毛细管电泳 (CE)

Analytical Chemistry

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Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

毛细管电泳 (CE) 是一种分离技术,分离分子大小和电荷的电场中。CE 被执行的一个小玻璃管,称为充满了电解质溶液的毛细管。分析物分隔由于电泳迁移率,随电荷、 溶剂粘度和大小的差异。传统在凝胶电泳是受因为焦耳热效应会毁了这种凝胶,分离可以应用的电压量的限制。毛细血管表面区域卷比大,因而散热更好。因此,应用毛细管电泳实验的电压都很大,经常 10,000 — — 20,000 V。

毛细管电泳是用于高性能的分色。与高效液相色谱法相比,CE 分离通常是更快、 更高效。然而,毛细管电泳效果最佳分离带电的分子,这并不是限制的高效液相色谱法。行政长官有较大的峰值容量比高性能液相色谱法 (HPLC),意思分色更高效、 更多的山峰可以检测到。该仪器可以非常简单。然而,高效液相色谱法是更多功能和很多的固定和移动阶段有针对不同种类的分子。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 分析化学精要. 毛细管电泳 (CE). JoVE, Cambridge, MA, (2019).

Principles

毛细管电泳分离分子由于它们的电泳迁移。一种分子的电泳迁移率取决于它的充电和多少它是吸引或排斥的电压,以及抵抗运动的摩擦阻力。摩擦是分子的半径成正比。因此,电泳迁移率根据大小和电荷。一个带电的分子沿着毛细管的速度是其电泳迁移率和外加的电场的产品。更高的电压,因此导致更快的速度和更快的分色。

多数的毛细管电泳仪器设置负电压检测器一端与入口的正电压。这意味着带正电的分子朝结束时,阴极迁移,而负电荷的分子迁移的其他方式。所有的分子是看到探测器然而,因为那里是称为电渗流动的散装流体流动。因此,移徙秩序是带正电、 中性,和负电的分子。

电渗流是通过施加高电压到小小的玻璃毛细管装满盐的溶液引起的。在盐溶液中带正电的离子形成双电层,负电荷的硅烷醇的玻璃墙上。当一个负电压适用于毛细管的结束时,它拉阳离子从双层,也拉扯它周围由于摩擦力的解决方案。这种类型的流形插头并导致更少带宽展宽比高效液相色谱法的抛物形流插头。

所有的中性分子流作为渗流速度相同。然而,伪固定相可以添加到运行缓冲分子可以分区的进出的形成胶束。典型的伪固定相是硫酸钠。胶束是负电荷在外面,因此他们有电泳迁移率,所以在胶束中花费的时间确定迁移时间。这种形式的毛细管电泳称为胶束电动毛细管色谱 (束)。

在 CE 检测是类似于高效液相色谱法。紫外-可见一般并不需要标签,只要这种分子有一个双键。然而,吸光度取决于路径的长度,即小 50 µ m 的毛细管。泡沫细胞或 z 细胞会增加的路径长度。激光诱导荧光是一个更敏感的检测方法。激光照射通过毛细管和荧光测量产品中的一个窗口。虽然荧光提供很高的灵敏度,它通常需要将标记因为大多不是荧光分子。电化学检测和电喷雾质谱法检测正日益普及。这些探测器之一的问题是,高电压从分离必须提请地面之前检测,如有要求的电压应用电化学和电喷雾串联质谱 CE 电压可以干扰。新方法的解耦 CE 电压,利用电极消耗电流或毛细管,小裂缝正在克服这些挑战。

Procedure

1.行政长官仪表安装程序

  1. 打开 CE 仪器和计算机。使用计算机软件,打开光源紫外分析允许它暖和起来。一些软件有指示器灯可供使用时 (灯图标变成彩色)。
  2. 使方法文件。设置运行 CE 的重要参数。在这种分析的墨盒和样品的储存温度是 35 ° c。紫外检测波长是 214 nm。
  3. 写一个时间程序。程序通常由冲洗步骤 (清洁前分析毛细管)、 注射的步骤,然后电泳步骤组成。冲洗的步骤,执行 2 冲洗 1 分钟使用 20 磅/平方英寸的压力。第一次漂洗是用 NaOH,有助于确保在毛细血管壁上的硅烷醇是并去质子。第二次冲洗是与运行缓冲区 (这里 0.025 M 硼酸缓冲) 以确保毛细管左平衡与缓冲区。
  4. 注射压力注射用于 0.5 磅/平方英寸 5 s。
  5. 电泳法的步骤,条件是分离电压: 20 千伏,时间: 5 分钟,正常的极性。每一步,也表明哪瓶是入口,哪瓶是出路。保存方法文件后输入所有的参数。

2.标准和苏打水样品的制备

  1. 使水中的阿斯巴甜,咖啡因和苯甲酸 500 ppm 股票解决方案。使 50 毫升的每一个,使用容量瓶。
  2. 在 10 毫升容量瓶中,让 150 ppm 阿斯巴甜、 150 ppm 咖啡因和苯甲酸 100 ppm 标准解决方案。
  3. 在 10 毫升的容量瓶中使 50 ppm,100 ppm,150 ppm 和 200 ppm 标准咖啡因解决方案。

3.在 CE 上运行样本

  1. 放入样品瓶架包含标准或苏打水样品瓶。请务必写下的样本是在哪个插槽中。两个插槽有硼酸运行缓冲区和 0.1 M 氢氧化钠冲洗液。
  2. 在方法文件中,输入第一个样品瓶是在哪个插槽。
  3. 获得一次的运行,并确保正确输入所有的数据信息的程序的请求。
  4. 继续获得数据,更改每个样本输入小瓶。运行组合标准、 3 种浓度的咖啡因和百事可乐、 饮食百事可乐样品。
  5. 插入该文书的目标和选择适当的文书。
  6. 分析计算机上的数据。计算峰面积和覆盖标准和实际的示例,以帮助确定峰。使咖啡因数据校准曲线。

毛细管电泳法或行政长官,是一种化学分析中用于分子大小和电荷的电场中分离技术。

毛细管电泳是在亚毫米直径管,被称为毛细管,其中包含流动的电解质溶液中进行的。样品注入毛细管和电场。基于他们的速度,由电荷、 大小和溶剂的粘度影响的差异,然后被分离分子。CE 是理想的带电分子的分离,具有更大的分辨率比高性能液相色谱法,使它更有效率和敏感。

本视频将介绍基本的毛细管电泳和证明其使用通过测定的软性饮料的成分。

在 CE,电场被应用于毛细管充满电解液。电场诱导毛细管入口,正电荷和负电荷出口处。

在毛细管内的电解质流动引起的电场。这种流动,称为电渗流动,是由带正电的盐离子-带负电荷的毛细血管壁沿离散层的运动引起的。

通过毛细管电当前运行时,沿墙阳离子走向负结束。这个离子流拉扯中通过管中心的解决方案。

然后分离分子样本基于他们在毛细管内的速度。这种速度,称为电泳迁移率,取决于分子的电荷和大小和多少是吸引还是排斥由电场。

带正电的分子通过毛细管,流动得更快,因为更吸引他们到出口处的潜力。带负电的分子流动得慢些,更吸引他们到入口的潜力。中性分子进行伴随散流。因此,分子退出毛细管的顺序是带正电,中性,然后负电荷。此外,电解质流动更快更大的分子,由于摩擦力比拉更小的分子。

分子由检测器,例如紫外-可见,当他们退出列,并在探测器信号强度随时间,称为图谱情节可视化记录。

洗脱可以产生一系列的信息;这样,如何许多不同的化合物是目前样本中的每个物质的量。

现在,您已经看到的毛细管电泳的简要说明,让我们看看它如何在实验室中进行。

首先,打开毛细管电泳仪和计算机。然后再接通紫外检测器允许它暖和起来。

设置为运行实验参数。首先,设置墨盒和样品存放温度为 35 ° C 和波长紫外探测的 214 nm。

接下来,设置两个冲洗步骤。第一次漂洗是用氢氧化钠以确保硅烷醇在毛细血管壁上的质子化。第二次冲洗使用运行缓冲区来平衡毛细管。然后,设置样品注入 0.5 磅/平方英寸 5 s。

通过选择分离电压设置的电泳步。在这种情况下,使用 20 千伏 5 分钟使用正常的极性,这意味着,电场正面入口和出口处负面。

首先,准备 50 毫升的苏打水组件阿斯巴甜,咖啡因和苯甲酸在水中从零件每万 500 股票解决方案。

从股票的解决方案,使 150 ppm 阿斯巴甜、 150 ppm 咖啡因和苯甲酸 100 ppm 的标准溶液。

然后,使 4 标准解决方案的咖啡因的 50、 100、 150、 200 ppm。这些样本将用于制造的校准曲线。有关详细信息,请参阅此集合的视频校准曲线上。

最后,备苏打水样品脱气他们与氮。苏打水样品将没有稀释法进行分析。

放入瓶持有人包含标准或苏打水样品瓶。放入样品架以及包含运行的缓冲和氢氧化钠冲洗液瓶。请确保记录的每个位置。

在 CE 仪器软件,指示哪些插槽包含两个冲洗溶液和第一个样品瓶。现在,运行第一个示例。

然后在此基础上,运行组合标准、 4 种浓度的咖啡因和常规,通过改变输入小瓶饮食苏打水样本。

当所有的解决方案已分居,分析数据。

首先,使用标准来标识苏打水样品中的峰。三峰在标准饮食苏打水样品中观察到的比较,显示咖啡因、 阿斯巴甜和苯甲酸目前在无糖汽水。在定期苏打水样本中,只有咖啡因峰是礼物,但不是阿斯巴甜和苯甲酸的山峰。

然后在此基础上,计算每个咖啡因标准溶液的峰面积,使校准曲线。咖啡因的校准曲线可以用于计算每个样本中的咖啡因浓度。

毛细管电泳用于学术和工业设置中的很多专业分色。

行政长官经常用作制药业品质控制测试的一个组成部分。药物,无论是作为小分子或生物制剂,可以通过毛细管电泳以查看是否存在任何侧产品运行。它还可以用于确定是否蛋白质的正确折叠,折叠可以影响蛋白质电荷。

行政长官也可以用于分离 DNA。使用微孔板和多个阵列的毛细血管,研究者可以提高吞吐量的一次实验,如下所示。DNA 片段分离基于大小,分辨率到 1 的碱基对。这使得测序的 DNA 片段,以及确定其他参数,如拷贝数变异,是用于诊断潜在的遗传疾病。

一种蛋白质可以改性化学附加到不同位置的各种官能团。同样多的蛋白质不同的副本可以随不同的修改,将更改的电荷和每种蛋白质的大小。通过连接到一台质谱仪 CE 运行纯化的蛋白可以单独根据蛋白质的修改都存在,并且还确定的类型和位置的修饰。

你刚看了毛细管电泳的朱庇特的简介。现在,您应该了解如何 CE 分离分子的电荷和质量,以及如何在实验室里 CE 上运行示例。

谢谢观赏 !

Results

洗脱收集饮食百事可乐和百事可乐样品分别显示在图1和图2。咖啡因、 阿斯巴甜,和苯甲酸的三峰饮食百事可乐中观察和有类似迁移时间为标准。定期的百事可乐,咖啡因峰是存在,但不是阿斯巴甜和苯甲酸的高峰。行政长官分析是快速迁移时间只有 3-4 分钟。

咖啡因的校准曲线如图 3所示。这条曲线可以用于计算每个样本中的咖啡因浓度。

Figure 1
图 1。百事轻怡 CE 分析。红色是咖啡因、 阿斯巴甜及苯甲酸标准。黑色是百事可乐样品的饮食。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 2
图 2。百事可乐 CE 分析。黑色是百事可乐样品,而红色是咖啡因、 阿斯巴甜及苯甲酸标准样品。还有没有阿斯巴甜或苯甲酸,指示苏打水不是饮食。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 3
图 3。咖啡因校正标度图与 CE。一块咖啡因标准峰值区 vs 浓度的测量与 CE。请点击这里查看此图的大版本。

Applications and Summary

毛细管电泳用于很多专业分色。例如,它用于在制药行业质量检测,以确保没有侧产品或烟幕。CE 是分离药物与基本的氨基组,因而这种药物不会坚持对毛细管、 毛细管的墙壁可以由中性与酸性 pH 特别有用。

CE 模式也被用于人类基因组测序和分离 DNA。这种模式的 CE 是毛细管凝胶电泳和对于这些分色,一种聚合物注入 CE 毛细管。聚合物给出了附加分离模式的基于大小,较小的碎片就可以更快地穿过凝胶。这就所谓的筛分,并随着的电泳的分离,它有 1 碱基对决议进行 DNA 分析。

1.行政长官仪表安装程序

  1. 打开 CE 仪器和计算机。使用计算机软件,打开光源紫外分析允许它暖和起来。一些软件有指示器灯可供使用时 (灯图标变成彩色)。
  2. 使方法文件。设置运行 CE 的重要参数。在这种分析的墨盒和样品的储存温度是 35 ° c。紫外检测波长是 214 nm。
  3. 写一个时间程序。程序通常由冲洗步骤 (清洁前分析毛细管)、 注射的步骤,然后电泳步骤组成。冲洗的步骤,执行 2 冲洗 1 分钟使用 20 磅/平方英寸的压力。第一次漂洗是用 NaOH,有助于确保在毛细血管壁上的硅烷醇是并去质子。第二次冲洗是与运行缓冲区 (这里 0.025 M 硼酸缓冲) 以确保毛细管左平衡与缓冲区。
  4. 注射压力注射用于 0.5 磅/平方英寸 5 s。
  5. 电泳法的步骤,条件是分离电压: 20 千伏,时间: 5 分钟,正常的极性。每一步,也表明哪瓶是入口,哪瓶是出路。保存方法文件后输入所有的参数。

2.标准和苏打水样品的制备

  1. 使水中的阿斯巴甜,咖啡因和苯甲酸 500 ppm 股票解决方案。使 50 毫升的每一个,使用容量瓶。
  2. 在 10 毫升容量瓶中,让 150 ppm 阿斯巴甜、 150 ppm 咖啡因和苯甲酸 100 ppm 标准解决方案。
  3. 在 10 毫升的容量瓶中使 50 ppm,100 ppm,150 ppm 和 200 ppm 标准咖啡因解决方案。

3.在 CE 上运行样本

  1. 放入样品瓶架包含标准或苏打水样品瓶。请务必写下的样本是在哪个插槽中。两个插槽有硼酸运行缓冲区和 0.1 M 氢氧化钠冲洗液。
  2. 在方法文件中,输入第一个样品瓶是在哪个插槽。
  3. 获得一次的运行,并确保正确输入所有的数据信息的程序的请求。
  4. 继续获得数据,更改每个样本输入小瓶。运行组合标准、 3 种浓度的咖啡因和百事可乐、 饮食百事可乐样品。
  5. 插入该文书的目标和选择适当的文书。
  6. 分析计算机上的数据。计算峰面积和覆盖标准和实际的示例,以帮助确定峰。使咖啡因数据校准曲线。

毛细管电泳法或行政长官,是一种化学分析中用于分子大小和电荷的电场中分离技术。

毛细管电泳是在亚毫米直径管,被称为毛细管,其中包含流动的电解质溶液中进行的。样品注入毛细管和电场。基于他们的速度,由电荷、 大小和溶剂的粘度影响的差异,然后被分离分子。CE 是理想的带电分子的分离,具有更大的分辨率比高性能液相色谱法,使它更有效率和敏感。

本视频将介绍基本的毛细管电泳和证明其使用通过测定的软性饮料的成分。

在 CE,电场被应用于毛细管充满电解液。电场诱导毛细管入口,正电荷和负电荷出口处。

在毛细管内的电解质流动引起的电场。这种流动,称为电渗流动,是由带正电的盐离子-带负电荷的毛细血管壁沿离散层的运动引起的。

通过毛细管电当前运行时,沿墙阳离子走向负结束。这个离子流拉扯中通过管中心的解决方案。

然后分离分子样本基于他们在毛细管内的速度。这种速度,称为电泳迁移率,取决于分子的电荷和大小和多少是吸引还是排斥由电场。

带正电的分子通过毛细管,流动得更快,因为更吸引他们到出口处的潜力。带负电的分子流动得慢些,更吸引他们到入口的潜力。中性分子进行伴随散流。因此,分子退出毛细管的顺序是带正电,中性,然后负电荷。此外,电解质流动更快更大的分子,由于摩擦力比拉更小的分子。

分子由检测器,例如紫外-可见,当他们退出列,并在探测器信号强度随时间,称为图谱情节可视化记录。

洗脱可以产生一系列的信息;这样,如何许多不同的化合物是目前样本中的每个物质的量。

现在,您已经看到的毛细管电泳的简要说明,让我们看看它如何在实验室中进行。

首先,打开毛细管电泳仪和计算机。然后再接通紫外检测器允许它暖和起来。

设置为运行实验参数。首先,设置墨盒和样品存放温度为 35 ° C 和波长紫外探测的 214 nm。

接下来,设置两个冲洗步骤。第一次漂洗是用氢氧化钠以确保硅烷醇在毛细血管壁上的质子化。第二次冲洗使用运行缓冲区来平衡毛细管。然后,设置样品注入 0.5 磅/平方英寸 5 s。

通过选择分离电压设置的电泳步。在这种情况下,使用 20 千伏 5 分钟使用正常的极性,这意味着,电场正面入口和出口处负面。

首先,准备 50 毫升的苏打水组件阿斯巴甜,咖啡因和苯甲酸在水中从零件每万 500 股票解决方案。

从股票的解决方案,使 150 ppm 阿斯巴甜、 150 ppm 咖啡因和苯甲酸 100 ppm 的标准溶液。

然后,使 4 标准解决方案的咖啡因的 50、 100、 150、 200 ppm。这些样本将用于制造的校准曲线。有关详细信息,请参阅此集合的视频校准曲线上。

最后,备苏打水样品脱气他们与氮。苏打水样品将没有稀释法进行分析。

放入瓶持有人包含标准或苏打水样品瓶。放入样品架以及包含运行的缓冲和氢氧化钠冲洗液瓶。请确保记录的每个位置。

在 CE 仪器软件,指示哪些插槽包含两个冲洗溶液和第一个样品瓶。现在,运行第一个示例。

然后在此基础上,运行组合标准、 4 种浓度的咖啡因和常规,通过改变输入小瓶饮食苏打水样本。

当所有的解决方案已分居,分析数据。

首先,使用标准来标识苏打水样品中的峰。三峰在标准饮食苏打水样品中观察到的比较,显示咖啡因、 阿斯巴甜和苯甲酸目前在无糖汽水。在定期苏打水样本中,只有咖啡因峰是礼物,但不是阿斯巴甜和苯甲酸的山峰。

然后在此基础上,计算每个咖啡因标准溶液的峰面积,使校准曲线。咖啡因的校准曲线可以用于计算每个样本中的咖啡因浓度。

毛细管电泳用于学术和工业设置中的很多专业分色。

行政长官经常用作制药业品质控制测试的一个组成部分。药物,无论是作为小分子或生物制剂,可以通过毛细管电泳以查看是否存在任何侧产品运行。它还可以用于确定是否蛋白质的正确折叠,折叠可以影响蛋白质电荷。

行政长官也可以用于分离 DNA。使用微孔板和多个阵列的毛细血管,研究者可以提高吞吐量的一次实验,如下所示。DNA 片段分离基于大小,分辨率到 1 的碱基对。这使得测序的 DNA 片段,以及确定其他参数,如拷贝数变异,是用于诊断潜在的遗传疾病。

一种蛋白质可以改性化学附加到不同位置的各种官能团。同样多的蛋白质不同的副本可以随不同的修改,将更改的电荷和每种蛋白质的大小。通过连接到一台质谱仪 CE 运行纯化的蛋白可以单独根据蛋白质的修改都存在,并且还确定的类型和位置的修饰。

你刚看了毛细管电泳的朱庇特的简介。现在,您应该了解如何 CE 分离分子的电荷和质量,以及如何在实验室里 CE 上运行示例。

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