 分で。
    2. 増幅の 30-40 のサイクル: 変性 94 ° c 30 s、30 s と拡張が 30 のための 72 ° c (50-60 ° C) の間に通常プライマー特定温度で焼鈍 s/500 bp。
    3. 7-10 分のための 72 ° C で最後の拡張。

4. Agarose のゲルの準備

  1. 125 mL 三角フラスコに粉が agarose の適切な量を必要なゲル容積とゲル濃度 (表 2) に基づき、重量を量る。
  2. フラスコ、ゲルの連続したバッファーの適切なボリュームを追加し、フラスコを手で旋回します。
  3. 1 分のハイパワー電子レンジ オーブンでバッファー agarose の混合物を加熱します。
  4. 電子レンジからフラスコを削除し、すべての agarose が溶けるように手で旋回します。Agarose に完全に溶解していない場合は、30 の単位で電子レンジを繰り返します。
  5. フラスコにキャップをしっかりと確保した後に、冷たい水を実行して下に回して 50 ° C にクールします。
  6. 臭化エチジウム (EtBr) の 1 μ L を EtBr 用に指定された micropippette を使用して agarose の混合物に追加します。EtBr は二本鎖核酸を結合し、UV ライトで照らされた時はオレンジ色の蛍光を発する染料です。EtBr は潜在的に発癌 (ゴーグル、白衣、EtBr 手袋) 保護具を着用する必要がありますので、注意してください。
  7. 電気泳動ゲルの鋳造トレイに溶融ゲルを注ぎなさい。Agarose 内で閉じ込められている気泡がないかどうかを確認します。ゲルに櫛を置き、確実にクランプします。ジェルを固めるための約 20-30 分を待ちます。
  8. ゲルは凝固させる為、一度ゲルの涙を引き起こすことがなく櫛を慎重に削除します。櫛はサンプルをロードのためのゲルの井戸を作成します。

5. ゲル電気泳動

  1. 電気泳動室に凝固 agarose のゲルを配置します。
  2. ゲルはかろうじて水没までチャンバーに適切な実行バッファーを追加します。
  3. パラフィルムの作品に染料の集中を読み込みのスポットをピペットします。PCR の製品の予想されるサイズの適切な範囲の DNA の梯子があります。また、microfuge の管、サンプルごとに 1 つの新鮮なセットを使用します。
  4. PCR が完了すると、たちから 8 チューブ ストリップを取得し、簡単に任意の凝縮を収集する遠心分離機します。ローディングの染料とミックスを上下にピペットに DNA 製品の適切な量を追加します。たとえば、ローディングの染料 × 10 の 2 μ L に 10 μ L、1 x で染付の最終的なボリュームを与えるサンプルの 8 μ L 混合です。
  5. 井戸を穿刺しないように注意して agarose のゲルで指定されたウェルにピペットの各色素サンプル混合物。
  6. 電気泳動室に電極を接続します。DNA は負に帯電""肯定的な電極に向かって動作するようです。したがって、正の電極を井戸が読み込まれた、商工会議所の反対側に接続します。バッファー システムとゲル室のサイズを適切な電圧に電源供給を設定し、それを実行するを設定します。小さな泡は、電気泳動が適切に進んでいる場合、商工会議所の側面を移動表示されます。
  7. 染料フロントはゲルを十分にずっと進んだ、電源をオフにします。慎重に transilluminator または視覚的撮像素子にゲルを輸送し、UV ゲルの DNA バンドを視覚化する光を入れます。
  8. バンドのサイズと、ゲル上の位置を分析します。関心の有機体からの DNA のサンプル (図 1) に存在を確認する肯定的な制御サンプルのバンドの位置を比較します。
コンポーネント チューブごとにボリューム (μ L) 5 管の体積 (μ L) 最終濃度
10 倍Taqバッファー Ex 5.0 25 1 x
2.5 mM dNTPs 4.0 20 0.2 mM
前方プライマー * 2.0 10 400 nM
逆プライマー * 2.0 10 400 nM
分子 H2O 31.75 158.75 -
Taq ex 0.25 1.25 2.5 U
Pcr 45 225

テーブル 1。PCR の試薬ボリューム マスター ミックス。* プライマー ボリュームは生物の試金によって異なります。分子グレード最終巻 45 μ L を作るために水の量を調整します。その他のコンポーネントのボリュームが変わらないようにします。

アガロースの推奨 % 最適な解像度線形 DNA のフラグメント (塩基)
0.5 1,000 30,000
0.7 800-12,000
1.0 500-10,000
1.2 400 7,000
1.5 200 3,000
2.0 50 2,00

表 2。DNA フラグメント サイズ範囲の異なる agarose のゲルの割合によって最適な解決。

ポリメラーゼの連鎖反応、または PCR は、検出および識別する土、水および他の環境のサンプルで現在の微生物に広く適用される基本的な生物学的手法です。

古典的な微生物が特殊な成長媒体を使用してラボで培養です。ただし、自然環境に多くの微生物は「培養」- または彼らは非常に低い代謝活動や成長率を持っているので、彼らは培養皿にレプリケート可能ではないかもしれない非常に厳しい成長の要件を持っているので。Culturability 微生物間の相違はまた、環境試料からの微生物が培養、文化相対的な豊富が反映していないこと、環境での実際のレベルを意味します。

混合サンプルで現在の DNA の少量を増幅することが具体的には、pcr 法の導入により、迅速に検出・培養、生物環境のサンプルで現在の複雑な品揃えでいるものも興味の特定微生物を識別することが可能。

このビデオは、PCR の原理をご紹介いたします。それは興味の生物の存在を検出するために環境試料から分離された DNA の PCR を行うための一般的なプロトコルを話し合います。最後に、PCR に基づく微生物の同一証明のいくつかのアプリケーションが探求されます。

PCR の基本的な前提は、異なった温度を自動的に循環する、たちとして知られているマシンで通常 DNA の指数関数的増幅を達成するために連続した温度変化のサイクルを繰り返し使用することです。DNA 合成は好熱菌や「Taq」など、温泉に住んでいる細菌から得られる DNA のポリメラーゼの酵素によって行われます。これらのポリメラーゼは、熱安定性、PCR の間に使用される高温に耐えるように。

私アンプリコン、として知られているターゲット シーケンスは、「プライマー」として知られているヌクレオチドの 2 つの不足分の伸張を使用して DNA のテンプレートから増幅されています。相補的な核酸結合の高い特異性、ためプライマーは、関心の非常に特定のシーケンスのターゲットの増幅できます。一意のシーケンスまたはシーケンス、関心の有機体からのユニークな組み合わせを増幅するプライマーを設計することによって特異的遺伝物質が複雑な環境試料中に存在するすべての生物の DNA の存在を検出する PCR を使用できます。

各 PCR のサイクルは、3 つのフェーズに分かれています。最初に、「変性」として知られている、通常、上記の 92 ° C と続く約 30 s. 変性増幅反応を続行を許可するための単一繊維 DNA の分子に分割するために使用設定。

「熱処理」、2 番目のフェーズは 2 に 3 ° C 2 つのプライマーの溶ける温度の下限を設定、通常 50 に 65 ° C からも続く間約 30 s. 溶融温度は二本鎖 DNA の 50% が分子が単一繊維に分離温度およびアニーリング ・ ステップできるようにプライマーが DNA テンプレートのターゲット サイトに結合します。

PCR のサイクルの第 3 段階は、「伸び」や「拡張」, DNA ポリメラーゼは、プライマー テンプレート二重にバインドし、新しい鎖の合成を触媒します。最も一般的に使用される PCR のポリメラーゼ、Taq、72 ° C で設定このフェーズの期間によって異なります私アンプリコン、通常 30 の長さ秒・ 500 ヒト。各サイクル後増幅された DNA 変性はもう一度、PCR の製品の量の急激な増加につながる新しいテンプレートとして提供しています。

反応が完了したら、PCR の製品は電気泳動と呼ばれるプロセス、ポリマー agarose の通常作られて「ゲル」でサイズによって解決できます。Dna のバックボーンで負電荷フィールドの肯定的な端の方に移住する原因し、電界が、ゲルの上で適用されます。一般的に言えば、大きい線形 DNA の分子はゲルのマトリックスを通して旅行がかかります。

PCR のしくみを理解したら、反応を使用して、環境試料中の微生物を特定する方法を見てをみましょう。

まず、ピペッティング エラーを考慮して追加 10% プラス処理されるサンプルの数に基づいて各試薬の必要量を計算します。-対象地域を含む - 肯定的な制御テンプレートは反応が動作していることを確認する含まれているべき否定的なだけでなく、DNA のテンプレートが反応コンポーネントのいずれかで汚染を排除するために、含まれていないを制御します。氷の上 Taq ポリメラーゼの酵素を保ち、残りの試薬と室温で汚染を防ぐために指定された層流フードの DNA サンプルを解凍します。

すべての試薬が解凍後、チューブ表面への分子の吸着による試薬量の不一致を最小限に抑える低結合および microfuge の管に各試薬量の集計を追加することで、試薬「マスター ミックス」を構成します。優しく渦、追加する前に各試薬を遠心力場します。一度マスター ミックスは準備される、渦をミックスし、遠心分離によって収集します。

各サンプルは、コントロールを含む 1 つの管を指定する 8 チューブ PCR ストリップにラベルを付けます。ストリップの各チューブに PCR マスター ミックスの適切な量を調剤します。次に、それぞれのチューブに各 DNA のサンプルを追加します。

ストリップ管を安全にストリップ キャップを置き、ストリップ アダプターとミニ遠心分離の遠心分離機の簡潔に。たちに管を配置し、適切な PCR プログラムに従って反応を実行します。

PCR を実行すると、PCR 産物の電気泳動用アガロース ゲルを準備します。PCR の製品のサイズに基づいて解決できる濃度ゲルの agarose 粉末の適切な量を重量を量る。125 mL フラスコ agarose を追加し、フラスコ、キャスト、ゲルの量に基づいて、ミックスに渦巻きにゲルの連続したバッファーの適切なボリュームを追加します。1 分のハイパワーでアガロース溶液を電子レンジします。完了したら、agarose が渦巻くこと、フラスコに完全に溶解を確認し、必要な場合、30 の単位で電子レンジを繰り返します。

しっかりと、フラスコにキャップを確保し、冷たい水を実行して下のフラスコを旋回で 50 ° C にアガロース溶液を冷却します。いったん冷却、agarose にエチジウム ブロマイドの 1 μ L を追加します。臭化エチジウムは潜在的に発癌、必ずエチジウム ブロマイド手袋、白衣、ゴーグルなどの保護具を着用します。

Agarose 内で閉じ込められている気泡がないかどうかを確かめて、電気泳動ゲル鋳造トレイにアガロース溶液を注ぐ。ソリューションに必要な井戸数と櫛を配置します。固めるための 20 から 30 分の室温でゲルを残します。一度ゲルを設定すると、プロセスでゲルを破らないように必ず櫛を慎重に取り外します。

固化したゲルを電気泳動室に配置します。ゲルは水中だけまでチャンバーに LB バッファーを追加します。パラフィルムの部分、上にピペットの PCR の製品の予測されるサイズの適切な範囲の DNA の梯子の「スポット」。たちから完成した反応と PCR チューブを取得します。簡単なの遠心分離によって PCR チューブ凝縮体を収集し、パラフィルム上に各サンプルの 8 μ L を追加します。PCR の製品の各スポットにローディングの染料 × 10 の 2 μ L を追加すると、染料の最終濃度は 2 倍。

Agarose のゲル、ゲルを通ってを突かないように注意しながら、指定された井戸にサンプルとはしごを読み込みます。読み込みが完了すると、電気泳動室に蓋の上に置くし、電極を電源装置に接続します。DNA は負に帯電し、肯定的な電極の方に移行、以来は、井戸マイナス電極に近い側に確認します。電源をオンにし、電気泳動室と使用されるバッファー システムのサイズに適切な電圧に設定。電気泳動を「実行する」を設定します。商工会議所の側面を移動の小さな泡になります電気泳動が正しく進んでいるかどうかを観察。

染料フロントはゲルを十分にずっと進んだ、電源をオフにします。慎重に electrophoresed 製品を視覚化するゲルのイメージャーとゲルを輸送します。保護シールドをオンに UV 光とゲルの DNA バンドを可視化します。それに予想されるパターンは環境サンプルの興味の種の存在を示す一致するバンドの位置を分析します。

今では PCR を実行する方法を見て、それが適用される様々 な方法を見てみましょう、環境への関心の微生物を検出します。

PCR 基づかせていた環境微生物検出の 1 つの使用は「脳を食べるアメーバ」など病気を引き起こす有機体を識別するために、フォーラーネグレリア、新鮮な水体としばしば致命的な人間の神経系を攻撃することができます unchlorinated プールは、単一のセルの生物。アメーバのゲノムのユニークな DNA シーケンスをターゲットのプライマーを用いて PCR を行い、水中のこの致命的な微生物の存在またはが疑われる患者の脳脊髄液をテストできます。

PCR による微生物同定のための別のアプリケーションは、はえ公衆衛生監視と疾患アウトブレイクの調査の一部として食品事業所付近における病原性細菌の存在をテストすることです。

ここでは、調査官はまず体表面とハエ、消化管からの細菌を隔離するし、興味のこれらの種の豊かに種特異的な培養条件を使用してリステリア菌サルモネラ菌などの病原性細菌の存在を見た。培養した菌から DNA を抽出した後市販の種特異的検出 PCR キットは、自分のアイデンティティをテストするため使用されました。

最後に、主要な公衆衛生問題である黄色ブドウ球菌などの抗生物質耐性の病原性細菌の異なった緊張を識別し、PCR と区別できます。

この例では、研究者は分離し臨床検体から黄色ブドウ球菌を培養し、細菌のコロニーから DNA を抽出し、PCR を行った。増幅反応をここで「多重化された」、細菌ゲノムの異なるユニークな地域をターゲットと複数のプライマー セットが同じ反応に結合されたことを意味します。個々 のプライマー セットは、各緊張に認められたバンド パターンのユニークな商品の組み合わせで、のみいくつかの系統が、その他の DNA にして PCR の製品ができるように設計されました。

PCR に基づく微生物の検出にゼウスのビデオを見てきただけ。ポリメラーゼの連鎖反応の原理を見てきました環境の微生物から抽出した DNA の PCR を行うためのプロトコルそして最後に、いくつか特定のアプリケーションこの手法の異なるタイプの環境または臨床サンプルに興味の生物をテストします。見てくれてありがとう!

Results

図 1で DNA の梯子 (1 レーン) はサイズおよび PCR の製品のバンドのおおよその濃度のリファレンスを示します。ネガティブ コントロール (2 車線) では、ターゲット ターゲット バンドのサイズと位置を示す DNA を含んでいるテンプレートから肯定的な制御 (3 車線) を増幅しながら、任意の遺伝物質は含まれません。4、6、8、および 9 のサンプルは、したがってターゲットの遺伝物質を含むこれらのサンプルを示すポジティブ コントロールとして同様のバンド パターンを表わします。これらのサンプルが得られた環境で有機物があると推測できます。

Figure 1
図 1。Agarose のゲルの電気泳動の後でバンドを可視化。

Applications and Summary

PCR を採用して、環境中の病原体の有無を迅速に判断できます。たとえば、脳を食べるアメーバフォーラーネグレリアに特定のプライマーは DNA を増幅する、生物がサンプルで現在の場合ゲルの強力なバンドを生成します。場合単一の生物は、主な関心が、関連付けられているさまざまな有機体から毒素産生遺伝子ではなくには、PCR はこれらの特定の遺伝物質の存在の有無を決定するも使用できます。

環境微生物研究室を分析する際、PCR を確認手順として使用もできます。培養法は、環境試料に含まれる特定の有機体の区別ができない、PCR は、たぶん具体的候補微生物を区別使用。

従来の PCR は、特定の実験のためにいくつかの方法で変更できます。PCR は、逆のトランスクリプション ステップ (RT-PCR) への結合によって単一座礁させた RNA テンプレートを分析する使用ことができます。を超えて不在と存在の定量、定量 PCR (qPCR) は興味の特定の DNA の濃度を測定できます。

<>

1. サンプル コレクション

  1. オーガーを使用して土壌を収集または決められた深さまでシャベルします。根圏 (土周辺と植物の根とその関連付けられている微生物によって影響の狭い地域) から土壌を収集する場合のみから直接収集植物の根の周りコレクション バレルに土を押すことで。
  2. 水の中に浸漬の棒の端を押しながら滅菌プラスチック ボトルを浸すことによって水のサンプルを収集します。

2. 核酸抽出と準備

  1. サンプルから有機体およびウイルスを収集し、それらから DNA や RNA を抽出します。詳細については、ゼウスの科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
  2. ラベル付き microfuge の管に抽出した DNA を格納します。DNA は、一晩、または時間の長い期間保存する必要があります、-20 ° C で凍結し、常温使用の準備ができたら、チューブを解凍します。
  3. 試金するのに遺伝物質は (かどうかそれは RNA のウイルスのゲノムや細胞生物の転写 RNA)、RNA は PCR に進む前に相補的 DNA (cDNA) を作成するサンプルの逆のトランスクリプション (RT) を実行します。詳細については、ゼウスの理科の RT-PCR のビデオを参照してください。

3. ポリメラーゼ チェーン反応

  1. 氷上 PCR 酵素を (例えばTaqのポリメラーゼ) を置き、室温で指定された「クリーン」フードの中その他の試薬 (PCR のバッファー、dNTPs、プライマー) に解凍します。酵素は-20 ° C で保存されているが、フリーズすることはありません。温度に敏感でありのでクールなと最小周囲温度への露出を保たれなければなりません。
  2. すべての反応 (表 1) の間で一定しているすべての試薬の「マスター ミックス"を作るために必要な各試薬の量を計算します。(例えば、ターゲット地域を含んでいるテンプレート) の肯定的なアカウントの確認と計算に否定的な (例えば、テンプレートなし) コントロール。ピペッティング誤差を考慮する最終的なボリュームに追加の 10% を追加します。プライマー ボリュームによって異なります特定の有機体のための試金適切な値の公表された資料を参照してください。
  3. チューブは、プラスチック製の壁に試薬分子の付着を最小限に抑える、低結合および microfuge を使用して各試薬マスター ミックスを組み立てるための計算されたボリュームを追加します。優しく渦、追加する前に各試薬を遠心力場します。一度マスター ミックスを調製、渦をミックスし、遠心分離によって収集
  4. 8 チューブ PCR ストリップを準備します。各サンプルでは、正と負のコントロールを含むための管を指定します。
  5. ストリップの各チューブに pcr の適切な量を分注します。
  6. それぞれの PCR チューブにから、サンプルと同様、肯定的なテンプレートの 5 μ L、5 μ L グレードの分子水のネガティブ コントロールとしての DNA のテンプレートの適切なボリュームを追加します。
  7. Minicentrifuge を使用して、数秒間キャップを 8 管ストリップと遠心分離機で配置します。
  8. 場所、たちで 8 チューブ ストリップ
  9. 適切な PCR プログラム、たちに実行するを設定します。典型的なプログラムは、以下のとおり
    1. 変性 94 ° C、3 分で。
    2. 増幅の 30-40 のサイクル: 変性 94 ° c 30 s、30 s と拡張が 30 のための 72 ° c (50-60 ° C) の間に通常プライマー特定温度で焼鈍 s/500 bp。
    3. 7-10 分のための 72 ° C で最後の拡張。

4. Agarose のゲルの準備

  1. 125 mL 三角フラスコに粉が agarose の適切な量を必要なゲル容積とゲル濃度 (表 2) に基づき、重量を量る。
  2. フラスコ、ゲルの連続したバッファーの適切なボリュームを追加し、フラスコを手で旋回します。
  3. 1 分のハイパワー電子レンジ オーブンでバッファー agarose の混合物を加熱します。
  4. 電子レンジからフラスコを削除し、すべての agarose が溶けるように手で旋回します。Agarose に完全に溶解していない場合は、30 の単位で電子レンジを繰り返します。
  5. フラスコにキャップをしっかりと確保した後に、冷たい水を実行して下に回して 50 ° C にクールします。
  6. 臭化エチジウム (EtBr) の 1 μ L を EtBr 用に指定された micropippette を使用して agarose の混合物に追加します。EtBr は二本鎖核酸を結合し、UV ライトで照らされた時はオレンジ色の蛍光を発する染料です。EtBr は潜在的に発癌 (ゴーグル、白衣、EtBr 手袋) 保護具を着用する必要がありますので、注意してください。
  7. 電気泳動ゲルの鋳造トレイに溶融ゲルを注ぎなさい。Agarose 内で閉じ込められている気泡がないかどうかを確認します。ゲルに櫛を置き、確実にクランプします。ジェルを固めるための約 20-30 分を待ちます。
  8. ゲルは凝固させる為、一度ゲルの涙を引き起こすことがなく櫛を慎重に削除します。櫛はサンプルをロードのためのゲルの井戸を作成します。

5. ゲル電気泳動

  1. 電気泳動室に凝固 agarose のゲルを配置します。
  2. ゲルはかろうじて水没までチャンバーに適切な実行バッファーを追加します。
  3. パラフィルムの作品に染料の集中を読み込みのスポットをピペットします。PCR の製品の予想されるサイズの適切な範囲の DNA の梯子があります。また、microfuge の管、サンプルごとに 1 つの新鮮なセットを使用します。
  4. PCR が完了すると、たちから 8 チューブ ストリップを取得し、簡単に任意の凝縮を収集する遠心分離機します。ローディングの染料とミックスを上下にピペットに DNA 製品の適切な量を追加します。たとえば、ローディングの染料 × 10 の 2 μ L に 10 μ L、1 x で染付の最終的なボリュームを与えるサンプルの 8 μ L 混合です。
  5. 井戸を穿刺しないように注意して agarose のゲルで指定されたウェルにピペットの各色素サンプル混合物。
  6. 電気泳動室に電極を接続します。DNA は負に帯電""肯定的な電極に向かって動作するようです。したがって、正の電極を井戸が読み込まれた、商工会議所の反対側に接続します。バッファー システムとゲル室のサイズを適切な電圧に電源供給を設定し、それを実行するを設定します。小さな泡は、電気泳動が適切に進んでいる場合、商工会議所の側面を移動表示されます。
  7. 染料フロントはゲルを十分にずっと進んだ、電源をオフにします。慎重に transilluminator または視覚的撮像素子にゲルを輸送し、UV ゲルの DNA バンドを視覚化する光を入れます。
  8. バンドのサイズと、ゲル上の位置を分析します。関心の有機体からの DNA のサンプル (図 1) に存在を確認する肯定的な制御サンプルのバンドの位置を比較します。
コンポーネント チューブごとにボリューム (μ L) 5 管の体積 (μ L) 最終濃度
10 倍Taqバッファー Ex 5.0 25 1 x
2.5 mM dNTPs 4.0 20 0.2 mM
前方プライマー * 2.0 10 400 nM
逆プライマー * 2.0 10 400 nM
分子 H2O 31.75 158.75 -
Taq ex 0.25 1.25 2.5 U
Pcr 45 225

テーブル 1。PCR の試薬ボリューム マスター ミックス。* プライマー ボリュームは生物の試金によって異なります。分子グレード最終巻 45 μ L を作るために水の量を調整します。その他のコンポーネントのボリュームが変わらないようにします。

アガロースの推奨 % 最適な解像度線形 DNA のフラグメント (塩基)
0.5 1,000 30,000
0.7 800-12,000
1.0 500-10,000
1.2 400 7,000
1.5 200 3,000
2.0 50 2,00

表 2。DNA フラグメント サイズ範囲の異なる agarose のゲルの割合によって最適な解決。

ポリメラーゼの連鎖反応、または PCR は、検出および識別する土、水および他の環境のサンプルで現在の微生物に広く適用される基本的な生物学的手法です。

古典的な微生物が特殊な成長媒体を使用してラボで培養です。ただし、自然環境に多くの微生物は「培養」- または彼らは非常に低い代謝活動や成長率を持っているので、彼らは培養皿にレプリケート可能ではないかもしれない非常に厳しい成長の要件を持っているので。Culturability 微生物間の相違はまた、環境試料からの微生物が培養、文化相対的な豊富が反映していないこと、環境での実際のレベルを意味します。

混合サンプルで現在の DNA の少量を増幅することが具体的には、pcr 法の導入により、迅速に検出・培養、生物環境のサンプルで現在の複雑な品揃えでいるものも興味の特定微生物を識別することが可能。

このビデオは、PCR の原理をご紹介いたします。それは興味の生物の存在を検出するために環境試料から分離された DNA の PCR を行うための一般的なプロトコルを話し合います。最後に、PCR に基づく微生物の同一証明のいくつかのアプリケーションが探求されます。

PCR の基本的な前提は、異なった温度を自動的に循環する、たちとして知られているマシンで通常 DNA の指数関数的増幅を達成するために連続した温度変化のサイクルを繰り返し使用することです。DNA 合成は好熱菌や「Taq」など、温泉に住んでいる細菌から得られる DNA のポリメラーゼの酵素によって行われます。これらのポリメラーゼは、熱安定性、PCR の間に使用される高温に耐えるように。

私アンプリコン、として知られているターゲット シーケンスは、「プライマー」として知られているヌクレオチドの 2 つの不足分の伸張を使用して DNA のテンプレートから増幅されています。相補的な核酸結合の高い特異性、ためプライマーは、関心の非常に特定のシーケンスのターゲットの増幅できます。一意のシーケンスまたはシーケンス、関心の有機体からのユニークな組み合わせを増幅するプライマーを設計することによって特異的遺伝物質が複雑な環境試料中に存在するすべての生物の DNA の存在を検出する PCR を使用できます。

各 PCR のサイクルは、3 つのフェーズに分かれています。最初に、「変性」として知られている、通常、上記の 92 ° C と続く約 30 s. 変性増幅反応を続行を許可するための単一繊維 DNA の分子に分割するために使用設定。

「熱処理」、2 番目のフェーズは 2 に 3 ° C 2 つのプライマーの溶ける温度の下限を設定、通常 50 に 65 ° C からも続く間約 30 s. 溶融温度は二本鎖 DNA の 50% が分子が単一繊維に分離温度およびアニーリング ・ ステップできるようにプライマーが DNA テンプレートのターゲット サイトに結合します。

PCR のサイクルの第 3 段階は、「伸び」や「拡張」, DNA ポリメラーゼは、プライマー テンプレート二重にバインドし、新しい鎖の合成を触媒します。最も一般的に使用される PCR のポリメラーゼ、Taq、72 ° C で設定このフェーズの期間によって異なります私アンプリコン、通常 30 の長さ秒・ 500 ヒト。各サイクル後増幅された DNA 変性はもう一度、PCR の製品の量の急激な増加につながる新しいテンプレートとして提供しています。

反応が完了したら、PCR の製品は電気泳動と呼ばれるプロセス、ポリマー agarose の通常作られて「ゲル」でサイズによって解決できます。Dna のバックボーンで負電荷フィールドの肯定的な端の方に移住する原因し、電界が、ゲルの上で適用されます。一般的に言えば、大きい線形 DNA の分子はゲルのマトリックスを通して旅行がかかります。

PCR のしくみを理解したら、反応を使用して、環境試料中の微生物を特定する方法を見てをみましょう。

まず、ピペッティング エラーを考慮して追加 10% プラス処理されるサンプルの数に基づいて各試薬の必要量を計算します。-対象地域を含む - 肯定的な制御テンプレートは反応が動作していることを確認する含まれているべき否定的なだけでなく、DNA のテンプレートが反応コンポーネントのいずれかで汚染を排除するために、含まれていないを制御します。氷の上 Taq ポリメラーゼの酵素を保ち、残りの試薬と室温で汚染を防ぐために指定された層流フードの DNA サンプルを解凍します。

すべての試薬が解凍後、チューブ表面への分子の吸着による試薬量の不一致を最小限に抑える低結合および microfuge の管に各試薬量の集計を追加することで、試薬「マスター ミックス」を構成します。優しく渦、追加する前に各試薬を遠心力場します。一度マスター ミックスは準備される、渦をミックスし、遠心分離によって収集します。

各サンプルは、コントロールを含む 1 つの管を指定する 8 チューブ PCR ストリップにラベルを付けます。ストリップの各チューブに PCR マスター ミックスの適切な量を調剤します。次に、それぞれのチューブに各 DNA のサンプルを追加します。

ストリップ管を安全にストリップ キャップを置き、ストリップ アダプターとミニ遠心分離の遠心分離機の簡潔に。たちに管を配置し、適切な PCR プログラムに従って反応を実行します。

PCR を実行すると、PCR 産物の電気泳動用アガロース ゲルを準備します。PCR の製品のサイズに基づいて解決できる濃度ゲルの agarose 粉末の適切な量を重量を量る。125 mL フラスコ agarose を追加し、フラスコ、キャスト、ゲルの量に基づいて、ミックスに渦巻きにゲルの連続したバッファーの適切なボリュームを追加します。1 分のハイパワーでアガロース溶液を電子レンジします。完了したら、agarose が渦巻くこと、フラスコに完全に溶解を確認し、必要な場合、30 の単位で電子レンジを繰り返します。

しっかりと、フラスコにキャップを確保し、冷たい水を実行して下のフラスコを旋回で 50 ° C にアガロース溶液を冷却します。いったん冷却、agarose にエチジウム ブロマイドの 1 μ L を追加します。臭化エチジウムは潜在的に発癌、必ずエチジウム ブロマイド手袋、白衣、ゴーグルなどの保護具を着用します。

Agarose 内で閉じ込められている気泡がないかどうかを確かめて、電気泳動ゲル鋳造トレイにアガロース溶液を注ぐ。ソリューションに必要な井戸数と櫛を配置します。固めるための 20 から 30 分の室温でゲルを残します。一度ゲルを設定すると、プロセスでゲルを破らないように必ず櫛を慎重に取り外します。

固化したゲルを電気泳動室に配置します。ゲルは水中だけまでチャンバーに LB バッファーを追加します。パラフィルムの部分、上にピペットの PCR の製品の予測されるサイズの適切な範囲の DNA の梯子の「スポット」。たちから完成した反応と PCR チューブを取得します。簡単なの遠心分離によって PCR チューブ凝縮体を収集し、パラフィルム上に各サンプルの 8 μ L を追加します。PCR の製品の各スポットにローディングの染料 × 10 の 2 μ L を追加すると、染料の最終濃度は 2 倍。

Agarose のゲル、ゲルを通ってを突かないように注意しながら、指定された井戸にサンプルとはしごを読み込みます。読み込みが完了すると、電気泳動室に蓋の上に置くし、電極を電源装置に接続します。DNA は負に帯電し、肯定的な電極の方に移行、以来は、井戸マイナス電極に近い側に確認します。電源をオンにし、電気泳動室と使用されるバッファー システムのサイズに適切な電圧に設定。電気泳動を「実行する」を設定します。商工会議所の側面を移動の小さな泡になります電気泳動が正しく進んでいるかどうかを観察。

染料フロントはゲルを十分にずっと進んだ、電源をオフにします。慎重に electrophoresed 製品を視覚化するゲルのイメージャーとゲルを輸送します。保護シールドをオンに UV 光とゲルの DNA バンドを可視化します。それに予想されるパターンは環境サンプルの興味の種の存在を示す一致するバンドの位置を分析します。

今では PCR を実行する方法を見て、それが適用される様々 な方法を見てみましょう、環境への関心の微生物を検出します。

PCR 基づかせていた環境微生物検出の 1 つの使用は「脳を食べるアメーバ」など病気を引き起こす有機体を識別するために、フォーラーネグレリア、新鮮な水体としばしば致命的な人間の神経系を攻撃することができます unchlorinated プールは、単一のセルの生物。アメーバのゲノムのユニークな DNA シーケンスをターゲットのプライマーを用いて PCR を行い、水中のこの致命的な微生物の存在またはが疑われる患者の脳脊髄液をテストできます。

PCR による微生物同定のための別のアプリケーションは、はえ公衆衛生監視と疾患アウトブレイクの調査の一部として食品事業所付近における病原性細菌の存在をテストすることです。

ここでは、調査官はまず体表面とハエ、消化管からの細菌を隔離するし、興味のこれらの種の豊かに種特異的な培養条件を使用してリステリア菌サルモネラ菌などの病原性細菌の存在を見た。培養した菌から DNA を抽出した後市販の種特異的検出 PCR キットは、自分のアイデンティティをテストするため使用されました。

最後に、主要な公衆衛生問題である黄色ブドウ球菌などの抗生物質耐性の病原性細菌の異なった緊張を識別し、PCR と区別できます。

この例では、研究者は分離し臨床検体から黄色ブドウ球菌を培養し、細菌のコロニーから DNA を抽出し、PCR を行った。増幅反応をここで「多重化された」、細菌ゲノムの異なるユニークな地域をターゲットと複数のプライマー セットが同じ反応に結合されたことを意味します。個々 のプライマー セットは、各緊張に認められたバンド パターンのユニークな商品の組み合わせで、のみいくつかの系統が、その他の DNA にして PCR の製品ができるように設計されました。

PCR に基づく微生物の検出にゼウスのビデオを見てきただけ。ポリメラーゼの連鎖反応の原理を見てきました環境の微生物から抽出した DNA の PCR を行うためのプロトコルそして最後に、いくつか特定のアプリケーションこの手法の異なるタイプの環境または臨床サンプルに興味の生物をテストします。見てくれてありがとう!

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE