RT-PCR 法を用いた環境試料の RNA 解析

Environmental Microbiology

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Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) は、従来の PCR と同じプロセス-核酸を増幅するサイクリングの温度。しかし、従来の PCR は、デオキシリボ核酸 (DNA) を増幅するだけ中、RT-PCR は相補的 DNA (cDNA) の形成をリボ核酸 (RNA) の増幅をできます。これにより、RNA に基づく生物環境分析の利用法や DNA のために設計されている技術の内で見つかった。

環境は、多くのウイルスは、彼らの遺伝物質として RNA を使用します。いくつか RNA 型ウイルスの病原体、ノロウイルス、トウガラシマイルドモットル ウイルス (PMMoV) などの指標生物などには、定量化のため文化基づかせていた検出メソッドはありません。土壌、水、農業、から環境試料中のこれらの RNA ウイルスの存在を検出するために分子アッセイは、RNA を DNA に変換する RT-PCR 法に依存します。RT-PCR 微生物学者ないなければ試金や健康や環境にリスクをもたらす多数の RNA ベースのウイルスを研究することができます。

RT-PCR は、環境における微生物の活性を測定するツールとしても使用できます。メッセンジャー RNA (mRNA) タンパク質翻訳の単一座礁させたテンプレートでありそこから微生物が環境の中で表現されているどの遺伝子を示す別の Mrna のレベルを測定します。遺伝子発現解析にどのような生物学的経路が異なる環境で生き残るために生物によって使用される手がかりを与えます。いくつかのケースでは、生物が生き残るため過酷な条件で最高と汚染された土壌や水の浄化のための機能を持っているを決定する遺伝子発現を利用できます。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. RT-PCR 法を用いた環境試料の RNA 解析. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

PCR は生物からの RNA の検出でその使用が制限される DNA テンプレートの増幅に基づいています。ただし、RT-PCR は逆転写酵素 (RT) と呼ばれる特殊な酵素を使用して cDNA を生成する RNA を使用するための手段を提供します。この cDNA は、従来 PCR (図 1) にその後拡大のため開始のテンプレートとして使用できます。

逆のトランスクリプションを制御することができますテンプレート cDNA 合成のみ希望の製品または全体のコミュニティによっては、プライマーの環境試料内にある核酸の増幅に使用します。これは、土壌と水のサンプルの特定の分析の必要のない様々 な核酸と飽和頻繁に重要です。微生物の任意のタイプの RNA シーケンスにバインドできます、ランダムのプライマーに存在し、環境内の複数の生物の相対量サンプルを分析できますのでほとんどの RNA を検出する RT-PCR 法で使用できます。一方、配列特異プライマーは cDNA を合成するだけ 1 つまたは少数の有機体の正確なシーケンスを開始します。これはノロウイルス人間の胃腸の病気を引き起こす可能性が、水に存在するかどうかを決定するなど、特定の目的をテストする環境試料をことができます。


Figure 1
図 1。環境の RNA サンプルの RT-PCR 分析のステップバイ ステップのプロセスです。

Procedure

<>

1. サンプル コレクション: 土壌サンプル

  1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
  2. ランダム サンプリングは、微生物の生息地の一般的な人口調査を取得するエリア内にランダム ポイントを選択します。トランセクトに沿って直線、例えば河床に隣接するポイントからサンプリング収集。グリッド サンプルは体系的に、定期的にポイントから取られる、未知または可変領域のマッピング微生物群集に便利。
  3. 3-6 インチ (7.5-15 cm) 内サンプリング深度は内ではなく、根 (植物の根とその関連付けられた微生物の影響を直接受ける土の狭い地域) が近く、最も豊富な微生物の活動へのアクセスを提供します。
  4. 土のサンプルを収集するために押して所定の深さまで地面に手オーガーを回転します。
  5. オーガーを持ち上げます。オーガーの中空の茎内土壌にあります。
  6. 土壌回収袋にオーガーの底に土をこすり。タッチや土壌を汚染するにしないようにします。
  7. 場所、名前、日付、および時間に正しく袋にラベルを付けます。
  8. 所、砂利や岩を削除する 2 mm ふるい土を渡します。
  9. 土壌水分のための土の部分を分析します。この手順の詳細については、土壌水分にゼウス科学教育ビデオを参照してください。

2. サンプル コレクション: 水サンプル

  1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
  2. ストレージ ボトルの中の水を収集します。水の量のレコードの収集;場合は、サンプル中の微生物は、検定定量的微生物濃度は収集量に基づいて決定できます。
  3. (温度、pH、導電率、塩分、窒素、燐等) の実験に必要な任意のパラメーターのための水をすぐにテスト適切な電子プローブを用いたします。
  4. 氷をクーラーに水のサンプルを含むボトルを置きます。研究室にクーラーを転送します。

3. RNA の抽出

  1. 収集し、環境試料からの微生物を集中、ゼウス科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
  2. 製造元の指示に従って商業抽出キットを使用してウイルスから RNA を抽出します。
  3. 簡単に言えば、最初エタノール添加の換散バッファーのサンプルをミックスし、スピンの列にサンプルを追加します。
  4. 約 12,000 × g、破棄の流れる通路に列を遠心します。列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。
  5. 列および 30 の遠心分離機に RNase フリー水を加える s 滅菌 1.5 mL 低接着 microfuge の管に RNA を溶出します。

4. 逆転写 - PCR

  1. -20 ° C のフリーザーから次の試薬を取得: dNTP、集中 (例えば、10 倍) を逆転写バッファー (この例では、ランダムなプライマー) のプライマー。氷の上やクリーン フード内室温でこれらを解凍し、一度融解したもの氷のそれらを保ちます。また逆転写酵素と RNase 阻害剤取得し、氷の上にそれらを保ちます。
  2. すべての試薬を組み合わせた「マスター ミックス」をすべての反応の間で一定に必要な試薬体積を計算 (サンプル反応は表 1を参照)。(知られているトラン スクリプト テンプレートを使用して) 肯定的な制御と同様に、あらゆるサンプルのため十分なマスター ミックスを準備し、否定的な反応 (例えば逆転写酵素、テンプレート等と水だけでなく) を制御します。ボリュームに余分な 10% を含めます。
  3. 1.5 mL 低接着 microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これは、チューブのプラスチック壁に試薬の分子の結合を最小限に抑えます。
  4. 試薬がフリーズ解除とき、および microfuge の管に計算されたボリュームを追加します。優しく渦、加算の前に各チューブを遠心力場します。汚染を防ぐために各試薬を追加間ピペット チップを変更することを確認します。
  5. 後すべての試薬が追加されました、渦および遠心分離機の均一混合物を確保するためのマスターの組合せ。-20 ° C で貯蔵に戻って試薬を入れる
  6. 準備、ラベルの 8 チューブ PCR ストリップ、各サンプルまたはコントロールの反作用のための 1 つの管を指定します。
  7. 各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物などの反応に固有のコンポーネントを追加します。
  8. PCR ストリップにしっかりとストリップ キャップを置きに各管 (図 2) の下部にすべての液体を収集するストリップ管アダプターと minicentrifuge の遠心分離機します。
  9. たちでしっかり場所 PCR ストリップ。チューブを保護する押し。
  10. 使用されている RT の適切なプログラムを実行するたちを設定 (サンプル プロトコルの表 2を参照)。プログラムが完了したら、チューブ PCR 増幅に受けることができますし、cDNA 等が含まれます。詳細については、PCR および量的な PCR のゼウス科学教育ビデオを参照してください。使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。

Figure 2
図 2。マスター ミックスとエキスを含む 8 チューブ ストリップを頂いた。

試薬 1 反応 (μ L) あたりのボリューム
RT バッファー x 10 2.0
25 x dNTPs 0.8
任意プライマー x 10 2.0
Multiscribe 1.0
リボヌクレアーゼ阻害剤 1.0
分子グレード H2O 3.2
総容積 10

表 1。RT マスター ミックスの成分。

ステップ 1 ステップ 2 ステップ 3 ステップ 4
25 ° C、10 分 37 ° C、120 分 85 ° C、5 分 4 ° C、∞

表 2。RT 反応たちプログラム。

逆のトランスクリプション ポリメラーゼの連鎖反応、または RT-PCR、RNA ウイルスと環境微生物の遺伝子発現の検出が有効です。

人間から、遺伝物質として DNA を使用している、細菌に細胞生物とは異なりいくつかのウイルス インフルエンザ、エボラ、HIV など多くの病原性ウイルスを含む RNA のゲノムがあります。大半が文化に基づく特性評価手法.を持たないしながら開発するため、細胞培養の細胞に感染する病原性の表現型を観察することによって、いくつかのウイルスを検出できます。感度が高い環境でこれらのウイルスの存在を検出する RT-PCR 法が使えます。

同じ時間では、DNA ベースのゲノムを持つ生物は、"""m"「翻訳できます」細胞内酵素または構造上の機能を実行する蛋白質に RNA やメッセンジャーにそれらを反訳した DNA ゲノムの遺伝情報を「エクスプレス」。微生物応答回して様々 な遺伝経路の内外の環境の変化に適応、RT-PCR 法はこのような潜在的な生態系の査定として遺伝子発現変化を監視する使用できます。

このビデオは、RT-PCR の原理でこの手法を実行する一般的な手順の概要を説明し、最後に、このメソッドが今日環境微生物学で適用されている方法のいくつかを調べて行きます。

このプロシージャに 2 つの主要部分があります: 生体試料からの RNA の抽出は DNA に逆のトランスクリプションが続きます。

RNA の分離は、脂質やタンパク質、機械的破壊によって続いてを分解する洗剤を追加してサンプルの細胞を溶解を含まれます。通常ウイルスから RNA を抽出タンパク質消化、分解酵素の添加が必要ですウイルスのカプシド - ウイルスの粒子を形成するタフなタンパク質のコートを分解する酵素。その一方で、細胞生物から RNA を取得、するときライセート必要があります DNA 分解酵素や化学的に類似の DNA の存在によって困惑している下流の結果を避けるために、DNAases と扱われます。

RNA は、2 つの方法のいずれかで lysates から精製することができます。酸のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出法として知られている 1 つのメソッドでライセートがフェーズを分離する遠心ですし有機水溶液の混合物を混ぜています。タンパク質は、曇りの相間に分離細胞の残骸と水相に核酸有機相に分割されます。上層の水相を収集しできます、その RNA の核酸の水に対する溶解度が減少、イソプロパノールなどのアルコールの添加により誘発されます。

列に基づく RNA 分離のライセート アルコールと混合、シリカなどの負荷電の樹脂とゲル濾過カラムを通して渡されます。樹脂にバインドする核酸の負荷電の隣酸塩バックボーンを許可するバッファー フォーム「塩橋」に正荷電イオンは、ライセート処理を用意しています。他のすべての汚染物質は、洗い流されます。核酸は、低塩バッファーか水を使用して、列から「溶出」されます。一本鎖 RNA は二本鎖 DNA よりも少ない負電荷があるのでそれが優先的に溶出特定濃度のバッファーを使用しています。

一度分離、RNA がより化学的に安定した DNA に変換されます。科学者は、HIV のようなレトロ ウイルスでエンコードされた自然酵素を活かしたています。この酵素は、逆転写酵素、または"RT"と呼ばれます。

RT は、プライマーと呼ばれるヌクレオチドの短いストレッチから相補的または"c"の DNA を合成します。この入門書は、実験の目的によっては、別のシーケンスを持つことができます。たとえば、特定のシーケンスを持っている特定の遺伝子または有機体を検出するためにプライマーを設計できます。合成、一度、この「最初の繊維は」cDNA は通常 PCR によって増幅することができます。

RT-PCR の背後にある原理を理解しているので、環境から収集された RNA サンプルでこの方法を実行するためのプロトコルを見てみましょう。

手順を開始するには、GPS 座標または視力を使用してサンプルのコレクションの場所を検索します。微生物の生息地の一般的な調査を得るためエリア内にランダム ポイントを選択します。

固体サンプルを収集するためにプッシュし、所定の深さまで地盤に手オーガーをツイストします。オーガーを解除すると、土をオーガーの中空の茎内で見つけることが。

土壌回収袋に直接この土を掻きし、袋は、場所、名前、日付、コレクションおよびその他の必要な情報の時間にラベル付け。

土を実験室に転送し、土を砂利や岩を削除する 2 mm ふるいを通過します。水分は、土壌微生物活性のレベルを形成することができますのための土のサンプルを分析します。これを行うには、このコレクションのビデオ「定量の水分コンテンツの土」を参照してください。

水サンプル コレクションの土壌採取と同様の関心のサイトを選択し、滅菌肉厚のペットボトルに水を集めます。集められる水の容積の注意してください。すぐにパラメーターの試験水のような温度、pH、塩分濃度は、サンプルで期待される微生物レベルに関する重要な情報を提供することができます。その後、クーラーと研究室に転送にボトルを配置します。

ウイルスなどの微生物を収集および環境試料から集中しています。

製造元の指示に従って、商業の RNA 抽出キットを用いたスピン列による収集したウイルスから RNA を抽出できます。換散バッファー、エタノールを添加した混合最初サンプル。コレクション チューブにスピン列の適切な数を配置し、列行列にサンプルを適用します。列に核酸の列にバインドし、液体の通過を破棄させる 1-2 分約 12,000 × g で遠心分離機します。

列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。新しい、滅菌 1.5 mL 低付着の microfuge の管に列を配置します。列および 30 の遠心分離機に RNA を低下させる酵素である RNases の無料の水を加えます s RNA を溶出します。溶出の RNA は、使用するまで-80 ° C で保存できます。

実験前に、は、特定微生物の存在のためのマーカーとして役立つことができる興味のシーケンスを検出するために適切なプライマーを設計する必要があります。

-20 ° C で保存 RT 試薬を取り出して解凍冷凍試薬氷の上 (または室温で)。ヌクレオチド、逆のトランスクリプションのバッファー、およびプライマーが含まれます。解凍後、氷上では; 試薬を維持します。逆転写酵素と RNase 阻害剤は、氷の上常に保たれる必要があります。

試薬が融解しながらボリュームと反応の成分濃度を計算します。試薬は、解凍後、軽く渦とスピン内容を確保するため各チューブも混在しています。

汚染を避けるために、各 PCR チューブに追加するマスター ミックスで構成部品をアセンブリの層流フードで働いています。汚染を防ぐために各試薬間ピペット チップを変更するエッペン チューブにマスター ミックスをアセンブルする場合を確認します。すべての試薬は、エッペン チューブに追加されている後、優しく渦とスピン ・ マスター ダウン ミックス均一混合物を確保するための管。

ラベル コントロールを含めるようにして、PCR チューブのセット。各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物など陰性対照のための水の反応固有のコンポーネントを追加します。

すべてのコンポーネントを追加すると、一度、たちにチューブを配置し、逆のトランスクリプションのプログラムを実行するを設定します。CDNA は、PCR 増幅を受けることが。この手順の詳細については、PCR のこのコレクションのビデオを参照してください。

PCR が完了したら、PCR の製品のいくつかで区切られたおよび agarose のゲルの視覚化にできます。たとえば、遺伝子特定のプライマーは、RNA ウイルスの存在を検出するここで使用されました。予想されるサイズのバンドは、RT-PCR の反作用からはなく、テストされている水のサンプルにこのウイルスの存在を示す負のコントロールから取得されます。

RT-PCR による RNA に基づく微生物の同定には、生態学的な健康、環境リスクと生物多様性保全の分析が可能。 にします。

炭化水素及び汚染土壌や水から溶剤をきれいにする微生物の使用は、ecosustainable 修復代替を表します。ネイティブの微生物遺伝子発現を理解は、これらの条件の下で汚染物質を分解する特定の微生物の経路を強調表示できます。このような環境のサンプルから mRNA を増幅する RT-PCR は頻繁に。

公衆衛生対策環境における感染症のウイルスの源の急速な監視が必要です。鳥インフルエンザなど感染性の高い、家禽、家畜そして人間にすぐに広がることができます。この特定の例では、研究者は野生の鳥によって広がる鳥インフルエンザの脅威を見た。

ポータブルの RT-PCR セットアップおよび装置を使用して、彼らは感染を早期に検出し、感染を防ぐのため、遠隔地でも、野生の鳥の範囲を上映しました。

最後に、RT-PCR は北アメリカでブドウを大きな被害を与える病気のためホスト ガラス翼狙撃兵、 Homalodisca vitripennisなど害虫をターゲットに開発されている「バイオ農薬"の特性評価に使用できます。小説一本鎖の RNA ウイルスは、この昆虫に感染するエージェントとして開発されています。Homalodisca細胞培養、ウイルス負荷の RT-PCR 確認の組み合わせを使用して、これらの著者は生物的防除として使用するためウイルスの高濃度を反映できた

ゼウスの RT-PCR 法による Analyzing RNA-Based 環境生物入門を見てきただけ。プロトコルの背後にある理論を理解する必要があります今、あなたの研究といくつかの方法、それは、フィールドで使用されて、今日に技術を適用する方法。見てくれてありがとう!

Results

RT-PCR が完了したら、PCR の製品のいくつかで区切られたおよび視覚化できる agarose のゲル (図 3)。この例では遺伝子特定のプライマーは、RNA ウイルスの存在を検出する使用されました。水試料の 2 つにこのウイルスの存在を示す負の制御からではなく、2 つのサンプルとポジティブ コントロール反応から予想されるサイズのバンドが得られます。

Figure 3
図 3。RT-PCR 産物の電気泳動。M: DNA サイズ マーカーP: 肯定的な制御;N: 陰性対照.4 つの水のサンプルから RNA を用いた反応は、レーン 1、2、3、および 5 の実行されました。

Applications and Summary

RT-PCR は RNA テンプレートから cDNA を作成するために必要です。これにより DNA の開発分析による分子アッセイする RNA に基づく微生物です。CDNA を合成すると、一度 PCR の試金は、環境試料中の RNA に基づく微生物の有無を確認できます。これによりさらに、微生物生態学、健康リスクと環境リスクを決定するダウン ストリーム分析です。

RT-PCR は、環境でどの遺伝子が表現されているかを観察する手段として mRNA を試金するためにも利用できます。これはの蛋白質と経路の微生物は、特に環境条件を生き残るために依存情報を提供します。遺伝子発現解析はその内訳に、炭化水素や塩素系溶剤など環境汚染物質、微生物の経路を識別できるし、バイオレメディエーションのこれらの経路で微生物が活きます。

リスク評価には、人間と環境の健康上のリスクを分析するために RT-PCR 法が組み込まれています。量的な PCR と RT を組み合わせると、人間と環境の露出は、定量的微生物リスク評価 (QMRA) 目的を計算できるように、サンプル内で列挙される RNA ウイルスができます。

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1. サンプル コレクション: 土壌サンプル

  1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
  2. ランダム サンプリングは、微生物の生息地の一般的な人口調査を取得するエリア内にランダム ポイントを選択します。トランセクトに沿って直線、例えば河床に隣接するポイントからサンプリング収集。グリッド サンプルは体系的に、定期的にポイントから取られる、未知または可変領域のマッピング微生物群集に便利。
  3. 3-6 インチ (7.5-15 cm) 内サンプリング深度は内ではなく、根 (植物の根とその関連付けられた微生物の影響を直接受ける土の狭い地域) が近く、最も豊富な微生物の活動へのアクセスを提供します。
  4. 土のサンプルを収集するために押して所定の深さまで地面に手オーガーを回転します。
  5. オーガーを持ち上げます。オーガーの中空の茎内土壌にあります。
  6. 土壌回収袋にオーガーの底に土をこすり。タッチや土壌を汚染するにしないようにします。
  7. 場所、名前、日付、および時間に正しく袋にラベルを付けます。
  8. 所、砂利や岩を削除する 2 mm ふるい土を渡します。
  9. 土壌水分のための土の部分を分析します。この手順の詳細については、土壌水分にゼウス科学教育ビデオを参照してください。

2. サンプル コレクション: 水サンプル

  1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
  2. ストレージ ボトルの中の水を収集します。水の量のレコードの収集;場合は、サンプル中の微生物は、検定定量的微生物濃度は収集量に基づいて決定できます。
  3. (温度、pH、導電率、塩分、窒素、燐等) の実験に必要な任意のパラメーターのための水をすぐにテスト適切な電子プローブを用いたします。
  4. 氷をクーラーに水のサンプルを含むボトルを置きます。研究室にクーラーを転送します。

3. RNA の抽出

  1. 収集し、環境試料からの微生物を集中、ゼウス科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
  2. 製造元の指示に従って商業抽出キットを使用してウイルスから RNA を抽出します。
  3. 簡単に言えば、最初エタノール添加の換散バッファーのサンプルをミックスし、スピンの列にサンプルを追加します。
  4. 約 12,000 × g、破棄の流れる通路に列を遠心します。列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。
  5. 列および 30 の遠心分離機に RNase フリー水を加える s 滅菌 1.5 mL 低接着 microfuge の管に RNA を溶出します。

4. 逆転写 - PCR

  1. -20 ° C のフリーザーから次の試薬を取得: dNTP、集中 (例えば、10 倍) を逆転写バッファー (この例では、ランダムなプライマー) のプライマー。氷の上やクリーン フード内室温でこれらを解凍し、一度融解したもの氷のそれらを保ちます。また逆転写酵素と RNase 阻害剤取得し、氷の上にそれらを保ちます。
  2. すべての試薬を組み合わせた「マスター ミックス」をすべての反応の間で一定に必要な試薬体積を計算 (サンプル反応は表 1を参照)。(知られているトラン スクリプト テンプレートを使用して) 肯定的な制御と同様に、あらゆるサンプルのため十分なマスター ミックスを準備し、否定的な反応 (例えば逆転写酵素、テンプレート等と水だけでなく) を制御します。ボリュームに余分な 10% を含めます。
  3. 1.5 mL 低接着 microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これは、チューブのプラスチック壁に試薬の分子の結合を最小限に抑えます。
  4. 試薬がフリーズ解除とき、および microfuge の管に計算されたボリュームを追加します。優しく渦、加算の前に各チューブを遠心力場します。汚染を防ぐために各試薬を追加間ピペット チップを変更することを確認します。
  5. 後すべての試薬が追加されました、渦および遠心分離機の均一混合物を確保するためのマスターの組合せ。-20 ° C で貯蔵に戻って試薬を入れる
  6. 準備、ラベルの 8 チューブ PCR ストリップ、各サンプルまたはコントロールの反作用のための 1 つの管を指定します。
  7. 各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物などの反応に固有のコンポーネントを追加します。
  8. PCR ストリップにしっかりとストリップ キャップを置きに各管 (図 2) の下部にすべての液体を収集するストリップ管アダプターと minicentrifuge の遠心分離機します。
  9. たちでしっかり場所 PCR ストリップ。チューブを保護する押し。
  10. 使用されている RT の適切なプログラムを実行するたちを設定 (サンプル プロトコルの表 2を参照)。プログラムが完了したら、チューブ PCR 増幅に受けることができますし、cDNA 等が含まれます。詳細については、PCR および量的な PCR のゼウス科学教育ビデオを参照してください。使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。

Figure 2
図 2。マスター ミックスとエキスを含む 8 チューブ ストリップを頂いた。

試薬 1 反応 (μ L) あたりのボリューム
RT バッファー x 10 2.0
25 x dNTPs 0.8
任意プライマー x 10 2.0
Multiscribe 1.0
リボヌクレアーゼ阻害剤 1.0
分子グレード H2O 3.2
総容積 10

表 1。RT マスター ミックスの成分。

ステップ 1 ステップ 2 ステップ 3 ステップ 4
25 ° C、10 分 37 ° C、120 分 85 ° C、5 分 4 ° C、∞

表 2。RT 反応たちプログラム。

逆のトランスクリプション ポリメラーゼの連鎖反応、または RT-PCR、RNA ウイルスと環境微生物の遺伝子発現の検出が有効です。

人間から、遺伝物質として DNA を使用している、細菌に細胞生物とは異なりいくつかのウイルス インフルエンザ、エボラ、HIV など多くの病原性ウイルスを含む RNA のゲノムがあります。大半が文化に基づく特性評価手法.を持たないしながら開発するため、細胞培養の細胞に感染する病原性の表現型を観察することによって、いくつかのウイルスを検出できます。感度が高い環境でこれらのウイルスの存在を検出する RT-PCR 法が使えます。

同じ時間では、DNA ベースのゲノムを持つ生物は、"""m"「翻訳できます」細胞内酵素または構造上の機能を実行する蛋白質に RNA やメッセンジャーにそれらを反訳した DNA ゲノムの遺伝情報を「エクスプレス」。微生物応答回して様々 な遺伝経路の内外の環境の変化に適応、RT-PCR 法はこのような潜在的な生態系の査定として遺伝子発現変化を監視する使用できます。

このビデオは、RT-PCR の原理でこの手法を実行する一般的な手順の概要を説明し、最後に、このメソッドが今日環境微生物学で適用されている方法のいくつかを調べて行きます。

このプロシージャに 2 つの主要部分があります: 生体試料からの RNA の抽出は DNA に逆のトランスクリプションが続きます。

RNA の分離は、脂質やタンパク質、機械的破壊によって続いてを分解する洗剤を追加してサンプルの細胞を溶解を含まれます。通常ウイルスから RNA を抽出タンパク質消化、分解酵素の添加が必要ですウイルスのカプシド - ウイルスの粒子を形成するタフなタンパク質のコートを分解する酵素。その一方で、細胞生物から RNA を取得、するときライセート必要があります DNA 分解酵素や化学的に類似の DNA の存在によって困惑している下流の結果を避けるために、DNAases と扱われます。

RNA は、2 つの方法のいずれかで lysates から精製することができます。酸のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出法として知られている 1 つのメソッドでライセートがフェーズを分離する遠心ですし有機水溶液の混合物を混ぜています。タンパク質は、曇りの相間に分離細胞の残骸と水相に核酸有機相に分割されます。上層の水相を収集しできます、その RNA の核酸の水に対する溶解度が減少、イソプロパノールなどのアルコールの添加により誘発されます。

列に基づく RNA 分離のライセート アルコールと混合、シリカなどの負荷電の樹脂とゲル濾過カラムを通して渡されます。樹脂にバインドする核酸の負荷電の隣酸塩バックボーンを許可するバッファー フォーム「塩橋」に正荷電イオンは、ライセート処理を用意しています。他のすべての汚染物質は、洗い流されます。核酸は、低塩バッファーか水を使用して、列から「溶出」されます。一本鎖 RNA は二本鎖 DNA よりも少ない負電荷があるのでそれが優先的に溶出特定濃度のバッファーを使用しています。

一度分離、RNA がより化学的に安定した DNA に変換されます。科学者は、HIV のようなレトロ ウイルスでエンコードされた自然酵素を活かしたています。この酵素は、逆転写酵素、または"RT"と呼ばれます。

RT は、プライマーと呼ばれるヌクレオチドの短いストレッチから相補的または"c"の DNA を合成します。この入門書は、実験の目的によっては、別のシーケンスを持つことができます。たとえば、特定のシーケンスを持っている特定の遺伝子または有機体を検出するためにプライマーを設計できます。合成、一度、この「最初の繊維は」cDNA は通常 PCR によって増幅することができます。

RT-PCR の背後にある原理を理解しているので、環境から収集された RNA サンプルでこの方法を実行するためのプロトコルを見てみましょう。

手順を開始するには、GPS 座標または視力を使用してサンプルのコレクションの場所を検索します。微生物の生息地の一般的な調査を得るためエリア内にランダム ポイントを選択します。

固体サンプルを収集するためにプッシュし、所定の深さまで地盤に手オーガーをツイストします。オーガーを解除すると、土をオーガーの中空の茎内で見つけることが。

土壌回収袋に直接この土を掻きし、袋は、場所、名前、日付、コレクションおよびその他の必要な情報の時間にラベル付け。

土を実験室に転送し、土を砂利や岩を削除する 2 mm ふるいを通過します。水分は、土壌微生物活性のレベルを形成することができますのための土のサンプルを分析します。これを行うには、このコレクションのビデオ「定量の水分コンテンツの土」を参照してください。

水サンプル コレクションの土壌採取と同様の関心のサイトを選択し、滅菌肉厚のペットボトルに水を集めます。集められる水の容積の注意してください。すぐにパラメーターの試験水のような温度、pH、塩分濃度は、サンプルで期待される微生物レベルに関する重要な情報を提供することができます。その後、クーラーと研究室に転送にボトルを配置します。

ウイルスなどの微生物を収集および環境試料から集中しています。

製造元の指示に従って、商業の RNA 抽出キットを用いたスピン列による収集したウイルスから RNA を抽出できます。換散バッファー、エタノールを添加した混合最初サンプル。コレクション チューブにスピン列の適切な数を配置し、列行列にサンプルを適用します。列に核酸の列にバインドし、液体の通過を破棄させる 1-2 分約 12,000 × g で遠心分離機します。

列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。新しい、滅菌 1.5 mL 低付着の microfuge の管に列を配置します。列および 30 の遠心分離機に RNA を低下させる酵素である RNases の無料の水を加えます s RNA を溶出します。溶出の RNA は、使用するまで-80 ° C で保存できます。

実験前に、は、特定微生物の存在のためのマーカーとして役立つことができる興味のシーケンスを検出するために適切なプライマーを設計する必要があります。

-20 ° C で保存 RT 試薬を取り出して解凍冷凍試薬氷の上 (または室温で)。ヌクレオチド、逆のトランスクリプションのバッファー、およびプライマーが含まれます。解凍後、氷上では; 試薬を維持します。逆転写酵素と RNase 阻害剤は、氷の上常に保たれる必要があります。

試薬が融解しながらボリュームと反応の成分濃度を計算します。試薬は、解凍後、軽く渦とスピン内容を確保するため各チューブも混在しています。

汚染を避けるために、各 PCR チューブに追加するマスター ミックスで構成部品をアセンブリの層流フードで働いています。汚染を防ぐために各試薬間ピペット チップを変更するエッペン チューブにマスター ミックスをアセンブルする場合を確認します。すべての試薬は、エッペン チューブに追加されている後、優しく渦とスピン ・ マスター ダウン ミックス均一混合物を確保するための管。

ラベル コントロールを含めるようにして、PCR チューブのセット。各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物など陰性対照のための水の反応固有のコンポーネントを追加します。

すべてのコンポーネントを追加すると、一度、たちにチューブを配置し、逆のトランスクリプションのプログラムを実行するを設定します。CDNA は、PCR 増幅を受けることが。この手順の詳細については、PCR のこのコレクションのビデオを参照してください。

PCR が完了したら、PCR の製品のいくつかで区切られたおよび agarose のゲルの視覚化にできます。たとえば、遺伝子特定のプライマーは、RNA ウイルスの存在を検出するここで使用されました。予想されるサイズのバンドは、RT-PCR の反作用からはなく、テストされている水のサンプルにこのウイルスの存在を示す負のコントロールから取得されます。

RT-PCR による RNA に基づく微生物の同定には、生態学的な健康、環境リスクと生物多様性保全の分析が可能。 にします。

炭化水素及び汚染土壌や水から溶剤をきれいにする微生物の使用は、ecosustainable 修復代替を表します。ネイティブの微生物遺伝子発現を理解は、これらの条件の下で汚染物質を分解する特定の微生物の経路を強調表示できます。このような環境のサンプルから mRNA を増幅する RT-PCR は頻繁に。

公衆衛生対策環境における感染症のウイルスの源の急速な監視が必要です。鳥インフルエンザなど感染性の高い、家禽、家畜そして人間にすぐに広がることができます。この特定の例では、研究者は野生の鳥によって広がる鳥インフルエンザの脅威を見た。

ポータブルの RT-PCR セットアップおよび装置を使用して、彼らは感染を早期に検出し、感染を防ぐのため、遠隔地でも、野生の鳥の範囲を上映しました。

最後に、RT-PCR は北アメリカでブドウを大きな被害を与える病気のためホスト ガラス翼狙撃兵、 Homalodisca vitripennisなど害虫をターゲットに開発されている「バイオ農薬"の特性評価に使用できます。小説一本鎖の RNA ウイルスは、この昆虫に感染するエージェントとして開発されています。Homalodisca細胞培養、ウイルス負荷の RT-PCR 確認の組み合わせを使用して、これらの著者は生物的防除として使用するためウイルスの高濃度を反映できた

ゼウスの RT-PCR 法による Analyzing RNA-Based 環境生物入門を見てきただけ。プロトコルの背後にある理論を理解する必要があります今、あなたの研究といくつかの方法、それは、フィールドで使用されて、今日に技術を適用する方法。見てくれてありがとう!

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