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Dénombrement des algues via une méthodologie de culture
 
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Dénombrement des algues via une méthodologie de culture

Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz

Les algues sont un groupe très hétérogène de micro-organismes qui ont un trait commun, à savoir la possession des pigments photosynthétiques. Dans l’environnement, les algues peuvent causer des problèmes pour les propriétaires de piscine de plus en plus dans l’eau. Algues peuvent également causer des problèmes dans les eaux de surface, tels que les lacs et les réservoirs, en raison de la prolifération d’algues qui libèrent les toxines. Plus récemment, algues sont évalués comme nouvelles sources d’énergie par l’intermédiaire de biocarburants algues. Algues bleu - vert sont en fait des bactéries qualifiées de cyanobactéries. Les cyanobactéries non seulement effectuer la photosynthèse, mais ont également la capacité de fixer l’azote gazeux de l’atmosphère. Autres algues sont eucaryotes, allant des organismes unicellulaires à des organismes multicellulaires complexes, comme les algues. Il s’agit de l’algue verte, les euglènes, dinoflagellés, l’algue brune dorée, diatomées, des algues brunes et les algues rouges. Dans les sols, les populations d’algues sont fréquemment 106 par gramme. Ces chiffres sont plus faibles que les chiffres correspondants pour les bactéries, actinomycètes et les champignons, surtout parce que la lumière du soleil nécessaire pour la photosynthèse ne peut pas pénétrer loin sous la surface du sol.

Parce que les algues sont phototrophes, obtention d’énergie de la photosynthèse et carbone de la biomasse de dioxyde de carbone, ils peuvent être cultivés dans des milieux de croissance composée entièrement de nutriments inorganiques et sans un substrat de carbone organique. L’absence de substrat organique s’oppose à la croissance des bactéries hétérotrophes. En utilisant un milieu inorganique, algues initialement présent dans le sol ou l’eau peut être dosée par la méthode le plus probable (NPP) numéro. La méthode du NPP s’appuie sur la dilution successivement un échantillon, tels que les algues se sont dilués à l’extinction. La présence d’algues dans toute dilution est déterminée par un signe positif de la croissance dans le milieu, qui est généralement un vase verte d’algues qui résulte de la photosynthèse. Utilisation de tubes répétées à chaque dilution et une évaluation statistique du nombre de tubes positifs pour la croissance à une dilution donnée permettant à calculer le nombre d’algues présentes dans l’échantillon original. Tableaux NPP ont été mis au point et publié spécifique à une conception particulière du NPP, y compris le nombre de répétitions utilisées à chaque dilution.

Procedure

  1. Peser un échantillon de 10 g de sol qui a été recueillie humide du champ, ou a l’eau ajoutée à elle afin qu’elle reste humide pendant 2-3 jours. Notez que le sol doit être humide mais non saturé.
  2. Préparer une série de dilution de 10 fois en ajoutant le 10 g de sol dans 95 mL d’une Solution de Bristol modifié (Figure 1). Pour créer Solution de Bristol modifié, dissoudre ce qui suit dans 1 000 mL d’eau : 0,25 g NaNO3, 0,025 g de CaCl2, 0,075 g MgSO4 · 7H2O, 0,075 g K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl et 0,5 mg FeCl3.
  3. Continuer la série de dilution par l’addition de 1 mL de Suspension A dans 9 mL de Solution de Bristol et de dilution séquentielle supplémentaire.
  4. Inoculer 5 tubes répétées chaque contenant 9 mL de Solution de Bristol modifié avec 1 mL de la dilution 10-2 à 10-6 (tableau 1).
  5. Incuber les tubes plafonnés pendant 4 semaines dans un endroit exposé aux rayons du soleil.
  6. Observer les tubes pour la croissance des algues une fois tous les 7 jours. Tubes avec la croissance des algues apparaissent vertes.

Figure 1
La figure 1. Comment faire une série de dilution de 10 fois.

Tube Dilution
B 10-2
C 10-3
D 10-4
E 10-5
F 10-6

Le tableau 1. Tubes et dilutions.

Les algues sont des organismes photosynthétiques qui vivent dans des environnements variés. Sol résidence algues peut être cultivée en laboratoire et leur concentration énumérés à l’aide de calculs simples.

Les algues sont un groupe hétérogène d’organismes qui ont un trait commun, à savoir la possession des pigments photosynthétiques, la chlorophylle couramment. La grande majorité des algues est microscopique, toutefois, la définition exacte du groupe est controversée et inclut également les algues, qui sont typiquement macroscopiques.

Dans l’environnement, algues peuvent causer des problèmes dans les eaux de surface telles que les lacs ou réservoirs, formant des proliférations d’algues qui appauvrissent les nutriments de l’eau, bloquant la lumière passant au-delà de la surface de l’eau et libérer des toxines. La possibilité d’énumérer des algues dans les échantillons permet aux scientifiques d’évaluer la santé d’un écosystème et le risque de prolifération des algues.

Populations d’algues dans les sols se produisent fréquemment à environ dix mille cellules par gramme. Ces chiffres sont généralement plus faibles que les concentrations correspondantes des bactéries, des champignons ou des actinomycètes, comme les algues ont besoin du soleil pour la photosynthèse, qui ne peut pas pénétrer loin au-dessous de la surface du sol.

Cette vidéo illustre comment la culture d’algues de sol en laboratoire et comment énumérer la concentration d’algues dans l’échantillon de sol départ.

Les algues ont des effets bénéfiques sur les écosystèmes. Algues bleu - vert ou cyanobactéries, ont la capacité de fixer l’azote gazeux de l’atmosphère, ce qui les rend utiles en augmentant l’azote du sol dans des milieux semi-arides et aussi comme un outil potentiel pour la production de biocarburants.

Autres algues sont eucaryotes et vont de la simple-celled à des organismes multicellulaires complexes, comme les algues. Il s’agit d’algues vertes, euglènes, dinoflagellés et diatomées, algues brunes et algues rouges.

Les algues sont phototrophes, obtention d’énergie de la photosynthèse et carbone de la biomasse du dioxyde de carbone. Ainsi, il peuvent être cultivés dans médias entièrement composé de nutriments inorganiques, sans un substrat de carbone organique ajouté. Ce manque de substrat organique empêche la croissance des bactéries hétérotrophes, qui dépendent de carbone organique externe pour la croissance.

Aux algues de culture pour le dénombrement, sol échantillons sont dilués en série décuplée à 10-6 g de sol / mL et mis en culture dans des milieux de culture. Plusieurs répliques sont faites pour chaque dilution. Ils sont ensuite incubés dans un endroit bien éclairé pendant 4 semaines afin de permettre la croissance des algues.

La présence d’algues dans toute dilution est déterminée par un signe positif de la croissance dans le milieu, qui apparaît généralement comme un vase verte. Enfin, développés empiriquement tableaux NPP conçu pour la croissance des algues est consultés, permettant à l’utilisateur de déterminer la concentration d’algues originale basée sur la croissance en dilution réplique. La méthode du NPP s’appuie sur les dilutions d’échantillons tels que les algues sont dilués à l’extinction, ce qui signifie qu’à une certaine dilution, aucune croissance de l’algue s’ensuit.

Maintenant que nous sommes familiarisés avec les concepts de croissance et en énumérant les algues des échantillons, examinons un comment cela s’effectue en laboratoire.

Pour commencer l’expérience, premier poids à 10 grammes de terre humide qui a soit été recueillies humide sur le terrain, ou été réhydratées et est resté humide pendant 2 à 3 jours. Le sol doit mais pas saturé.

Ensuite, préparer une série de dilutions dix fois en ajoutant les 10 grammes de sol tout d’abord à 95 mL d’une solution de Bristol modifiés ou MBS. Ce qualifier de suspension A.

Après avoir agité vigoureusement, continuer la série de dilution en ajoutant 1 mL de suspension A dans 9 mL de MBS dans un tube à essai. Continuer cette série de dilution dix fois un autre 4 fois pour donner des dilutions allant jusqu'à 10-6 g / mL.

Ensuite, inoculer 5 tubes répétés, chaque contenant 9 mL de MBS avec 1 mL de chacun de la dilution 10-1 à 10-5. Cela se traduit par 5 tubes de répétitions pour chaque dilution de 10-2 à 10-6. Plafonner les tubes sans serrer.

Enfin, incuber les tubes pendant un total de 4 semaines dans un endroit exposé aux rayons du soleil. Observer les tubes pour la croissance des algues une fois tous les 7 jours. Tubes présentant la croissance des algues seront affiche en verts.

La plupart du nombre Probable, ou NPP, l’analyse est une méthode mathématique couramment utilisée pour énumérer les micro-organismes est passées de dilution d’un substrat initial concentré. En prenant en compte les facteurs de dilution des solutions et le nombre d’éprouvettes présentant des signes positifs de la croissance à chaque dilution, le nombre le plus probable d’organismes par gramme d’échantillon de sol original peut être calculé en utilisant une table de NPP et la formule simple.

Pour calculer le NPP, la dilution la plus élevée avec le plus grand nombre de tubes positifs de répliquer est attribuée le label de p1, dans ce cas, la réplique du tube C. En revanche, certains des tubes de D & E sont négatifs avec aucun signe de la croissance des algues.

Le nombre de tubes dans les deux prochains dilutions plus élevées qui montrent une croissance positive est étiqueté comme p2 et p3. Ici, p2 = D et p3 = E.

La valeur de p1 peut être trouvée en regardant vers le bas de la première colonne de la table de NPP. Le même devrait être fait avec la colonne p2 . Enfin, la valeur de p3, dans la partie supérieure, est utilisée pour se croisent les deux définis par p1 et p2, pour donner une valeur de nombre le plus probable d’organismes par mL.

Ensuite, pour calculer la concentration d’organismes par gramme dans l’échantillon de sol original, cette valeur est divisée par la concentration des sols dans la dilution à laquelle p2 a été attribuée. L’équation suivante est utilisée pour définir le nombre réel d’organismes par gramme de sol.

Énumération algue et analyse du NPP ont un large éventail d’applications, dont certaines sont abordés ici.

Cette méthode de culture d’algues énumération peut servir dans une variété de configurations. Il peut être appliqué dans des rivières ou des lacs pour déterminer les niveaux d’algues et évaluer les risques d’efflorescences algales nuisibles. Alternativement, il peut être utilisé pour évaluer la propreté et la sécurité des eaux plus directement utilisé par les humains, y compris les piscines, fontaines d’eau ou d’autres sources d’eau potable. Idéalement, dans les piscines et les échantillons d’eau potable, il n’y a aucune algues présentes.

L’analyse de NPP pour dénombrement peut également être appliquée à d’autres microorganismes non-algues. Par exemple, la qualité de l’eau peut être évaluée à l’aide de micro-organismes indicateurs tels que les coliformes fécaux ou e. coli. Ici, les échantillons peuvent être cultivées avec un milieu contenant des produits chimiques qui sont modifiés pour produire la couleur ou la fluorescence en présence des organismes indicateurs. En effectuant plusieurs petites répliques de cette expérience dans des cellules individuelles, avec des échantillons diluées à une concentration connue, le rapport des cellules positives peut être référencé dans une table de NPP pour l’organisme indicateur spécifique et la concentration initiale dans les échantillons déterminé.

Algues peuvent aussi être cultivées pour les applications commerciales. Par exemple, certains types d’engrais biologiques utilisent des algues bleu - vert, qui peuvent agir comme des symbiotes de plantes, facilitant leur luminaire et l’absorption de l’azote, qui est particulièrement utile pour aider à la croissance des cultures dans les zones avec des sols pauvres. De même, les algues peuvent être cultivés pour les biocarburants, ou comme source d’aliments riches en éléments nutritifs pour le bétail.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE culture algale et énumération. Vous devez maintenant comprendre comment diluer les échantillons de sol pour la croissance des algues, comment la culture d’algues dans le laboratoire et comment énumérer la concentration d’algues de vos échantillons de départ. Merci de regarder !

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Results

La figure 2 est un exemple des résultats représentatifs.

p 1 est choisie pour être le nombre de tubes répétées de la dilution la plus élevée (moins concentrées dans le sol) qui a le plus grand nombre de tubes positifs. Ici, la réplique du Tube B ne compte pas, parce que ceux du Tube C proviennent d’une dilution plus élevée. En revanche, le nombre de tubes de Tube D qui montrent un signe positif de croissance est inférieur à celui du Tube C. Oui, p1 = 5.

p 2 et p3 sont choisis pour représenter le nombre de tubes dans les deux prochains dilutions plus élevées qui montrent un signe positif de la croissance. Ainsi, p2 = 3 et p3 = 1.

La valeur de p1 peut être trouvée en regardant vers le bas de la première colonne du tableau 2. La même chose est fait dans la colonne de2 p. Ensuite, la valeur de p3 (en haut) croise les deux définis par les valeurs de p1 et p2. Dans cet exemple, la valeur est de 1,1 organismes par mL.

Diviser cette valeur par la concentration des sols dans la dilution auquel vous avez attribué p2. Dans cet exemple, c’est le Tube D.

Equation 1

Ainsi, dans cet exemple, il y a 1,1 x 104 cellules d’algues par g de sol. Cette valeur est assez typique du nombre d’algues rencontrées dans le sol.

Figure 2
Figure 2. Résultat hypothétique d’une expérience d’énumération algues. Tubes ombrées indiquent la présence d’algues. Tubes non ombrées représentent l’absence d’algues.

Nombre le plus probable pour les valeurs indiquées p 3
P1 P2 0 1 2 3 4 5
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
--
0,018
0,037
0,056
0,075
0,094
0,018
0,036
0,055
0,074
0,094
0,11
0,036
0,055
0,074
0,093
0,11
0,13
0,054
0,073
0,092
0,11
0,13
0,15
0,072
0.091
0,11
0,13
0,15
0,17
0,090
0,11
0,13
0,15
0,17
0,19
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
4
5
0,020
0,040
0,061
0,083
0,11
0,13
0,040
0,061
0,082
0,1
0,13
0,16
0,060
0,081
0,10
0,13
0,15
0,17
0,080
0,10
0,12
0,15
0,17
0,19
0,10
0,12
0,15
0,17
0,19
0,22
0,12
0,14
0,17
0,19
0,22
0,24
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
4
5
0,045
0,068
0,093
0,12
0,15
0,17
0,068
0,092
0,12
0,14
0,17
0.20
0.091
0,12
0,14
0,17
0.20
0,23
0,12
0,14
0,17
0.20
0,23
0,26
0,14
0,17
0,19
0,22
0.25
0,29
0,16
0,19
0,22
0.25
0,28
0,32
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
0,078
0,11
0,14
0,17
0,21
0.25
0,11
0,14
0,17
0,21
0,24
0,29
0,13
0,17
0.20
0,24
0,28
0,32
0,16
0.20
0,24
0,28
0,32
0,37
0.20
0,23
0,27
0,31
0,36
0,41
0,23
0,27
0,31
0,35
0.40
0,45
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
0,13
0,17
0,22

0,34
0,41
0,17
0,21
0,26
0,33
0.40
0,48
0,21
0,26
0,32
0,39
0,47
0,56
0.25
0,31
0,38
0,45
0,54
0,64
0.30
0,36
0,44
0,52
0,62
0,72
0,36
0,42
0,5
0,59
0,69
0,81
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
0,23
0,33
0,49
0,79
1.3
2.4
0,31
0,46
0,7
1.1
1.7
3.5
0,43
0,64
0,95
1.4
2.2
5.4
0,58
0,84
1.2
1.8
2.8
9.2
0,76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0,95
1.3
1.8
2.5
4.3
--

Le tableau 2. Nombres les plus probables pour une utilisation avec le protocole expérimental dans cet exercice.

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Applications and Summary

La méthode NPP est utile, car elle permet d’estimer une population fonctionnelle basée sur une attribution liées au processus. Dans l’exemple, le processus fonctionnel a été entreprise par les algues, ce qui a permis à la croissance en l’absence du carbone organique de la photosynthèse. Cela a permis à des populations d’algues totales dans le sol soit énumérée.

NPP est également utilisé pour estimer le nombre d’un type particulier d’agents microbiens pathogènes dans l’eau, telles que les salmonelles, utilisant la résistance de Salmonella au vert de malachite.

Une autre application est l’estimation des champignons mycorhiziens en inoculant des dilutions de sol sur une plante hôte et à la recherche de la colonisation des racines par les champignons.

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