環境試料中のバクテリオファージの検出

Environmental Microbiology

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Overview

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: アレックス Wassimi

ウイルスは、真核生物と原核生物に感染する生物学的実体のユニークなグループです。代謝能力を持たず、宿主細胞の内部自己組み立てるウイルスの部品を生産する宿主の代謝に依存して、レプリケートするために義務づける寄生虫です。

ウイルスが極微、光学顕微鏡、電子顕微鏡のより高い解像度でのみ表示で閲覧するのには小さすぎます。ウイルスの粒子は DNA や RNA、蛋白質の亜単位または capsomers から成るキャプシドと呼ばれるタンパク質のコートに囲まれた核酸のゲノムから成っています。いくつかのより複雑なウイルスのキャプシドはさらに脂質エンベロープに囲まれた、スパイクのような表面の付属肢や尾があります。

人間や動物の腸管に感染するウイルスは、腸管系ウイルスと呼ばれます。彼らは、糞便中に排泄され、排水から分離することができます。細菌に感染するウイルス、バクテリオファージ、として知られている、大腸菌に感染するものは coliphages (図 1) をいいます。大腸菌の細菌のファージは、大腸菌が見つかったどこでも発見されています。

Figure 1
図 1。ファージ T2。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 環境微生物学の必需品. 環境試料中のバクテリオファージの検出. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

バクテリオファージは、生物学的システムの重要なコンポーネントであるために、環境科学で研究されています。地球上最も豊富な生物学的存在、物質循環、食物網のプロセス制御細菌集団を助けるだけで遺伝子の水平伝達を介して原核生物多様性を高めるためにであります。ファージがまた fecally-送信される試金するが病気の原因となる腸管系ウイルスの信頼できる代理指標であるという証拠もあります。バクテリオファージを列挙する比較的迅速かつ安価な方法の有効性は環境試料中の糞便汚染の評価のための魅力的なツールをさせます。

水の Coliphages は、成長のログの段階でソフトにサンプルまたはエシェリヒア属大腸菌の文化と一緒にオーバーレイを寒天培地の添加によって試金されます。ファージは細菌の細胞に接続し、細菌を溶解させます。細菌は、合流の芝生のエリア、バクテリオファージの成長し、細菌の分離を除いて成長を生成します。これらの結果の明確な領域は、プラークと呼ばれます。軟寒天培地のオーバーレイは、細菌の溶解、時に彼らは、隣接する細菌細胞に広がることができるように、ウイルスの物理的な拡散を制限する使用されます。

最適な歯垢の形成を取得するには、ホスト細菌が成長のログの段階であることが重要です。これにより、すべてのバクテリオファージ細菌を生活し、子孫を生成を添付します。これはホストの細菌の文化がアッセイを行う毎日を準備する必要があります。通常、文化は静止した段階になりますので、アッセイの前日を培養です。試金のためのログの段階に十分なホストの細菌を取得する孵ったスープを接種する試験の日、カルチャが使用されます (これは通常、35-37 ° C で揺れ水浴で 2-3 時間を必要です)。

Procedure

  1. 下水やファージを含む水のサンプルを取得します。
  2. サンプル 1:10 と 1: 100 Tris バッファーを使用して希釈します。Tris バッファー 9 mL に文化の 1.0 mL を転送し、2 番目の十倍の希薄によってこれを行います。
  3. スチームバスやオートクレーブにそれらを置くことによって軟寒天培地 (0.7% 寒天またはトリプチ豆乳寒天培地 3 mL チューブあたり) の 3 つの管を溶かします。
  4. 45 ° c. に調整する寒天培地の温度を許可するように 15 分間 45-48 ° c の水浴の寒天を配置します。
  5. 最初のチューブにエシェリヒア属大腸菌1と原液のサンプル 1 mL のログ相スープ文化の 1 mL を追加します。
  6. 水浴と軽く 2-3 s の懸濁液を混合する手の間ロックからチューブを削除します。
  7. ペーパー タオルの管から水を拭くし、下の寒天 (通常寒天またはトリプチ豆乳寒天) を含む事前に準備されたペトリ皿に寒天を注ぐ。
  8. すぐに上の寒天を広めるためプレートを回転させます。寒天は、全体の表面を覆うことを必ずください。
  9. 軟寒天培地、細菌と各サンプル希釈 (図 2) 1 mL に 1 mL を使用しての他の 2 つの管で手順 5-8 を繰り返します。
  10. 寒天が固化した後、シャーレを反転し、48 h. ノック、シャーレのふたを水分の 37 ° C で孵化させなさい。プラーク落ちる湿気の寒天培地の表面に広がるウイルスが発生します。
  11. 、孵化後各希釈 (図 3) 上のプラークの数をカウントし、元のサンプルのバクテリオファージの集中を計算します。サイズや斑の外観の主要な相違点を記録します。

Figure 2
図 2。ファージ列挙体の上の寒天を使用して細菌の芝生の準備のための手順。

Figure 3
図 3。細菌の芝生のバクテリオファージのプラク。

1大腸菌の菌株 ATCC 15597 通常下水試料からプラクの最大の番号が生成されます。栄養やトリプチ醤油スープ 100 mL を含む 250 mL 三角フラスコで一晩と 35 ° c. に条件を振って下培養それ成長する必要があります。3 h のファージ アッセイする前に 100 mL の栄養やトリプチ醤油スープと 35-37 ° C で揺れ水お風呂の場所を含む新鮮なフラスコにこの文化の 1 つの mL を接種します。これは成長のログの段階で細菌がいる保証されます。

ウイルスは、多くの疾患、風邪やインフルエンザ、肝炎や HIV に感染性の生物学的粒子です。

ウイルスは、時々 さらに脂質の封筒で、カプシドと呼ばれるタンパク質のコート内にラップ、DNA または RNA のゲノムからなる生物学的粒子です。ウイルスは、生きた細胞に侵入する必要がありますや、自分自身のコピーを作成するために彼らの細胞機械装置をハイジャック自分で代謝性または生殖能力があります。

細菌などの原核細胞と真核細胞は、人間のようなウイルスの特定のクラスによって感染することができます。具体的には、バクテリオファージが細菌に感染するウイルスです。たとえば、coliphages、大腸菌食中毒の原因をいくつかの系統と水の供給の糞便汚染の指標である一般的な腸の細菌に感染するファージそれらです。

ファージ自体はヒトの病原性が一般的に知られていない彼らが病気の原因となるため信頼性の高い代理指標だという証拠があるエンテロ ウイルスも fecally-送信される試金するは難しい。バクテリオファージを列挙する比較的迅速かつ安価な方法の有効性は環境試料中の糞便汚染の評価のための魅力的なツールをさせます。

バクテリオファージ列挙体の背後にある原理を紹介しますプラクの試金; として知られているファージを定量化するためのプロトコルを示す最後に、いくつかの環境の科学アプリケーション検出とファージやその他ウイルスのカウントを探る。

すべてのウイルスのようなバクテリオファージを再現するためにこのケースの細菌の細胞生物に寄生する必要があります。

ファージ着陸し細菌の細胞の表面に接続してセルに彼らの遺伝物質を注入することによってそいます。一度ウイルスのゲノムの複製、細胞内のウイルスのキャプシド蛋白質成分が生成される、両方は宿主細胞の生化学的機械を使用してください。バクテリオファージの粒子は、組み立てた後から解放される細菌、多くの場合ホストを溶解し、崩壊過程で宿主細胞を殺します。

バクテリオファージ濃度を決定するため広く使用されている方法でこの溶菌活性を活用しています。この手法でサンプルからファージは細菌と軟寒天培地と混合されます。この混合物は、オーバーレイ、基板や最上位のレイヤーのフォームと標準寒天培地をペトリ皿に注がれます。

細菌は、このような高濃度連続芝生を形成することです。細菌は、成長、ファージが感染する全ての細菌が生きていることを確保するためのログの段階では、子孫を生産するファージをことができますカルチャから取得する必要があります。

バクテリオファージの粒子は感染するし、細菌を溶かす、ファージの子孫は細菌細胞近くに広がるし、感染を続けます。軟寒天培地は、バクテリオファージの粒子の拡散を制限します。最終的には、クリア、プラークとして知られている領域が形成されます。

バクテリオファージは十分に低い濃度に希釈して、細菌の芝生の離散、個々 の斑が観察できます。これらはカウントし、プラーク形成単位、または PFUs、元のサンプルの mL あたりバクテリオファージの数を計算するために使用できます。

バクテリオファージが細菌に感染して、このアクティビティを使用して、バクテリオファージの濃度を測定する方法を理解すると、今では、プラクの試金を使用して環境水中のファージを列挙するためのプロトコルを行ってみましょう。

アッセイを実行する前に 1 日は、大腸菌の菌株トリプチ醤油スープ 250 mL 三角フラスコ、100 mL に ATCC 15597 の植民地を接種します。一晩に 35 ° C で揺れとそれを孵化させなさい。

アッセイの前に 3 h は、スープのフレッシュ 100 mL に一晩大腸菌文化の 1 mL を接種します。35 ~ 37 ° C 間の温度で揺れ水のお風呂にこの新しい文化を配置します。こう細菌成長のログの段階では、アッセイの開始時。

プラクの試金を開始するには、9 mL の Tris バッファーを用いる水試料の 10 倍と 100 倍シリアル希薄を確認します。

蒸気浴を使用して、0.7% ソフト上の寒天の 3 つの 5 mL チューブ、いずれトリプチ大豆または栄養寒天を溶かします。45 ° C に低下する寒天培地の温度の少なくとも 15 分の 48、45 ° c の水浴に溶かした後に、

軟寒天培地の最初のチューブに事前に準備されたログ相大腸菌文化の 1 mL と原液水サンプルの 1 ミリリットルを追加します。水浴と優しく岩懸濁液を混合する 2-3 秒のあなたの手の間からチューブを削除します。

トリプチ大豆または栄養寒天の事前に準備されたペトリ皿上軟寒天培地に注ぐ。すばやく回転で、板全体に行き渡り、全体の表面をカバーしているかどうかを確かめます。

1 mL の希釈サンプルのそれぞれを使用して、他の 2 管の接種とめっきを繰り返します。

上の寒天が固化した後は、料理を反転し、48 h の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。

、孵化後各プレート上の災害の数をカウントします。カウントから計算元のサンプルにバクテリオファージ濃度

たとえば、9 のプラクが十倍希釈プレートから得られた場合、9 回 10 で割ると 1 mL または元の水サンプルのファージの 90 PFUs/mL があります。

今ではバクテリオファージのプラクの試金の実行方法を見たら、プラクの試金を使用して、バクテリオファージとさまざまなソースからのウイルスの他のタイプを列挙する方法を見てみましょう。

プラークのアッセイ法は、土壌などさまざまな環境サンプルからのバクテリオファージの分離に使用できます。この例では、研究者はまず濾過により土壌からのバクテリオファージを収集しました。バクテリオファージは、一般的な土壌細菌アースロバクタープラクの試金に感染するために使用されました。ファージが個々 のプラクから選んだと新しい寒天に縞になるし、細菌を含む上の寒天をかぶせています。バクテリオファージの集中は、光線の長さに沿って減少離散斑、バクテリオファージの単一の型によって形成される可能性を得られる可能性があります。これらの個々 のプラークは、内ファージをさらに分析し、選んだこと。

プラクの試金は、バクテリオファージ、に加えて他のウイルス、インフルエンザなどの哺乳類に感染すると実行できます。これを行うには、哺乳類細胞はまずティッシュの培養皿で単分子膜としてを育てています。ウイルスを含むメディアは、ゲル状アガロースなどの固定媒体にセルをオーバーレイしている前に発生する感染症を許可するセルに追加されます。後最大 2 週間続く可能性が潜伏期間、感染細胞は固定、視覚化およびカウントするプラクを許可するステンド グラスします。

最後に、に加えて、環境から採取した試料、プラクの試金、検出、ウイルス感染した個人から組織サンプルを列挙するのに役立ちます。ここでは、研究者が得られるし、γ-ヘルペス ウイルスに感染したマウスから均質化肺組織。このウイルスを含む乳剤は、哺乳類の細胞培養に感染する使用されました。斑の数は、肺感染症組織におけるウイルス力価の見積もりを提供するためにカウントされる可能性があります。

環境試料中のバクテリオファージの検出にゼウスのビデオを見ているだけ。今、ファージの基礎生物学、環境サンプルにファージを量的にプラクの試金の実行方法およびプラクの試金を使用して、ファージと環境・臨床サンプルで他のウイルスを研究する方法を理解する必要があります。いつも見てくれてありがとう!

Results

下水試料の希釈 = 10-1

得られるプラークの数 = 9

したがって、バクテリオファージ濃度下水サンプル
= 10 × 9 ÷ 1 mL
= 90 プラーク形成単位/mL

未処理下水が通常 10 を含む3 -10 の範囲で、mL 当たり 104ファージ2 -10 mL あたり8

Applications and Summary

環境指標としての coliphages の多くの潜在的なアプリケーションがあります。下水の汚染、水や排水処理の効率と腸管系ウイルスおよび環境中の細菌の存続の指標としての使用が含まれます。検出の容易さのため魅力的なずっと存在の指標と腸内細菌と動物ウイルスの動作としてバクテリオファージの使用と低コストのバクテリオファージの試金に関連付けられています。さらに、彼らは数日あるいは数週間の腸内ウイルスと比較して 24 時間以内の環境試料中定量化することができます。

1大腸菌の菌株 ATCC 15597 通常下水試料からプラクの最大の番号が生成されます。栄養やトリプチ醤油スープ 100 mL を含む 250 mL 三角フラスコで一晩と 35 ° c. に条件を振って下培養それ成長する必要があります。3 h のファージ アッセイする前に 100 mL の栄養やトリプチ醤油スープと 35-37 ° C で揺れ水お風呂の場所を含む新鮮なフラスコにこの文化の 1 つの mL を接種します。これは成長のログの段階で細菌がいる保証されます。

  1. 下水やファージを含む水のサンプルを取得します。
  2. サンプル 1:10 と 1: 100 Tris バッファーを使用して希釈します。Tris バッファー 9 mL に文化の 1.0 mL を転送し、2 番目の十倍の希薄によってこれを行います。
  3. スチームバスやオートクレーブにそれらを置くことによって軟寒天培地 (0.7% 寒天またはトリプチ豆乳寒天培地 3 mL チューブあたり) の 3 つの管を溶かします。
  4. 45 ° c. に調整する寒天培地の温度を許可するように 15 分間 45-48 ° c の水浴の寒天を配置します。
  5. 最初のチューブにエシェリヒア属大腸菌1と原液のサンプル 1 mL のログ相スープ文化の 1 mL を追加します。
  6. 水浴と軽く 2-3 s の懸濁液を混合する手の間ロックからチューブを削除します。
  7. ペーパー タオルの管から水を拭くし、下の寒天 (通常寒天またはトリプチ豆乳寒天) を含む事前に準備されたペトリ皿に寒天を注ぐ。
  8. すぐに上の寒天を広めるためプレートを回転させます。寒天は、全体の表面を覆うことを必ずください。
  9. 軟寒天培地、細菌と各サンプル希釈 (図 2) 1 mL に 1 mL を使用しての他の 2 つの管で手順 5-8 を繰り返します。
  10. 寒天が固化した後、シャーレを反転し、48 h. ノック、シャーレのふたを水分の 37 ° C で孵化させなさい。プラーク落ちる湿気の寒天培地の表面に広がるウイルスが発生します。
  11. 、孵化後各希釈 (図 3) 上のプラークの数をカウントし、元のサンプルのバクテリオファージの集中を計算します。サイズや斑の外観の主要な相違点を記録します。

Figure 2
図 2。ファージ列挙体の上の寒天を使用して細菌の芝生の準備のための手順。

Figure 3
図 3。細菌の芝生のバクテリオファージのプラク。

1大腸菌の菌株 ATCC 15597 通常下水試料からプラクの最大の番号が生成されます。栄養やトリプチ醤油スープ 100 mL を含む 250 mL 三角フラスコで一晩と 35 ° c. に条件を振って下培養それ成長する必要があります。3 h のファージ アッセイする前に 100 mL の栄養やトリプチ醤油スープと 35-37 ° C で揺れ水お風呂の場所を含む新鮮なフラスコにこの文化の 1 つの mL を接種します。これは成長のログの段階で細菌がいる保証されます。

ウイルスは、多くの疾患、風邪やインフルエンザ、肝炎や HIV に感染性の生物学的粒子です。

ウイルスは、時々 さらに脂質の封筒で、カプシドと呼ばれるタンパク質のコート内にラップ、DNA または RNA のゲノムからなる生物学的粒子です。ウイルスは、生きた細胞に侵入する必要がありますや、自分自身のコピーを作成するために彼らの細胞機械装置をハイジャック自分で代謝性または生殖能力があります。

細菌などの原核細胞と真核細胞は、人間のようなウイルスの特定のクラスによって感染することができます。具体的には、バクテリオファージが細菌に感染するウイルスです。たとえば、coliphages、大腸菌食中毒の原因をいくつかの系統と水の供給の糞便汚染の指標である一般的な腸の細菌に感染するファージそれらです。

ファージ自体はヒトの病原性が一般的に知られていない彼らが病気の原因となるため信頼性の高い代理指標だという証拠があるエンテロ ウイルスも fecally-送信される試金するは難しい。バクテリオファージを列挙する比較的迅速かつ安価な方法の有効性は環境試料中の糞便汚染の評価のための魅力的なツールをさせます。

バクテリオファージ列挙体の背後にある原理を紹介しますプラクの試金; として知られているファージを定量化するためのプロトコルを示す最後に、いくつかの環境の科学アプリケーション検出とファージやその他ウイルスのカウントを探る。

すべてのウイルスのようなバクテリオファージを再現するためにこのケースの細菌の細胞生物に寄生する必要があります。

ファージ着陸し細菌の細胞の表面に接続してセルに彼らの遺伝物質を注入することによってそいます。一度ウイルスのゲノムの複製、細胞内のウイルスのキャプシド蛋白質成分が生成される、両方は宿主細胞の生化学的機械を使用してください。バクテリオファージの粒子は、組み立てた後から解放される細菌、多くの場合ホストを溶解し、崩壊過程で宿主細胞を殺します。

バクテリオファージ濃度を決定するため広く使用されている方法でこの溶菌活性を活用しています。この手法でサンプルからファージは細菌と軟寒天培地と混合されます。この混合物は、オーバーレイ、基板や最上位のレイヤーのフォームと標準寒天培地をペトリ皿に注がれます。

細菌は、このような高濃度連続芝生を形成することです。細菌は、成長、ファージが感染する全ての細菌が生きていることを確保するためのログの段階では、子孫を生産するファージをことができますカルチャから取得する必要があります。

バクテリオファージの粒子は感染するし、細菌を溶かす、ファージの子孫は細菌細胞近くに広がるし、感染を続けます。軟寒天培地は、バクテリオファージの粒子の拡散を制限します。最終的には、クリア、プラークとして知られている領域が形成されます。

バクテリオファージは十分に低い濃度に希釈して、細菌の芝生の離散、個々 の斑が観察できます。これらはカウントし、プラーク形成単位、または PFUs、元のサンプルの mL あたりバクテリオファージの数を計算するために使用できます。

バクテリオファージが細菌に感染して、このアクティビティを使用して、バクテリオファージの濃度を測定する方法を理解すると、今では、プラクの試金を使用して環境水中のファージを列挙するためのプロトコルを行ってみましょう。

アッセイを実行する前に 1 日は、大腸菌の菌株トリプチ醤油スープ 250 mL 三角フラスコ、100 mL に ATCC 15597 の植民地を接種します。一晩に 35 ° C で揺れとそれを孵化させなさい。

アッセイの前に 3 h は、スープのフレッシュ 100 mL に一晩大腸菌文化の 1 mL を接種します。35 ~ 37 ° C 間の温度で揺れ水のお風呂にこの新しい文化を配置します。こう細菌成長のログの段階では、アッセイの開始時。

プラクの試金を開始するには、9 mL の Tris バッファーを用いる水試料の 10 倍と 100 倍シリアル希薄を確認します。

蒸気浴を使用して、0.7% ソフト上の寒天の 3 つの 5 mL チューブ、いずれトリプチ大豆または栄養寒天を溶かします。45 ° C に低下する寒天培地の温度の少なくとも 15 分の 48、45 ° c の水浴に溶かした後に、

軟寒天培地の最初のチューブに事前に準備されたログ相大腸菌文化の 1 mL と原液水サンプルの 1 ミリリットルを追加します。水浴と優しく岩懸濁液を混合する 2-3 秒のあなたの手の間からチューブを削除します。

トリプチ大豆または栄養寒天の事前に準備されたペトリ皿上軟寒天培地に注ぐ。すばやく回転で、板全体に行き渡り、全体の表面をカバーしているかどうかを確かめます。

1 mL の希釈サンプルのそれぞれを使用して、他の 2 管の接種とめっきを繰り返します。

上の寒天が固化した後は、料理を反転し、48 h の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。

、孵化後各プレート上の災害の数をカウントします。カウントから計算元のサンプルにバクテリオファージ濃度

たとえば、9 のプラクが十倍希釈プレートから得られた場合、9 回 10 で割ると 1 mL または元の水サンプルのファージの 90 PFUs/mL があります。

今ではバクテリオファージのプラクの試金の実行方法を見たら、プラクの試金を使用して、バクテリオファージとさまざまなソースからのウイルスの他のタイプを列挙する方法を見てみましょう。

プラークのアッセイ法は、土壌などさまざまな環境サンプルからのバクテリオファージの分離に使用できます。この例では、研究者はまず濾過により土壌からのバクテリオファージを収集しました。バクテリオファージは、一般的な土壌細菌アースロバクタープラクの試金に感染するために使用されました。ファージが個々 のプラクから選んだと新しい寒天に縞になるし、細菌を含む上の寒天をかぶせています。バクテリオファージの集中は、光線の長さに沿って減少離散斑、バクテリオファージの単一の型によって形成される可能性を得られる可能性があります。これらの個々 のプラークは、内ファージをさらに分析し、選んだこと。

プラクの試金は、バクテリオファージ、に加えて他のウイルス、インフルエンザなどの哺乳類に感染すると実行できます。これを行うには、哺乳類細胞はまずティッシュの培養皿で単分子膜としてを育てています。ウイルスを含むメディアは、ゲル状アガロースなどの固定媒体にセルをオーバーレイしている前に発生する感染症を許可するセルに追加されます。後最大 2 週間続く可能性が潜伏期間、感染細胞は固定、視覚化およびカウントするプラクを許可するステンド グラスします。

最後に、に加えて、環境から採取した試料、プラクの試金、検出、ウイルス感染した個人から組織サンプルを列挙するのに役立ちます。ここでは、研究者が得られるし、γ-ヘルペス ウイルスに感染したマウスから均質化肺組織。このウイルスを含む乳剤は、哺乳類の細胞培養に感染する使用されました。斑の数は、肺感染症組織におけるウイルス力価の見積もりを提供するためにカウントされる可能性があります。

環境試料中のバクテリオファージの検出にゼウスのビデオを見ているだけ。今、ファージの基礎生物学、環境サンプルにファージを量的にプラクの試金の実行方法およびプラクの試金を使用して、ファージと環境・臨床サンプルで他のウイルスを研究する方法を理解する必要があります。いつも見てくれてありがとう!

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