Détecter les microorganismes environnementales avec la réaction en chaîne par polymérase et électrophorèse sur Gel

Environmental Microbiology

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz

Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique utilisée pour détecter des microorganismes présents dans le sol, l’eau et les milieux atmosphériques. En amplifiant les sections spécifiques de l’ADN, la PCR peut faciliter la détection et l’identification des micro-organismes de la cible vers le bas pour l’espèce, la souche et sérotype/pathovar niveau. La technique peut également être utilisée pour caractériser des communautés entières de micro-organismes dans les échantillons.

La mise en culture de micro-organismes en laboratoire à l’aide de milieux de culture spécialisée est une technique établie de longue date et reste en usage pour la détection des micro-organismes dans les échantillons environnementaux. Beaucoup de microbes dans l’environnement naturel, vivant, maintenir de faibles niveaux d’activité métabolique et/ou le temps de doublement et est ainsi désignés comme viable mais non cultivable organismes (VBNC). L’utilisation de techniques axées sur la culture seules ne peut pas détecter ces microbes et, par conséquent, ne fournit pas une évaluation approfondie des populations microbiennes dans les échantillons. L’utilisation de la PCR permet la détection des microbes cultivables, les organismes VBNC, et ceux qui ne sont plus réceptive ou active, car l’amplification des séquences génétiques ne nécessite généralement pas de pré-enrichissement de micro-organismes présents dans les échantillons environnementaux. Cependant, PCR ne peut pas différencier les États susmentionnés de viabilité et d’activité. Lorsqu’il est combiné avec une ou plusieurs techniques basées sur la culture, la viabilité de certains sous-ensembles de micro-organismes peut-être encore être déterminée.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Essentiels de la microbiologie environnementale. Détecter les microorganismes environnementales avec la réaction en chaîne par polymérase et électrophorèse sur Gel. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

La prémisse fondamentale de PCR est d’utiliser des cycles répétés de changements de température séquentielle pour atteindre amplification exponentielle de l’ADN. La synthèse de l’ADN est effectuée par des enzymes de l’ADN polymérase qui proviennent de bactéries vivant dans les sources chaudes, par exemple Thermus aquaticus (Taq). Ces polymérases sont stables, ce qui leur permet de supporter les températures élevées utilisées pendant l’ACP à la chaleur.

La séquence cible, appelée l’amplicon, est amplifiée à partir de la matrice d’ADN à l’aide de deux tronçons courts de nucléotides appelées « élémentaires ». En raison de la grande spécificité de liaison complémentaires d’acides nucléiques, les amorces permettant l’amplification ciblée des séquences très spécifiques d’intérêt. En concevant des amorces qui amplifieront seulement une séquence unique (ou une combinaison unique de séquences) d’un organisme d’intérêt, ACP peut être employé pour détecter différemment pour la présence d’ADN de l’organisme parmi tous les matériaux génétiques présent dans un échantillon complex environnemental.

Pour effectuer le PCR, une machine appelée un thermocycleur est utilisée pour automatiquement afficher successivement les différentes températures nécessaires à la réaction. Chaque cycle est divisé en trois phases. Le premier, dite de « dénaturation », est généralement définie au-dessus de 92 ° C et dure environ 30 s. dénaturation est utilisée pour briser les molécules d’ADN torons, afin de permettre la réaction d’amplification de procéder.

La deuxième phase, « recuit », est définie à 2-3 ° C au-dessous de la partie inférieure de la température de fusion des deux amorces, habituellement entre 50-65 ° C et aussi dure environ 30 s. température de fusion est la température à laquelle 50 % de l’ADN bicaténaire ont séparé en simples brins, et donc l’étape de recuit permet les amorces se lier à leurs sites cibles dans la matrice d’ADN.

La troisième phase d’un cycle PCR est « allongement » ou « extension », lorsque l’ADN polymérase lie le duplex modèle primer et catalyse la synthèse du produit. Situé à 72 ° C pour la Taq polymérase, la durée de cette phase dépend de la longueur de l’amplicon, généralement 30 s / 500 bp. Après chaque cycle, l’amplification de l’ADN est une fois de plus dénaturé et sert comme un nouveau modèle, menant à une augmentation exponentielle de produits PCR.

Une fois que la réaction est terminée, les produits PCR peuvent être résolus en taille sur un « gel », généralement fait de l’agarose de polymère, un processus appelé électrophorèse. Un champ électrique est appliqué à travers le gel, et les charges négatives dans l’épine dorsale des molécules d’ADN les faire migrer vers l’extrémité positive du champ. De manière générale, les molécules d’ADN linéaires qui sont plus grandes prendra plus de temps à voyager à travers la matrice du gel.

Procedure

<>

1. le prélèvement

  1. Recueillir le sol à l’aide d’une tarière ou pelle jusqu'à une profondeur déterminée. Si la collecte du sol de la rhizosphère (la région étroite du sol entourant et influencé par les racines des plantes et leurs microbes associés), seulement percevoir directement auprès autour des racines de la plante en frappant le sol au large dans un tonneau de collection.
  2. Recueillir l’échantillon d’eau en plongeant une bouteille en plastique stérile dans l’eau tout en tenant l’extrémité de la baguette de trempage.

2. préparation et Extraction des acides nucléiques

  1. Recueillir les organismes et les virus dans l’échantillon et extraire l’ADN et l’ARN. Pour plus de détails, veuillez consulter la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
  2. Stocker l’ADN extraite dans des microtubes étiquetées. Si l’ADN doit être stocké pendant la nuit ou pour des périodes plus longues, congeler à-20 ° C et décongeler les tubes à température ambiante lorsqu’il est prêt pour utilisation.
  3. Si le matériel génétique à doser est RNA (si c’est le génome des virus à ARN, ou l’ARN transcrit des organismes multicellulaires), effectue la transcription inverse (RT) sur l’échantillon pour créer l’ADN complémentaire (ADNc) avant de procéder à la PCR. Pour plus de détails, veuillez vous référer à l’enseignement des sciences JoVE vidéo sur RT-PCR.

3. polymerase Chain Reaction

  1. Placez l’enzyme PCR (p. ex., Taq polymérase) sur la glace et dégeler les autres réactifs (tampon PCR, dNTPs, amorces) à l’intérieur d’une hotte « propre » désignée à la température ambiante. L’enzyme est stocké à-20 ° C mais ne gèle jamais. Il est sensible à la température et donc doit rester cool et son exposition à la température ambiante réduite
  2. Calculer le volume de chaque réactif nécessaire pour faire un « mix master » de tous les réactifs qui sont constants parmi toutes les réactions (tableau 1). Assurez-vous que tenir compte des résultats positifs (par exemple, un modèle connu pour contenir la région cible) et les contrôles négatifs (par exemple, aucun modèle) dans les calculs. Ajouter une majoration de 10 % pour le dernier volume pour tenir compte de l’erreur de pipettage. Volumes d’apprêt dépendent des dosages pour des organismes spécifiques ; reportez-vous à la documentation publiée pour les valeurs appropriées.
  3. À l’aide d’une liaison de faible microcentrifugeuse tube, ce qui réduit l’adhérence des molécules de réactifs aux parois en plastique, ajouter les volumes calculés de chaque réactif pour assembler des master mix. Doucement de vortex et centrifuger chaque réactif avant d’ajouter. Une fois le master mix est préparé, vortex à mélanger et à recueillir par centrifugation
  4. Préparer les bandes de 8 tubes PCR. Désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les contrôles positifs et négatifs
  5. Injecter le volume approprié de mélange PCR dans chaque tube de la bande
  6. Ajouter le volume approprié de la matrice d’ADN d’échantillons, ainsi que 5 μL du modèle positif et 5 μL d’eau moléculaire de catégorie comme contrôle négatif, dans les tubes PCR respectifs.
  7. Placer le capuchon solidement sur la bande de 8-tube et centrifuger pendant quelques secondes à l’aide d’un minicentrifuge
  8. Placez une bande de 8-tube dans un thermocycleur
  9. Définir le programme approprié PCR sur le thermocycleur. Un programme typique se compose des éléments suivants
    1. Dénaturation à 94 ° C pendant 3 min.
    2. 30 à 40 cycles d’amplification : dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à température amorce spécifique (généralement entre 50 et 60 ° C) pour 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 30 s / 500 bp.
    3. Extension finale à 72 ° C pendant 7-10 min.

4. préparation du Gel d’Agarose

  1. Selon le volume désiré gel et gel de concentration (tableau 2), peser la quantité appropriée de poudre d’agarose dans un erlenmeyer de 125 mL.
  2. Ajouter le volume approprié de tampon de gel en cours d’exécution dans la fiole et agiter le ballon à la main.
  3. Faire chauffer le mélange tampon-agarose dans un four à micro-ondes à puissance élevée pendant 1 min.
  4. Enlever le ballon du micro-ondes et agiter à la main pour s’assurer que tous l’agarose est dissout. Si l’agarose n’a pas été complètement dissous, répéter au micro-ondes par tranches de 30 s.
  5. Après s’être assuré fermement le bouchon sur le flacon, refroidir à 50 ° C en tournant sous l’eau froide courante.
  6. Ajouter 1 μL de bromure d’éthidium (EtBr) au mélange d’agarose en utilisant un micropippette désigné pour le bromure d’éthidium. Bromure d’éthidium est un colorant qui lie les acides nucléiques bicaténaires et émet une fluorescence orange lorsque illuminé par la lumière UV. Notez que EtBr est potentiellement cancérigène, donc des équipements de protection individuelle (lunettes, blouse de laboratoire, gants jetables de bromure d’éthidium) doivent être portés.
  7. Verser le gel fondu dans un bac de coulée de gel électrophorèse. Veillez à ce qu’aucune bulle n’est emprisonnées dans l’agarose. Placer un peigne dans le gel et la fixer solidement. Attendre environ 20-30 min pour le gel à se solidifier.
  8. Une fois le gel a solidifié, enlever soigneusement le peigne sans causer des déchirures dans le gel. Le peigne crée des puits dans le gel pour charger les échantillons.

5. électrophorèse sur gel de

  1. Placer le gel d’agarose solidifiée dans la chambre d’électrophorèse.
  2. Ajouter le tampon approprié en cours d’exécution dans la chambre jusqu'à ce que le gel est à peine immergé.
  3. Sur un morceau de Parafilm, Pipetter taches de chargement concentré de colorant. Également inclure une échelle d’ADN d’une gamme adaptée pour les tailles attendues des produits PCR. Vous pouvez également utiliser une nouvelle série de microtubes, un pour chaque échantillon.
  4. Une fois que l’ACP est terminée, récupérez cette bande 8-tube du thermocycleur et centrifuger brièvement pour recueillir les condensats. Ajouter un volume approprié du produit de l’ADN à la teinture de chargement et la pipette de haut en bas pour mélanger. Par exemple, 2 µL de 10 x chargement colorant est mélangé avec 8 µL de l’échantillon pour obtenir un volume final de 10 µL, avec le colorant à 1 x.
  5. Pipetter chaque mélange colorant-échantillon dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en veillant à ne pas percer les puits.
  6. Connecter les électrodes à la chambre d’électrophorèse. L’ADN est chargé négativement, pour qu’il « fonctionne » vers l’électrode positive. Par conséquent, connecter l’électrode positive de l’autre côté de la chambre, où les puits ont été chargés. Affectez à l’alimentation une tension appropriée pour le système d’amortisseur et la taille de la chambre de gel et affectez-lui exécuter. Petites bulles doivent être visibles, se déplaçant sur les côtés de la chambre si l’électrophorèse se déroule correctement.
  7. Une fois que le front de colorant a avancé assez loin vers le bas le gel, coupez l’alimentation de puissance. Soigneusement le gel dans le transilluminateur ou visual imageur de transport et allumez la lampe à UV lumière pour visualiser les bandes d’ADN sur le gel.
  8. Analyser la taille de bande et les positions sur le gel. Comparer les positions de la bande des échantillons pour le contrôle positif pour déterminer si l’ADN de l’organisme d’intérêt est présent dans l’échantillon (Figure 1).
Composant Volume par Tube (μL) Volume pour 5 tubes (μL) Concentration finale
10 x Ex tampon Taq 5.0 25 1 x
dNTPs 2,5 mM 4.0 20 0. 2 mM
Primer avant * 2.0 10 400 nM
Inverser l’apprêt * 2.0 10 400 nM
Moléculaire H2O 31.75 158.75 -
Ex Taq 0.25 1.25 2.5 U
Mélange PCR 45 225

Tableau 1. Les volumes de réactifs pour PCR master mix. * Volumes primer varient selon le dosage de l’organisme. Réglez le volume d’eau de grade moléculaires pour faire le μL 45 volume final. Volumes des autres composants ne devraient pas varier.

Recommandé % d’Agarose Résolution optimale pour Fragments d’ADN linéaire (paires de bases)
0,5 1 000-30 000
0,7 800-12 000
1.0 500-10 000
1.2 400-7 000
1.5 200-3 000
2.0 50-2,00

Le tableau 2. Gammes DNA fragment taille optimale résolus par des pourcentages de gel d’agarose différents.

La polymérisation en chaîne, ou PCR, est une technique biologique fondamentale qui est largement appliquée à la détection et l’identification des micro-organismes présents dans le sol, l’eau et autres échantillons environnementaux.

Classiquement, les micro-organismes sont mis en culture dans des laboratoires utilisant des milieux spécialisés. Cependant, beaucoup de microbes dans l’environnement naturel est « non-culturable » - soit parce qu’ils ont de très faible activité métabolique ou taux de croissance, soit parce qu’ils ont des exigences très strictes de la croissance qui n’est peut-être pas réplicables dans une boîte de Petri. Les différences de capacité cultivable chez les microbes signifient également que, lorsque les micro-organismes d’un échantillon environnemental sont cultivées, leur abondance relative dans la culture peut ne pas refléter leurs niveaux réels dans l’environnement.

L’avènement de la PCR, ce qui peut amplifier spécifiquement même de petites quantités d’ADN présent dans un échantillon mélangé, rend possible pour rapidement détecter et identifier les microbes spécifiques d’intérêt, même celles qui sont non cultivable, au sein de la gamme complexe des organismes présents dans un échantillon environnemental.

Cette vidéo va présenter les principes de la PCR. Il discutera ensuite un protocole général pour l’exécution de PCR sur l’ADN isolé d’un échantillon environnemental afin de détecter la présence d’un organisme d’intérêt. Enfin, plusieurs applications d’identification basées sur la PCR microbe seront explorées.

La prémisse fondamentale de PCR est d’utiliser répété des cycles séquentiels des variations de température pour obtenir une amplification exponentielle de l’ADN, habituellement avec une machine appelée un thermocycleur pour automatiquement afficher successivement les différentes températures. La synthèse de l’ADN est effectuée par des enzymes de l’ADN polymérase qui proviennent de bactéries vivant dans les sources chaudes, par exemple Thermus aquaticus ou « Taq ». Ces polymérases sont stables, ce qui leur permet de supporter les températures élevées utilisées pendant l’ACP à la chaleur.

La séquence cible, appelée l’amplicon, est amplifiée à partir de la matrice d’ADN à l’aide de deux tronçons courts de nucléotides appelées « élémentaires ». En raison de la grande spécificité de liaison complémentaires d’acides nucléiques, les amorces permettant l’amplification ciblée des séquences très spécifiques d’intérêt. En concevant des amorces qui vont amplifier uniquement une séquence unique, ou une combinaison unique de séquences, d’un organisme d’intérêt, ACP peut être employé pour détecter différemment pour la présence d’ADN de l’organisme parmi tous les matériaux génétiques présent dans un échantillon complex environnemental.

Chaque cycle PCR est divisé en trois phases. Le premier, dite de « dénaturation », est généralement définie au-dessus de 92 ° C et dure environ 30 s. dénaturation est utilisée pour briser les molécules d’ADN torons, afin de permettre la réaction d’amplification de procéder.

La deuxième phase, « recuit », a la valeur 2 à 3 ° C en dessous de la partie inférieure de la température de fusion des deux amorces, habituellement entre 50 et 65 ° C et aussi dure environ 30 s. température de fusion est la température à laquelle 50 % de l’ADN double-brin molécules ont séparé en simples brins et donc l’étape de recuit permet les amorces se lier à leurs sites cibles dans la matrice d’ADN.

La troisième phase d’un cycle PCR est « allongement » ou « extension », lorsque l’ADN polymérase lie le duplex modèle primer et catalyse la synthèse de nouveaux fils. Fixé à 72 ° C pendant la plus couramment utilisée polymérase PCR, Taq, la durée de cette phase dépend de la longueur de l’amplicon, généralement 30 s par 500 basepairs. Après chaque cycle, l’amplification de l’ADN est une fois de plus dénaturé et sert comme un nouveau modèle, menant à une augmentation exponentielle de produits PCR.

Une fois que la réaction est terminée, les produits PCR peuvent être résolus en taille sur un « gel », généralement fait de l’agarose de polymère, un processus appelé électrophorèse. Un champ électrique est appliqué à travers le gel, et les charges négatives dans l’épine dorsale des molécules d’ADN les faire migrer vers l’extrémité positive du champ. De manière générale, les molécules d’ADN linéaires qui sont plus grandes prendra plus de temps à voyager à travers la matrice du gel.

Maintenant que vous comprenez comment PCR fonctionne, nous allons jeter un oeil à la façon dont la réaction peut servir à identifier les microorganismes présents dans un échantillon environnemental.

Pour commencer, calculer le volume de chaque réactif nécessaire basée sur le nombre d’échantillons à traiter, plus une majoration de 10 % pour tenir compte des erreurs de pipetage. Un modèle de contrôle positif, qui contient la zone de la cible - soit insérée afin de s’assurer que la réaction fonctionne ; ainsi qu’un négatif contrôler où aucun modèle d’ADN n’est inclus, afin d’éviter la contamination dans les composantes de la réaction. Garder l’enzyme polymérase de Taq sur glace et décongeler le reste des réactifs et des échantillons d’ADN à température ambiante à une hotte à flux laminaire désigné pour éviter la contamination.

Une fois que tous les réactifs ont été décongelés, constituent le réactif « master mix » en ajoutant le volume calculé de chaque réactif dans un tube à centrifuger peu contraignantes, ce qui minimise les écarts dans les montants de réactif en raison de l’adsorption de molécules à la surface du tube. Doucement de vortex et centrifuger chaque réactif avant d’ajouter. Une fois le master mix est préparé, vortex à mélanger et à recueillir par centrifugation.

Une bande PCR 8-tube pour désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les contrôles de l’étiquette. Diluer la quantité appropriée de mélange maître PCR dans chaque tube de la bande. Puis, ajouter chaque échantillon d’ADN dans le tube respectif.

Placez le couvercle de la bande solidement sur le tube de la bande et centrifuger brièvement dans une mini-centrifugeuse avec un adaptateur de bande. Ensuite, placer le tube dans le thermocycleur et exécuter la réaction selon le programme approprié de la PCR.

Pendant que la PCR est en cours d’exécution, préparer un gel d’agarose pour l’électrophorèse des produits PCR. Peser une quantité appropriée de poudre d’agarose pour un gel avec une concentration pouvant résoudre les produits PCR basées sur leur taille attendue. Déposer l’agarose dans un flacon de 125 mL, puis ajouter le volume approprié de tampon de gel en cours d’exécution dans la fiole, basée sur le volume du gel coulé et agiter pour mélanger. La solution de l’agarose à haute puissance pendant 1 min au micro-ondes. Lorsque vous avez terminé, vérifiez que l’agarose est entièrement dissout en agitant le flacon et répéter au micro-ondes 30 s par incréments de si nécessaire.

Bien fixer le bouchon sur le flacon et refroidir la solution de gel d’agarose à 50 ° C en agitant le flacon sous l’eau froide courante. Une fois refroidi, ajoutez 1 μL de bromure d’éthidium à l’agarose. Le bromure d’éthidium étant potentiellement cancérigène, assurez-vous de porter des équipements de protection individuelle tels que lunettes, une blouse et gants résistants du bromure d’éthidium.

Verser la solution de gel d’agarose dans un bac de diffusion sur gel électrophorèse, veillant à ce qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnées dans l’agarose. Placez un peigne avec le nombre requis de puits dans la solution. Laisser le gel à température ambiante pendant 20 à 30 min à se solidifier. Une fois que le gel est pris, retirer délicatement le peigne, en faisant attention à ne pas déchirer le gel du processus.

Placer le gel solidifié dans la chambre d’électrophorèse. Ajouter LB mémoire tampon dans la chambre jusqu'à ce que le gel est juste submergé. Sur un morceau de Parafilm, distribuer un « spot » de l’échelle d’ADN d’une gamme adaptée à la taille attendue des produits PCR. Récupérer les tubes PCR avec les réactions remplies à partir du thermocycleur. Recueillir les condensats dans les tubes PCR par centrifugation courte et ajouter 8 μL de chaque échantillon sur du Parafilm. Ajouter 2 μL de 10 x chargement de colorant dans chaque endroit du produit PCR, afin que la concentration finale du colorant est x 2.

Charger l’échelle et des échantillons dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en veillant à ne pas pousser à travers le gel. Une fois que le chargement est terminé, placez le couvercle de la chambre d’électrophorèse et connecter les électrodes à l’alimentation. Puisque l’ADN est chargé négativement et migre vers l’électrode positive, veillez à ce que les puits sont sur le côté plus près à l’électrode négative. Allumez l’alimentation et affectez-lui une tension adaptée à la taille de la chambre de l’électrophorèse et le système de tampon utilisé. Définir l’électrophorèse pour « exécuter ». Petites bulles remontant les côtés de la chambre sera observée si l’électrophorèse se déroule correctement.

Une fois que le front de colorant a avancé assez loin vers le bas le gel, coupez l’alimentation de puissance. Le transport soigneusement le gel d’un imageur de gel pour visualiser les produits electrophoresed. Avec un bouclier protecteur, allumez la lampe à UV lumière et visualiser les bandes d’ADN sur le gel. Analyser la position des bandes pour voir si elle correspond au modèle attendu qui indique la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon environnemental.

Maintenant que vous avez vu comment PCR est réalisée, penchons-nous sur les diverses façons il est appliqué pour détecter des microorganismes d’intérêt dans l’environnement.

Une utilisation de basées sur la PCR de détection microbienne environnementale consiste à identifier les organismes pathogènes tels que le « mangeurs de cerveau amibe » Naegleria fowleri, un organisme unicellulaire trouvé dans des étendues d’eau douce et non chlorée des piscines qui peuvent attaquer le système nerveux humain, souvent de manière fatale. La présence de ce microbe mortel dans des échantillons d’eau soit ou le liquide céphalo-rachidien des patients suspects peuvent être testé en effectuant des PCR avec des amorces ciblant les séquences uniques d’ADN dans le génome de l’amibe.

Une autre application pour identification microbienne basées sur la PCR est de tester la présence de bactéries pathogènes chez les mouches capturées dans les environs les établissements alimentaires, dans le cadre des enquêtes de santé publique de surveillance et de la maladie d’éclosion.

Ici, les enquêteurs ont cherché la présence de bactéries pathogènes tels que Salmonella et Listeria, en tout d’abord isoler les bactéries de la surface du corps et le canal digestif de mouches et en utilisant les conditions de culture propres à chaque espèce d’enrichir pour ces espèces d’intérêt. Après l’extraction de l’ADN de toutes les bactéries qui ont été cultivés, kits de PCR de détection spécifiques disponibles dans le commerce a été utilisé pour tester leur identité.

Enfin, les différentes souches de résistance aux antibiotiques bactéries pathogènes telles Staphylococcus aureus, qui présentent des problèmes de santé publique majeur, peuvent être identifiés et différenciées avec PCR.

Dans cet exemple, chercheurs isolement et cultivées S. aureus à partir d’échantillons cliniques, puis extrait l’ADN des colonies bactériennes et jouée PCR. Les réactions d’amplification ici ont été « multiplexées », ce qui signifie que plusieurs paires d’amorces ciblant différentes régions uniques du génome bactérien ont été regroupées dans la même réaction. Amorces individuels ont été conçus pour que les produits PCR résultent de l’ADN de seulement certaines souches mais pas les autres, afin qu’ensemble, produit unique bande ont été observées pour chaque souche.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la détection de micro-organismes basées sur la PCR. Nous avons examiné les principes qui sous-tendent la réaction en chaîne par polymérase ; un protocole pour effectuer des PCR sur l’ADN extrait de micro-organismes environnementaux ; et enfin, plusieurs applications spécifiques de cette technique pour tester les organismes d’intérêt dans différents types d’échantillons environnementaux ou cliniques. Merci de regarder !

Results

Dans la Figure 1, l’échelle d’ADN (piste 1) fournit une référence à la taille et la concentration approximative pour les bandes des produits PCR. Le contrôle négatif (piste 2) ne contient-elle pas de matériel génétique, tandis que le contrôle positif (piste 3) est amplifié à partir de modèles connus pour contenir la cible ADN pour indiquer la taille et l’emplacement de zones-cibles. Échantillons de 4, 6, 8 et 9 pièce tendance bande semblable comme contrôle positif, indiquant donc que ces échantillons contiennent le matériel génétique de la cible. Il peut être déduit que l’organisme est présent dans les milieux d'où proviennent ces échantillons.

Figure 1
La figure 1. Visualisation des bandes sur gel d’agarose après électrophorèse.

Applications and Summary

PCR peut être utilisée pour déterminer rapidement la présence ou l’absence d’agents pathogènes dans l’environnement. Par exemple, les amorces spécifiques à l’amibe mangeur de cerveau, Naegleria fowleri, vont amplifier l’ADN et produire des bandes fortes sur un gel si l’organisme est présent dans un échantillon. Si un organisme n’est pas l’intérêt principal, mais plutôt les gènes associés à la production de toxines provenant d’une variété d’organismes, PCR peut également servir à déterminer la présence ou l’absence de ces matériaux génétiques spécifiques.

PCR peut également être utilisée comme une procédure de confirmation lors de l’analyse environnementales microbes en laboratoire. Si une méthode de culture ne peut pas différencier entre certains organismes qui sont présents dans un échantillon environnemental, puis PCR peut-être utilisée pour distinguer précisément les microbes de candidat.

PCR classique peut être modifié de différentes façons à des fins expérimentales particulières. ACP peut être employé pour analyser les modèles RNA monocaténaire par couplage à une étape de transcription inverse (RT-PCR). Au-delà d’une détermination de la présence ou l’absence, la PCR quantitative (qPCR) permet de mesurer la concentration d’ADN spécifique d’intérêt.

<>

1. le prélèvement

  1. Recueillir le sol à l’aide d’une tarière ou pelle jusqu'à une profondeur déterminée. Si la collecte du sol de la rhizosphère (la région étroite du sol entourant et influencé par les racines des plantes et leurs microbes associés), seulement percevoir directement auprès autour des racines de la plante en frappant le sol au large dans un tonneau de collection.
  2. Recueillir l’échantillon d’eau en plongeant une bouteille en plastique stérile dans l’eau tout en tenant l’extrémité de la baguette de trempage.

2. préparation et Extraction des acides nucléiques

  1. Recueillir les organismes et les virus dans l’échantillon et extraire l’ADN et l’ARN. Pour plus de détails, veuillez consulter la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
  2. Stocker l’ADN extraite dans des microtubes étiquetées. Si l’ADN doit être stocké pendant la nuit ou pour des périodes plus longues, congeler à-20 ° C et décongeler les tubes à température ambiante lorsqu’il est prêt pour utilisation.
  3. Si le matériel génétique à doser est RNA (si c’est le génome des virus à ARN, ou l’ARN transcrit des organismes multicellulaires), effectue la transcription inverse (RT) sur l’échantillon pour créer l’ADN complémentaire (ADNc) avant de procéder à la PCR. Pour plus de détails, veuillez vous référer à l’enseignement des sciences JoVE vidéo sur RT-PCR.

3. polymerase Chain Reaction

  1. Placez l’enzyme PCR (p. ex., Taq polymérase) sur la glace et dégeler les autres réactifs (tampon PCR, dNTPs, amorces) à l’intérieur d’une hotte « propre » désignée à la température ambiante. L’enzyme est stocké à-20 ° C mais ne gèle jamais. Il est sensible à la température et donc doit rester cool et son exposition à la température ambiante réduite
  2. Calculer le volume de chaque réactif nécessaire pour faire un « mix master » de tous les réactifs qui sont constants parmi toutes les réactions (tableau 1). Assurez-vous que tenir compte des résultats positifs (par exemple, un modèle connu pour contenir la région cible) et les contrôles négatifs (par exemple, aucun modèle) dans les calculs. Ajouter une majoration de 10 % pour le dernier volume pour tenir compte de l’erreur de pipettage. Volumes d’apprêt dépendent des dosages pour des organismes spécifiques ; reportez-vous à la documentation publiée pour les valeurs appropriées.
  3. À l’aide d’une liaison de faible microcentrifugeuse tube, ce qui réduit l’adhérence des molécules de réactifs aux parois en plastique, ajouter les volumes calculés de chaque réactif pour assembler des master mix. Doucement de vortex et centrifuger chaque réactif avant d’ajouter. Une fois le master mix est préparé, vortex à mélanger et à recueillir par centrifugation
  4. Préparer les bandes de 8 tubes PCR. Désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les contrôles positifs et négatifs
  5. Injecter le volume approprié de mélange PCR dans chaque tube de la bande
  6. Ajouter le volume approprié de la matrice d’ADN d’échantillons, ainsi que 5 μL du modèle positif et 5 μL d’eau moléculaire de catégorie comme contrôle négatif, dans les tubes PCR respectifs.
  7. Placer le capuchon solidement sur la bande de 8-tube et centrifuger pendant quelques secondes à l’aide d’un minicentrifuge
  8. Placez une bande de 8-tube dans un thermocycleur
  9. Définir le programme approprié PCR sur le thermocycleur. Un programme typique se compose des éléments suivants
    1. Dénaturation à 94 ° C pendant 3 min.
    2. 30 à 40 cycles d’amplification : dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à température amorce spécifique (généralement entre 50 et 60 ° C) pour 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 30 s / 500 bp.
    3. Extension finale à 72 ° C pendant 7-10 min.

4. préparation du Gel d’Agarose

  1. Selon le volume désiré gel et gel de concentration (tableau 2), peser la quantité appropriée de poudre d’agarose dans un erlenmeyer de 125 mL.
  2. Ajouter le volume approprié de tampon de gel en cours d’exécution dans la fiole et agiter le ballon à la main.
  3. Faire chauffer le mélange tampon-agarose dans un four à micro-ondes à puissance élevée pendant 1 min.
  4. Enlever le ballon du micro-ondes et agiter à la main pour s’assurer que tous l’agarose est dissout. Si l’agarose n’a pas été complètement dissous, répéter au micro-ondes par tranches de 30 s.
  5. Après s’être assuré fermement le bouchon sur le flacon, refroidir à 50 ° C en tournant sous l’eau froide courante.
  6. Ajouter 1 μL de bromure d’éthidium (EtBr) au mélange d’agarose en utilisant un micropippette désigné pour le bromure d’éthidium. Bromure d’éthidium est un colorant qui lie les acides nucléiques bicaténaires et émet une fluorescence orange lorsque illuminé par la lumière UV. Notez que EtBr est potentiellement cancérigène, donc des équipements de protection individuelle (lunettes, blouse de laboratoire, gants jetables de bromure d’éthidium) doivent être portés.
  7. Verser le gel fondu dans un bac de coulée de gel électrophorèse. Veillez à ce qu’aucune bulle n’est emprisonnées dans l’agarose. Placer un peigne dans le gel et la fixer solidement. Attendre environ 20-30 min pour le gel à se solidifier.
  8. Une fois le gel a solidifié, enlever soigneusement le peigne sans causer des déchirures dans le gel. Le peigne crée des puits dans le gel pour charger les échantillons.

5. électrophorèse sur gel de

  1. Placer le gel d’agarose solidifiée dans la chambre d’électrophorèse.
  2. Ajouter le tampon approprié en cours d’exécution dans la chambre jusqu'à ce que le gel est à peine immergé.
  3. Sur un morceau de Parafilm, Pipetter taches de chargement concentré de colorant. Également inclure une échelle d’ADN d’une gamme adaptée pour les tailles attendues des produits PCR. Vous pouvez également utiliser une nouvelle série de microtubes, un pour chaque échantillon.
  4. Une fois que l’ACP est terminée, récupérez cette bande 8-tube du thermocycleur et centrifuger brièvement pour recueillir les condensats. Ajouter un volume approprié du produit de l’ADN à la teinture de chargement et la pipette de haut en bas pour mélanger. Par exemple, 2 µL de 10 x chargement colorant est mélangé avec 8 µL de l’échantillon pour obtenir un volume final de 10 µL, avec le colorant à 1 x.
  5. Pipetter chaque mélange colorant-échantillon dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en veillant à ne pas percer les puits.
  6. Connecter les électrodes à la chambre d’électrophorèse. L’ADN est chargé négativement, pour qu’il « fonctionne » vers l’électrode positive. Par conséquent, connecter l’électrode positive de l’autre côté de la chambre, où les puits ont été chargés. Affectez à l’alimentation une tension appropriée pour le système d’amortisseur et la taille de la chambre de gel et affectez-lui exécuter. Petites bulles doivent être visibles, se déplaçant sur les côtés de la chambre si l’électrophorèse se déroule correctement.
  7. Une fois que le front de colorant a avancé assez loin vers le bas le gel, coupez l’alimentation de puissance. Soigneusement le gel dans le transilluminateur ou visual imageur de transport et allumez la lampe à UV lumière pour visualiser les bandes d’ADN sur le gel.
  8. Analyser la taille de bande et les positions sur le gel. Comparer les positions de la bande des échantillons pour le contrôle positif pour déterminer si l’ADN de l’organisme d’intérêt est présent dans l’échantillon (Figure 1).
Composant Volume par Tube (μL) Volume pour 5 tubes (μL) Concentration finale
10 x Ex tampon Taq 5.0 25 1 x
dNTPs 2,5 mM 4.0 20 0. 2 mM
Primer avant * 2.0 10 400 nM
Inverser l’apprêt * 2.0 10 400 nM
Moléculaire H2O 31.75 158.75 -
Ex Taq 0.25 1.25 2.5 U
Mélange PCR 45 225

Tableau 1. Les volumes de réactifs pour PCR master mix. * Volumes primer varient selon le dosage de l’organisme. Réglez le volume d’eau de grade moléculaires pour faire le μL 45 volume final. Volumes des autres composants ne devraient pas varier.

Recommandé % d’Agarose Résolution optimale pour Fragments d’ADN linéaire (paires de bases)
0,5 1 000-30 000
0,7 800-12 000
1.0 500-10 000
1.2 400-7 000
1.5 200-3 000
2.0 50-2,00

Le tableau 2. Gammes DNA fragment taille optimale résolus par des pourcentages de gel d’agarose différents.

La polymérisation en chaîne, ou PCR, est une technique biologique fondamentale qui est largement appliquée à la détection et l’identification des micro-organismes présents dans le sol, l’eau et autres échantillons environnementaux.

Classiquement, les micro-organismes sont mis en culture dans des laboratoires utilisant des milieux spécialisés. Cependant, beaucoup de microbes dans l’environnement naturel est « non-culturable » - soit parce qu’ils ont de très faible activité métabolique ou taux de croissance, soit parce qu’ils ont des exigences très strictes de la croissance qui n’est peut-être pas réplicables dans une boîte de Petri. Les différences de capacité cultivable chez les microbes signifient également que, lorsque les micro-organismes d’un échantillon environnemental sont cultivées, leur abondance relative dans la culture peut ne pas refléter leurs niveaux réels dans l’environnement.

L’avènement de la PCR, ce qui peut amplifier spécifiquement même de petites quantités d’ADN présent dans un échantillon mélangé, rend possible pour rapidement détecter et identifier les microbes spécifiques d’intérêt, même celles qui sont non cultivable, au sein de la gamme complexe des organismes présents dans un échantillon environnemental.

Cette vidéo va présenter les principes de la PCR. Il discutera ensuite un protocole général pour l’exécution de PCR sur l’ADN isolé d’un échantillon environnemental afin de détecter la présence d’un organisme d’intérêt. Enfin, plusieurs applications d’identification basées sur la PCR microbe seront explorées.

La prémisse fondamentale de PCR est d’utiliser répété des cycles séquentiels des variations de température pour obtenir une amplification exponentielle de l’ADN, habituellement avec une machine appelée un thermocycleur pour automatiquement afficher successivement les différentes températures. La synthèse de l’ADN est effectuée par des enzymes de l’ADN polymérase qui proviennent de bactéries vivant dans les sources chaudes, par exemple Thermus aquaticus ou « Taq ». Ces polymérases sont stables, ce qui leur permet de supporter les températures élevées utilisées pendant l’ACP à la chaleur.

La séquence cible, appelée l’amplicon, est amplifiée à partir de la matrice d’ADN à l’aide de deux tronçons courts de nucléotides appelées « élémentaires ». En raison de la grande spécificité de liaison complémentaires d’acides nucléiques, les amorces permettant l’amplification ciblée des séquences très spécifiques d’intérêt. En concevant des amorces qui vont amplifier uniquement une séquence unique, ou une combinaison unique de séquences, d’un organisme d’intérêt, ACP peut être employé pour détecter différemment pour la présence d’ADN de l’organisme parmi tous les matériaux génétiques présent dans un échantillon complex environnemental.

Chaque cycle PCR est divisé en trois phases. Le premier, dite de « dénaturation », est généralement définie au-dessus de 92 ° C et dure environ 30 s. dénaturation est utilisée pour briser les molécules d’ADN torons, afin de permettre la réaction d’amplification de procéder.

La deuxième phase, « recuit », a la valeur 2 à 3 ° C en dessous de la partie inférieure de la température de fusion des deux amorces, habituellement entre 50 et 65 ° C et aussi dure environ 30 s. température de fusion est la température à laquelle 50 % de l’ADN double-brin molécules ont séparé en simples brins et donc l’étape de recuit permet les amorces se lier à leurs sites cibles dans la matrice d’ADN.

La troisième phase d’un cycle PCR est « allongement » ou « extension », lorsque l’ADN polymérase lie le duplex modèle primer et catalyse la synthèse de nouveaux fils. Fixé à 72 ° C pendant la plus couramment utilisée polymérase PCR, Taq, la durée de cette phase dépend de la longueur de l’amplicon, généralement 30 s par 500 basepairs. Après chaque cycle, l’amplification de l’ADN est une fois de plus dénaturé et sert comme un nouveau modèle, menant à une augmentation exponentielle de produits PCR.

Une fois que la réaction est terminée, les produits PCR peuvent être résolus en taille sur un « gel », généralement fait de l’agarose de polymère, un processus appelé électrophorèse. Un champ électrique est appliqué à travers le gel, et les charges négatives dans l’épine dorsale des molécules d’ADN les faire migrer vers l’extrémité positive du champ. De manière générale, les molécules d’ADN linéaires qui sont plus grandes prendra plus de temps à voyager à travers la matrice du gel.

Maintenant que vous comprenez comment PCR fonctionne, nous allons jeter un oeil à la façon dont la réaction peut servir à identifier les microorganismes présents dans un échantillon environnemental.

Pour commencer, calculer le volume de chaque réactif nécessaire basée sur le nombre d’échantillons à traiter, plus une majoration de 10 % pour tenir compte des erreurs de pipetage. Un modèle de contrôle positif, qui contient la zone de la cible - soit insérée afin de s’assurer que la réaction fonctionne ; ainsi qu’un négatif contrôler où aucun modèle d’ADN n’est inclus, afin d’éviter la contamination dans les composantes de la réaction. Garder l’enzyme polymérase de Taq sur glace et décongeler le reste des réactifs et des échantillons d’ADN à température ambiante à une hotte à flux laminaire désigné pour éviter la contamination.

Une fois que tous les réactifs ont été décongelés, constituent le réactif « master mix » en ajoutant le volume calculé de chaque réactif dans un tube à centrifuger peu contraignantes, ce qui minimise les écarts dans les montants de réactif en raison de l’adsorption de molécules à la surface du tube. Doucement de vortex et centrifuger chaque réactif avant d’ajouter. Une fois le master mix est préparé, vortex à mélanger et à recueillir par centrifugation.

Une bande PCR 8-tube pour désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les contrôles de l’étiquette. Diluer la quantité appropriée de mélange maître PCR dans chaque tube de la bande. Puis, ajouter chaque échantillon d’ADN dans le tube respectif.

Placez le couvercle de la bande solidement sur le tube de la bande et centrifuger brièvement dans une mini-centrifugeuse avec un adaptateur de bande. Ensuite, placer le tube dans le thermocycleur et exécuter la réaction selon le programme approprié de la PCR.

Pendant que la PCR est en cours d’exécution, préparer un gel d’agarose pour l’électrophorèse des produits PCR. Peser une quantité appropriée de poudre d’agarose pour un gel avec une concentration pouvant résoudre les produits PCR basées sur leur taille attendue. Déposer l’agarose dans un flacon de 125 mL, puis ajouter le volume approprié de tampon de gel en cours d’exécution dans la fiole, basée sur le volume du gel coulé et agiter pour mélanger. La solution de l’agarose à haute puissance pendant 1 min au micro-ondes. Lorsque vous avez terminé, vérifiez que l’agarose est entièrement dissout en agitant le flacon et répéter au micro-ondes 30 s par incréments de si nécessaire.

Bien fixer le bouchon sur le flacon et refroidir la solution de gel d’agarose à 50 ° C en agitant le flacon sous l’eau froide courante. Une fois refroidi, ajoutez 1 μL de bromure d’éthidium à l’agarose. Le bromure d’éthidium étant potentiellement cancérigène, assurez-vous de porter des équipements de protection individuelle tels que lunettes, une blouse et gants résistants du bromure d’éthidium.

Verser la solution de gel d’agarose dans un bac de diffusion sur gel électrophorèse, veillant à ce qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnées dans l’agarose. Placez un peigne avec le nombre requis de puits dans la solution. Laisser le gel à température ambiante pendant 20 à 30 min à se solidifier. Une fois que le gel est pris, retirer délicatement le peigne, en faisant attention à ne pas déchirer le gel du processus.

Placer le gel solidifié dans la chambre d’électrophorèse. Ajouter LB mémoire tampon dans la chambre jusqu'à ce que le gel est juste submergé. Sur un morceau de Parafilm, distribuer un « spot » de l’échelle d’ADN d’une gamme adaptée à la taille attendue des produits PCR. Récupérer les tubes PCR avec les réactions remplies à partir du thermocycleur. Recueillir les condensats dans les tubes PCR par centrifugation courte et ajouter 8 μL de chaque échantillon sur du Parafilm. Ajouter 2 μL de 10 x chargement de colorant dans chaque endroit du produit PCR, afin que la concentration finale du colorant est x 2.

Charger l’échelle et des échantillons dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en veillant à ne pas pousser à travers le gel. Une fois que le chargement est terminé, placez le couvercle de la chambre d’électrophorèse et connecter les électrodes à l’alimentation. Puisque l’ADN est chargé négativement et migre vers l’électrode positive, veillez à ce que les puits sont sur le côté plus près à l’électrode négative. Allumez l’alimentation et affectez-lui une tension adaptée à la taille de la chambre de l’électrophorèse et le système de tampon utilisé. Définir l’électrophorèse pour « exécuter ». Petites bulles remontant les côtés de la chambre sera observée si l’électrophorèse se déroule correctement.

Une fois que le front de colorant a avancé assez loin vers le bas le gel, coupez l’alimentation de puissance. Le transport soigneusement le gel d’un imageur de gel pour visualiser les produits electrophoresed. Avec un bouclier protecteur, allumez la lampe à UV lumière et visualiser les bandes d’ADN sur le gel. Analyser la position des bandes pour voir si elle correspond au modèle attendu qui indique la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon environnemental.

Maintenant que vous avez vu comment PCR est réalisée, penchons-nous sur les diverses façons il est appliqué pour détecter des microorganismes d’intérêt dans l’environnement.

Une utilisation de basées sur la PCR de détection microbienne environnementale consiste à identifier les organismes pathogènes tels que le « mangeurs de cerveau amibe » Naegleria fowleri, un organisme unicellulaire trouvé dans des étendues d’eau douce et non chlorée des piscines qui peuvent attaquer le système nerveux humain, souvent de manière fatale. La présence de ce microbe mortel dans des échantillons d’eau soit ou le liquide céphalo-rachidien des patients suspects peuvent être testé en effectuant des PCR avec des amorces ciblant les séquences uniques d’ADN dans le génome de l’amibe.

Une autre application pour identification microbienne basées sur la PCR est de tester la présence de bactéries pathogènes chez les mouches capturées dans les environs les établissements alimentaires, dans le cadre des enquêtes de santé publique de surveillance et de la maladie d’éclosion.

Ici, les enquêteurs ont cherché la présence de bactéries pathogènes tels que Salmonella et Listeria, en tout d’abord isoler les bactéries de la surface du corps et le canal digestif de mouches et en utilisant les conditions de culture propres à chaque espèce d’enrichir pour ces espèces d’intérêt. Après l’extraction de l’ADN de toutes les bactéries qui ont été cultivés, kits de PCR de détection spécifiques disponibles dans le commerce a été utilisé pour tester leur identité.

Enfin, les différentes souches de résistance aux antibiotiques bactéries pathogènes telles Staphylococcus aureus, qui présentent des problèmes de santé publique majeur, peuvent être identifiés et différenciées avec PCR.

Dans cet exemple, chercheurs isolement et cultivées S. aureus à partir d’échantillons cliniques, puis extrait l’ADN des colonies bactériennes et jouée PCR. Les réactions d’amplification ici ont été « multiplexées », ce qui signifie que plusieurs paires d’amorces ciblant différentes régions uniques du génome bactérien ont été regroupées dans la même réaction. Amorces individuels ont été conçus pour que les produits PCR résultent de l’ADN de seulement certaines souches mais pas les autres, afin qu’ensemble, produit unique bande ont été observées pour chaque souche.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la détection de micro-organismes basées sur la PCR. Nous avons examiné les principes qui sous-tendent la réaction en chaîne par polymérase ; un protocole pour effectuer des PCR sur l’ADN extrait de micro-organismes environnementaux ; et enfin, plusieurs applications spécifiques de cette technique pour tester les organismes d’intérêt dans différents types d’échantillons environnementaux ou cliniques. Merci de regarder !

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE