校准曲线

Analytical Chemistry

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Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

校准曲线用于了解仪器响应分析物和预测未知样品的浓度。一般来说,一套标准样品在不同浓度范围不包括未知的兴趣和记录在每个浓度的仪器响应。要更准确,理解错误,可以重复在每个浓度的响应,因此获得一条误差线。数据然后符合一个函数,可以预测未知的浓度。通常的反应是线性,但是,曲线可与其他函数,只要功能而闻名。校准曲线可以用于计算检测限和定量限。

在校准曲线的解决方案时,可以分别进行每个解决方案。然而,这可以采取大量的起始原料和耗时。许多不同溶液浓度的另一种方法是使用串行稀释。随着串行的稀释度,以逐步的方式,使较低的浓度稀释浓缩的样品。下一个示例由以前的稀释,且稀释因子经常保持恒定。优点是只有一个初始解需要。缺点是,解决方案制作中的任何错误 — — 吹打,集结,等等 — — 得到传播作出更多的解决方案。因此,必须小心进行最初的解决方案时。

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JoVE Science Education Database. 分析化学精要. 校准曲线. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

校准曲线可以用来预测未知样品的浓度。要完全准确,应该在相同的矩阵作为未知样本运行标准样品。一个样本矩阵是不感兴趣,包括溶剂和所有盐、 蛋白质、 金属离子等,可能会出现在样品分析物样品的组成部分。在实践中,在相同的矩阵作为未知运行校准样品是有时困难,未知的样品可从复杂的生物或环境样品。因此,在密切接近实际样品,如人工脑脊髓液或人工尿液,但可能不是精确的样本矩阵中进行许多校准曲线。校准曲线的浓度范围应支架,在预期的未知样品。理想的情况下测量几个浓度的上方和下方预期的浓度样品。

许多校准曲线是线性的可以符合基本方程 y = mx + b,其中 m 是斜率,b 是 y 轴截距。然而,并不是所有曲线都是线性,有时为了得到一条线,一个或两个套的轴将以对数刻度。通常使用计算机程序执行线性回归和最常用的方法是使用最小二乘拟合。多元线性回归分析,给出了 R2值,称为系数的测定。为简单的单一回归,R2是相关系数 (r) 的平方,并提供有关如何远的 y 值是从预测行信息。完美的线条会有 R2值为 1,而大多数 R2值校准曲线是大于 0.95。当校准曲线是线性的时边坡是敏感性措施: 多少信号改变的浓度变化。大坡陡线指示更多敏感的测量。校准曲线还可以帮助定义的线性范围,各种浓度的仪器给出一个线性的响应。超出此范围,响应将逐渐减少,因为仪器上的考虑,和从校准方程不能使用。这就是所谓的线性度的限制。

检测限是可以从噪声统计确定的最低金额。通常这被定义为是 3 倍的噪声信号。检测限,可计算出校准曲线的斜率,和一般被定义为 LOD=3*S.D./m,最高法令在哪里对噪声的标准偏差。噪声被衡量考虑的多次测量结果的标准偏差。或者,在一个跟踪,可以作为基准的标准偏差估计噪声。定量限是金额,可以区分样品和通常被定义为噪声的 10 倍。

Procedure

1.使标准: 系列稀释

  1. 让股票浓缩液的标准。通常情况下,该化合物是准确称出并定量地转移到容量瓶内。添加一些溶剂、 混合使样品溶解,然后填充到行用适当的溶剂。
  2. 执行系列稀释。采取另一容量瓶和移液器的标准所需的稀释量然后填充到行用溶剂和混合。十倍稀释通常做,因此为 10 毫升的容量瓶,加 1 毫升的以前的稀释。
  3. 继续根据需要为更多的稀释,用移液器从以前液稀释,使下一个样品。好的校准曲线,需要至少 5 浓度。

2.运行样品校准曲线和未知

  1. 紫外-可见分光光度法测定,以确定所需的校准曲线的仪器响应运行这些示例。
  2. 采取了阅读与第一个示例。它是一个好的主意,要运行这些示例以随机的顺序 (不最高到最低或最低到最高),以防有任何系统性的错误。为了得到噪声估计,重复对任何给定的样本阅读 3 — — 5 倍。
  3. 运行附加的标准样品,重复测量得到的噪声估计每个样品。记录的数据,后来使情节。
  4. 运行未知的样品。用作对运行标准尽可能类似的条件。因此,样本矩阵或缓冲区应该是相同的 ph 值应该是一样的和浓度应在标准范围内运行。

3.制作校准曲线

  1. 电子表格中记录数据,并使用计算机程序来绘制数据 vs 浓度。如果每个点至少一式三份的测量,误差线可以绘制那些测量值的每个点的误差估计的标准偏差。对于一些曲线,数据可能需要绘制轴为日志以获取一条线。方程的校准曲线是众所周知的时间,所以对数图使用时有方程中的日志。
  2. 检查校准曲线。它看线性?有没有看起来的非线性部分 (达到的仪器响应限制)?若要检查,适合对线性回归使用软件的所有数据。如果系数的测定 (R2) 不是高的删除一些不似乎拟合线和执行线性回归再次指向的开始或结束的曲线。它是不能接受删除点在中间,只是因为他们有一条较大的误差。从这一分析,决定曲线的哪一部分是线性的。
  3. 线性输出应该是方程格式 y = mx + b,其中 m 是斜率,b 是 y 轴截距。边坡的单位是 y 轴单位/浓度,在这个示例 (图 1) 吸光度/μ M。Y 轴截距的单位是 y 轴单位。测定 (R2) 系数。越高 R2适合;一个完美的结合给 1 R2 。该程序可能也能够给上斜率和截距的错误估计。

4.结果: 校准曲线的吸光度的蓝色染料 #1

  1. #1 蓝染料的吸光度的校准曲线 (在 631 nm) 如下所示 (图 1)。响应是线性从 0 到 10 微米以上,浓度信号渐趋平稳因为响应是从紫外-可见分光光度计的线性范围。
  2. 计算 LOD。从校准曲线的斜率,LOD 是 / m。 3*S.D。 (噪音)为此校准曲线,噪声得到考虑的重复测量的标准偏差,0.021。LOD 将 3*0.021/.109=0.58 µ M。
  3. 计算 LOQ.LOQ 是 / m。 10*S.D。 (噪音)为此校准曲线,LOQ 是 10*0.021/.109 = 1.93 µ M。
  4. 计算未知的浓度。使用直线方程来计算未知样品的浓度。校准曲线的有效期只当未知落入标准样品的线性范围。如果读数过高,稀释可能有必要。在此示例中,未知的运动饮料是稀释的 1:1。吸光度 0.243,这对应了 2.02 µ M 浓度。因此最后染料浓度、 蓝色 #1 在运动中喝了 4.04 µ M。

Figure 1
图 1。紫外-可见吸收的蓝色染料的校准曲线。左:吸光度测定不同浓度的蓝色染料 #1。响应级别后 10 µ M,吸光度时超过 1。误差线是从同一样品的重复测量和标准偏差。权:校准曲线的线性部分符合一条线,y = 0.109 * x + 0.0286。未知的数据所示黑。请点击这里查看此图的大版本。

校准曲线用来理解分析物,仪器响应,样品中的分析物浓度的预测。

校准曲线被创建的第一次准备一套的标准解决方案用已知浓度的分析物。对于每个,测量仪器响应并将其绘制与标准溶液的浓度。这种阴谋的线性部分然后可以用于预测样品的分析物浓度的关联及其对浓度的响应。

这个视频将介绍校准曲线和它们的使用,通过展示的一套标准,其次是一份样品和未知浓度的分析制备。

一套标准的解决方案用于准备校准曲线。这些解决方案包括包括近似浓度的分析物的浓度范围。

拟定的标准解决方案常常与串行的稀释。连续稀释法进行,首先准备一个股票分析物的解决方案。股票的解决方案然后稀释一个已知的量,通常一个数量级。新的解决方案然后稀释中相同的方式,等等。这导致一套解决方案与浓度范围在几个数量级。

校准曲线是一个阴谋与浓度的仪器信号。情节的标准应该是线性的并且可以拟合方程 y = mx + b。情节的非线性部分应该被抛弃,而这些浓度范围是不受限制的线性度。

最佳拟合线方程然后可以用于确定浓度的样品,通过使用仪器信号与浓度相关。必须稀释样品在情节的线性范围外的测量,才能参加的线性范围。

仪器或可以在噪声统计确定最低测量的检测极限,可计算出校准曲线以及。空白样品测量多次。检测限一般被定义为平均的空白信号外加 3 倍的标准偏差。

最后,还可以计算量化的限制。量化的限制是可以准确定量的分析物的最低数额。这被计算为 10 以上的空白信号的标准偏差。

既然你已经学会了校准曲线的基本知识,让我们看看如何准备和使用一种在实验室里。

首先,准备好股票的标准溶液。准确地衡量标准,并将其传输到容量瓶内。添加少量的溶剂,和混合,样品溶解。然后,填充到行用溶剂。它是重要的是利用相同的溶剂作为样本。

准备标准,移液器容量瓶中的所需的金额。然后用溶剂,填充到行烧瓶和混合。

继续使标准由吹打从原液和稀释。好的校准曲线,需要至少 5 浓度。

现在,与分析仪器运行示例,在这种情况下紫外-可见分光光度计,以便确定仪器的响应所需的校准曲线。

采取第一次的测量标准。运行标准按随机顺序,以防有任何系统性的错误。衡量每个标准 3 — — 5 x,获得的噪声估计。

衡量标准,为每个重复测量的休息。记录所有数据。

最后,运行该示例。使用相同的样本矩阵和测量条件,如用于标准。请确保该示例是在标准的范围和仪器的限制之内。

要构建校准曲线,请使用计算机程序来绘制数据作为信号与浓度。使用对每个数据点的重复测量的标准偏差,使误差线。

删除部分的曲线是非线性的然后进行线性回归,并确定的最佳拟合的线。输出应该是方程形式 y = m x + b。R2-价值近 1 表示一个不错的选择。

这是蓝色染料 #1,在 631 测量的校准曲线毫微米。响应是线性 0 至 15 毫米。

计算使用的最佳拟合线方程的样品浓度。吸光度样品是 0.141,和对应于浓度 6.02 毫米。

现在,您已经看到如何校准曲线可以用紫外-可见分光光度计,让我们看看其他一些有用的应用程序。

校准曲线通常用于电化学应用程序,如电极信号必须校准溶液中离子的浓度。在此示例中,数据收集氟离子选择性电极。

集中式数据必须在日志规模获得线上绘制。此校准曲线可以用于测量解决方案,如牙膏或饮用水中氟化物的浓度。

高性能液相色谱法或高效液相色谱法,是分离和分析技术在分析化学中大量使用。高效液相色谱法分离组件的一种混合物,基于分子旅行色谱柱的长度所需的时间。这次异分子的化学属性范围。

分子的洗脱测量用探测器,导致在色谱图。峰面积可以像使用一系列的标准解决方案,简单的校准曲线,在此示例中的畅销汽水成分的浓度相关。

在某些情况下,在那里解矩阵干扰测量,古典的校准曲线可以是溶质的不准确的。在这些情况下,制备了改性的校准曲线。为此,一系列标准溶液卷被添加的样本。创建到浓度情节信号,x 截距等于初始浓度的样品溶液。在这种技术上的更多细节,请看朱庇特科学教育视频,"标准加入法"。

你刚看了朱庇特的简介校准曲线。现在,您应该了解使用校准曲线的位置,如何创建它,以及如何使用它来计算样品的浓度。

一如既往,感谢您收看 !

Applications and Summary

校准曲线用于分析化学、 生物化学和药物化学的许多领域。它是共同用光谱、 色谱法、 电化学测量。校准曲线可以用于了解土壤样品中环境污染物的浓度。它可以用确定的一种神经递质在脑液样品、 维生素药物制剂中或在食物中的咖啡因浓度。因此,校准曲线是在环境、 生物、 制药和食品科学应用程序中非常有用的。制作校准曲线的最重要组成部分是在接近样品混合物的矩阵中的准确标准样品制作。

电化学校准曲线示例 (图 2) 所示。数据收集与氟离子选择性电极。电化学数据按照能斯特方程 E = E0 + 2.03*R*T/(nF) * 登录 C.因此,必须在日志规模来获取线绘制浓度数据 (x 轴)。此校准曲线可以用于测量牙膏或饮用水中氟化物的浓度。

Figure 2
图 2。离子选择性电极的校准曲线。(在 mV) 氟离子选择性电极对不同浓度的氟化物的反应,绘制出。电极反应的预期的方程是 y (在 mV) =-59.2 * 日志 x + b 在 25 ° c。实际的方程是 y =-57.4 * x +56.38 日志。R2值为 0.998。请点击这里查看此图的大版本。

1.使标准: 系列稀释

  1. 让股票浓缩液的标准。通常情况下,该化合物是准确称出并定量地转移到容量瓶内。添加一些溶剂、 混合使样品溶解,然后填充到行用适当的溶剂。
  2. 执行系列稀释。采取另一容量瓶和移液器的标准所需的稀释量然后填充到行用溶剂和混合。十倍稀释通常做,因此为 10 毫升的容量瓶,加 1 毫升的以前的稀释。
  3. 继续根据需要为更多的稀释,用移液器从以前液稀释,使下一个样品。好的校准曲线,需要至少 5 浓度。

2.运行样品校准曲线和未知

  1. 紫外-可见分光光度法测定,以确定所需的校准曲线的仪器响应运行这些示例。
  2. 采取了阅读与第一个示例。它是一个好的主意,要运行这些示例以随机的顺序 (不最高到最低或最低到最高),以防有任何系统性的错误。为了得到噪声估计,重复对任何给定的样本阅读 3 — — 5 倍。
  3. 运行附加的标准样品,重复测量得到的噪声估计每个样品。记录的数据,后来使情节。
  4. 运行未知的样品。用作对运行标准尽可能类似的条件。因此,样本矩阵或缓冲区应该是相同的 ph 值应该是一样的和浓度应在标准范围内运行。

3.制作校准曲线

  1. 电子表格中记录数据,并使用计算机程序来绘制数据 vs 浓度。如果每个点至少一式三份的测量,误差线可以绘制那些测量值的每个点的误差估计的标准偏差。对于一些曲线,数据可能需要绘制轴为日志以获取一条线。方程的校准曲线是众所周知的时间,所以对数图使用时有方程中的日志。
  2. 检查校准曲线。它看线性?有没有看起来的非线性部分 (达到的仪器响应限制)?若要检查,适合对线性回归使用软件的所有数据。如果系数的测定 (R2) 不是高的删除一些不似乎拟合线和执行线性回归再次指向的开始或结束的曲线。它是不能接受删除点在中间,只是因为他们有一条较大的误差。从这一分析,决定曲线的哪一部分是线性的。
  3. 线性输出应该是方程格式 y = mx + b,其中 m 是斜率,b 是 y 轴截距。边坡的单位是 y 轴单位/浓度,在这个示例 (图 1) 吸光度/μ M。Y 轴截距的单位是 y 轴单位。测定 (R2) 系数。越高 R2适合;一个完美的结合给 1 R2 。该程序可能也能够给上斜率和截距的错误估计。

4.结果: 校准曲线的吸光度的蓝色染料 #1

  1. #1 蓝染料的吸光度的校准曲线 (在 631 nm) 如下所示 (图 1)。响应是线性从 0 到 10 微米以上,浓度信号渐趋平稳因为响应是从紫外-可见分光光度计的线性范围。
  2. 计算 LOD。从校准曲线的斜率,LOD 是 / m。 3*S.D。 (噪音)为此校准曲线,噪声得到考虑的重复测量的标准偏差,0.021。LOD 将 3*0.021/.109=0.58 µ M。
  3. 计算 LOQ.LOQ 是 / m。 10*S.D。 (噪音)为此校准曲线,LOQ 是 10*0.021/.109 = 1.93 µ M。
  4. 计算未知的浓度。使用直线方程来计算未知样品的浓度。校准曲线的有效期只当未知落入标准样品的线性范围。如果读数过高,稀释可能有必要。在此示例中,未知的运动饮料是稀释的 1:1。吸光度 0.243,这对应了 2.02 µ M 浓度。因此最后染料浓度、 蓝色 #1 在运动中喝了 4.04 µ M。

Figure 1
图 1。紫外-可见吸收的蓝色染料的校准曲线。左:吸光度测定不同浓度的蓝色染料 #1。响应级别后 10 µ M,吸光度时超过 1。误差线是从同一样品的重复测量和标准偏差。权:校准曲线的线性部分符合一条线,y = 0.109 * x + 0.0286。未知的数据所示黑。请点击这里查看此图的大版本。

校准曲线用来理解分析物,仪器响应,样品中的分析物浓度的预测。

校准曲线被创建的第一次准备一套的标准解决方案用已知浓度的分析物。对于每个,测量仪器响应并将其绘制与标准溶液的浓度。这种阴谋的线性部分然后可以用于预测样品的分析物浓度的关联及其对浓度的响应。

这个视频将介绍校准曲线和它们的使用,通过展示的一套标准,其次是一份样品和未知浓度的分析制备。

一套标准的解决方案用于准备校准曲线。这些解决方案包括包括近似浓度的分析物的浓度范围。

拟定的标准解决方案常常与串行的稀释。连续稀释法进行,首先准备一个股票分析物的解决方案。股票的解决方案然后稀释一个已知的量,通常一个数量级。新的解决方案然后稀释中相同的方式,等等。这导致一套解决方案与浓度范围在几个数量级。

校准曲线是一个阴谋与浓度的仪器信号。情节的标准应该是线性的并且可以拟合方程 y = mx + b。情节的非线性部分应该被抛弃,而这些浓度范围是不受限制的线性度。

最佳拟合线方程然后可以用于确定浓度的样品,通过使用仪器信号与浓度相关。必须稀释样品在情节的线性范围外的测量,才能参加的线性范围。

仪器或可以在噪声统计确定最低测量的检测极限,可计算出校准曲线以及。空白样品测量多次。检测限一般被定义为平均的空白信号外加 3 倍的标准偏差。

最后,还可以计算量化的限制。量化的限制是可以准确定量的分析物的最低数额。这被计算为 10 以上的空白信号的标准偏差。

既然你已经学会了校准曲线的基本知识,让我们看看如何准备和使用一种在实验室里。

首先,准备好股票的标准溶液。准确地衡量标准,并将其传输到容量瓶内。添加少量的溶剂,和混合,样品溶解。然后,填充到行用溶剂。它是重要的是利用相同的溶剂作为样本。

准备标准,移液器容量瓶中的所需的金额。然后用溶剂,填充到行烧瓶和混合。

继续使标准由吹打从原液和稀释。好的校准曲线,需要至少 5 浓度。

现在,与分析仪器运行示例,在这种情况下紫外-可见分光光度计,以便确定仪器的响应所需的校准曲线。

采取第一次的测量标准。运行标准按随机顺序,以防有任何系统性的错误。衡量每个标准 3 — — 5 x,获得的噪声估计。

衡量标准,为每个重复测量的休息。记录所有数据。

最后,运行该示例。使用相同的样本矩阵和测量条件,如用于标准。请确保该示例是在标准的范围和仪器的限制之内。

要构建校准曲线,请使用计算机程序来绘制数据作为信号与浓度。使用对每个数据点的重复测量的标准偏差,使误差线。

删除部分的曲线是非线性的然后进行线性回归,并确定的最佳拟合的线。输出应该是方程形式 y = m x + b。R2-价值近 1 表示一个不错的选择。

这是蓝色染料 #1,在 631 测量的校准曲线毫微米。响应是线性 0 至 15 毫米。

计算使用的最佳拟合线方程的样品浓度。吸光度样品是 0.141,和对应于浓度 6.02 毫米。

现在,您已经看到如何校准曲线可以用紫外-可见分光光度计,让我们看看其他一些有用的应用程序。

校准曲线通常用于电化学应用程序,如电极信号必须校准溶液中离子的浓度。在此示例中,数据收集氟离子选择性电极。

集中式数据必须在日志规模获得线上绘制。此校准曲线可以用于测量解决方案,如牙膏或饮用水中氟化物的浓度。

高性能液相色谱法或高效液相色谱法,是分离和分析技术在分析化学中大量使用。高效液相色谱法分离组件的一种混合物,基于分子旅行色谱柱的长度所需的时间。这次异分子的化学属性范围。

分子的洗脱测量用探测器,导致在色谱图。峰面积可以像使用一系列的标准解决方案,简单的校准曲线,在此示例中的畅销汽水成分的浓度相关。

在某些情况下,在那里解矩阵干扰测量,古典的校准曲线可以是溶质的不准确的。在这些情况下,制备了改性的校准曲线。为此,一系列标准溶液卷被添加的样本。创建到浓度情节信号,x 截距等于初始浓度的样品溶液。在这种技术上的更多细节,请看朱庇特科学教育视频,"标准加入法"。

你刚看了朱庇特的简介校准曲线。现在,您应该了解使用校准曲线的位置,如何创建它,以及如何使用它来计算样品的浓度。

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