离子交换色谱法

Analytical Chemistry

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Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

离子交换色谱法是色谱的分离基于电荷分析物类型。列用那充满了带电的固定相,坚实的支持,被称为一种离子交换树脂。强阳离子交换色谱法优先分离出来阳离子通过使用-带负电荷的树脂,而强阴离子交换色谱法优先选择阴离子通过使用一种带正电的树脂。这种类型是色谱的受欢迎的样品制备,例如在蛋白质或核酸样品的清理工作。

离子交换色谱法是一个两步过程。第一步,样品装上加载缓冲区中的列。绑定到列树脂带电样品的基于树脂吸引样品相反电荷的离子相互作用。因此,带电的样品的相反极性树脂到强烈绑定。其他分子,不收取或相反的电荷是不受约束和通过列洗。第二步是洗脱绑定到树脂的分析物。这被通过盐的梯度,在缓冲区中盐的用量现在慢慢地上升。馏分收集在列的结尾作为洗脱发生和纯化的样品感兴趣的可以恢复这些组分之一。另一种技术,如谱,可能需要确定哪一部分包含示例。离子交换色谱法是在蛋白质研究,隔离有特定电荷或大小,感兴趣的蛋白质,如大小可以确定在与树脂之间的交互中尤其有用。

离子交换色谱法是更一般的分离技术比亲和层析,也常用于蛋白质样品制备抗体相连列绑定一个具体分析物。必须为每种分析物,购买新的亲和柱,而同一类型的离子交换柱,经常与不同的洗脱条件,可以用来清理许多蛋白质相同罪名。离子交换色谱法也可以与其他类型的色谱分离基于其他属性一起使用。例如,尺寸排阻色谱法分离基于大小和可以在离子交换色谱法之前用来选择只给定大小的化合物。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 分析化学精要. 离子交换色谱法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

离子交换色谱法被受离子的化学相互作用,导致分析物的可逆吸附在固定相上的原则。样品和固体支持之间的粘结强度受的数量和类型的样品和树脂官能团。加载缓冲区一般有低电导率为了促进样品与树脂之间的相互作用。强阳离子交换树脂通常功能磺酸官能团虽然弱阳离子交换树脂具有羧酸。强阴离子交换树脂含有第四纪胺而弱阴离子交换树脂功能二级或三级胺。强和弱的用语指列材料并不如何好将绑定分析物的酸碱属性。弱的树脂在较小的 ph 值范围比强树脂,收取但仍然非常有效,绑定物,可能是一个不错的选择,如果他们被指控在所需的 ph 值范围。使用前,离子交换色谱柱被平衡 ph 值,使用平衡缓冲区。

用盐梯度洗脱样品感兴趣。不紧紧地绑定到树脂的样品将洗脱第一,因为盐会最容易打扰他们离子键的列。更紧密绑定会的样品后,洗脱时高盐的用量。通常情况下,使用线性渐变的盐,盐的浓度随时间线性方式的地方增加。然而,一步梯度能也使用的盐浓度随着时间的推移加紧。

离子交换实验的一个重要的考虑因素是 ph 值的缓冲区。Ph 值有需要继续维持这样的利益被分析物中扣除,并将绑定到树脂。蛋白质,收费基于蛋白质的等电点,蛋白质在哪里中立带电,与实测值作为 pI。Ph 值与蛋白 pI 给预期的蛋白质电荷有关的信息。在阳离子交换色谱法,提高 ph 值将导致分析物要少正电和不太可能与交互的负电荷的树脂。同样,在阴离子交换层析,降低 ph 值将导致分析物要少负电和不太可能与带正电的树脂进行交互。因此 ph 值的调整也可以用于选择性洗脱物从列。Ph 值调整而不是盐的使用可能是便于分离两种不同类型的蛋白质具有不同的 pI 值。

Procedure

1.准备样品和列

  1. 在这个演示中,一种 2 蛋白混合物将阳离子交换柱上分离: 血红蛋白和细胞色素 C.添加 0.2 毫升平衡缓冲 (pH 8.1) 蛋白样品和涡拌匀。2 分钟要删除任何泡沫的离心机。
  2. 阳离子交换柱置于试管 5 分钟,使树脂来解决。夹紧测试管柱上环站,以确保它是直立。
  3. 打开顶盖的列,然后底部的上限。滴出来进试管的重力作用下的列中允许的缓冲区。
  4. 洗两次列列-卷 (在这种情况下,列卷是 0.3 毫升) 的平衡缓冲区。添加第二个列卷之前的平衡缓冲滴出入废瓶让第一列卷 (0.3 毫升)。这一步让平衡与平衡缓冲区的列。在这一步,不打扰树脂慢慢添加平衡缓冲区。

2.运行蛋白样品通过阳离子交换柱

  1. 将列放在标记为"未绑定 1"2 毫升离心管中。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。
  2. 一旦样品已加载到列的顶部,用冲洗 0.3 毫升的平衡缓冲区在列的顶部添加缓冲区并允许它滴,一路过关斩将。重复此步骤 4 x (共 5 洗) 并收集每个洗在单独、 2 毫升离心管中。标记为"未绑定 1 5"管。
  3. 为最后 2 洗、 离心 10 s 1,000 x g,以确保所有未绑定的物种脱落的列。任何将绑定到列的样品不应在这些洗,但并不受约束的示例将洗不。离心提供更多的力量来洗未绑定列的材料。
  4. 提出一种新型的标记的 2 毫升离心机集合管"绑定 1"的列。把 0.3 毫升的洗脱缓冲液 (高盐,pH 5.5) 放在上面的列。离心机产生的淋洗液为 10 1,000 x g s。
  5. 通过将列放置在新的离心管,加入 0.3 毫升,重复洗脱步骤 2 次数越多,离心 10 s.标签这些"绑定 2 和 3"。
  6. 任何颜色的变化或对分数的观察记录。血红蛋白是彩色的蛋白,看起来红棕色,而细胞色素 C 是略带红色的颜色。

3.结果: 阳离子交换的血红蛋白和细胞色素 C

  1. 细胞色素 C 有 10.5 和血红蛋白 6.8 pI pI。因此,当使用时 ph 值 8.1 平衡缓冲液,血红蛋白不绑定到列因为它带负电荷的离子。细胞色素 C 在此 ph 值带正电,并绑定到列,因为 ph 值 < pI。
  2. 血红蛋白是未绑定的馏分中观察到,因为它不绑定到列。
  3. 细胞色素 C 被观察在绑定的分数,因为它被绑定到阳离子交换柱。

Figure 1
图 1。非结合型的分数 (血红蛋白) 和绑定的分数 (细胞色素 C) 的图片。

离子交换色谱法广泛应用于分离和孤立的带电的化合物,特别是大型生物分子。

这种类型的高效液相色谱法使用列填充固定相珠,称它为树脂。技术分离物基于它们与带电树脂的亲和力。

有两种主要类型的这种技术。在阳离子交换色谱中,负电荷的树脂用于绑定带正电的分析物。同样,在阴离子交换,负电荷的分析物将绑定到带正电的树脂。未绑定的化合物洗通过列,并被分析物然后可以在一个单独的容器收集。

这个视频将介绍基本的离子交换层析,并证明了技术分离蛋白质混合物在实验室里。

固定相是成功分离的一个关键组成部分。强阳离子交换树脂通常功能强酸性官能团,如磺酸。弱阳离子交换树脂功能弱的人群,如羧酸。

同样,强阴离子交换树脂利用强碱,如第四纪的胺,而弱阴离子交换树脂使用二级或三级胺。树脂的选择将取决于样品混合物的性质和感兴趣的被分析物。

缓冲器,统称为流动相,也是重要的分离,特别是 ph 值。蛋白质,ph 值是基于其等电点或 pI 而选择的。在 ph 值等于蛋白质的 pI,蛋白质是中性的。以上 pI,它将有一个净的负电荷,下面 pI,它会有净正电荷。必须选择 ph 值的缓冲区,因此蛋白质是适当带电并且能够绑定到固定相。

离子交换色谱法一般是四个步骤。首先,包含任一阴离子或阳离子交换树脂填充的柱被平衡使用的缓冲区。对于阴离子交换色谱柱,这涉及到树脂,确保它带正电荷的质子给予。

接下来,该示例加载在列上。缓冲区必须具有低电导率,如带电的粒子媲美的相互作用与树脂的采样。化合物的相反的电荷将绑定到树脂。分子不收费的或带有相同的电荷,保持未绑定。

在第三步,列被洗与额外的缓冲区,从列,留下绑定删除未绑定的组件。

最后,第四步是绑定分析物的洗脱。这被完成由使用盐的梯度,在盐浓度逐渐增加,或使用高盐的洗脱缓冲液。

如低盐会最容易打扰他们对树脂的离子键,将第一次,洗脱弱约束的分子。更强烈绑定的化合物将洗脱盐浓度高。

现在,概述了离子交换色谱法的基本知识,让我们看看其使用两种蛋白质的分离。

首先,要准备分离蛋白质混合物,添加 0.2 毫升的绑定缓冲区和涡拌匀。然后,离心混合物来删除任何泡沫。制备阳离子交换柱,钳它垂直上环站,并允许树脂来解决。

打开顶盖的列,然后底部。允许要滴出来到管其下的重力作用下的缓冲区。

准备列中,平衡通过加载列卷的缓冲区,在这个案例的 0.3 毫升。让滴的列,入废瓶的缓冲区。缓冲区的列卷已退出后,重复平衡的步骤。

若要运行实验,放置标记"未绑定 1"所在列下面的 2 毫升离心管。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。

一旦样品已加载,洗柱体积的缓冲区,并允许它一路流过。重复上述步骤共 5 洗的。收集每次洗涤管,标记为"未绑定 1"至"5"。最后 2 洗,离心试验为 10 列 s 以确保所有未绑定的物种洗掉列。将列放在一个新的 2 毫升离心收集管和"绑定 1"的标签。负载 1 柱体积的洗脱缓冲液立柱的顶端。10 离心机在 1,000 x g s。

多次重复洗脱步骤 2 以确保绑定被分析物的集合。标签管"绑定的 2"和"3"。任何颜色的变化或对分数的观察记录。

在此示例中,血红蛋白和细胞色素 C 被分开。血红蛋白具有 pI 6.8,而细胞色素 C 具有 10.5 pI。在 ph 值 8.1 缓冲区中,血红蛋白带负电荷的离子和没有绑定到列。相反,细胞色素 C 在 ph 值 8.1 带正电并绑定到列。

血红蛋白,带褐色的彩色蛋白,被发现的未绑定的分数,而细胞色素 C,带红色的彩色蛋白,有人在绑定的分数。

有许多形式的液相色谱法,每个都有不同的能力来分离组分的混合物。

在此示例中,柱层析法用于分离单、 双链 DNA 的混合物。羟基磷灰石或医管局,是磷酸钙结晶形式通常使用作为固定相由于其带正电的钙离子。在这种情况下,医管局列是分离 DNA 的理想,因为它可以将绑定到 DNA 的负电荷的骨干。

另一种形式的柱层析法经常用于分离蛋白是固定化金属离子亲和色谱或 IMAC。在 IMAC,固定相具有一种配体与金属离子,将绑定到一个组氨酸标签蛋白的兴趣。

所有其他组件的混合物退出列。蛋白质是咪唑化合物,具有相似的结构,与组氨酸,并与金属离子结合更强烈的解决方案进行洗脱。

柱层析常见的应用是高性能液相色谱法或高效液相色谱法。高效液相色谱法鉴定和分离混合物中的生物和非生物化合物,广泛应用于分析化学。

高效液相色谱法是类似于柱色谱法证明在此视频中,除了因为它是自动化的而且在非常高的压力下操作。这允许使用较小的固定相磁珠,与更高的表面积与体积的比值。因此,在流动相中组件与固定相之间的相互作用得到改善是可能的。

你刚看了朱庇特的简介离子交换色谱法。现在,您应该了解它、 4 步骤和一些相关的技巧背后的概念。

谢谢观赏 !

Applications and Summary

离子交换色谱法广泛应用于生物化学分离和纯化蛋白样品。蛋白质有许多氨基酸与被指控的官能团。蛋白质分离基于净电荷,是依赖于 ph 值。一些蛋白质是更带正电荷而其他人都更带负电荷。此外,肽标记可以基因添加到一种蛋白质来给它不在范围内正常蛋白质,使它能够完全分开的等电点。离子交换色谱法可用于分离多亚基蛋白复合物,作为不同的配置会有不同数量的电荷和不同的相互作用。

离子交换色谱法的另一个主要的应用是水分析。阴离子交换色谱法可以用于测量负离子,包括硫酸盐、 硝酸盐、 亚硝酸盐、 氟和氯的浓度。阳离子交换色谱法用于测量如钠、 钾、 钙、 镁离子的浓度。类型的离子交换色谱法也用于水的净化,因为大多数水软化剂筛选出在硬水通过将它们绑定到一种树脂,可以释放绑定的钠镁和钙离子。重金属,比如铜,铅,也能去除水离子交换色谱法。

离子交换色谱法也是有用的金属净化的。它可以用于净化 actanides,如钚,并从反应堆核乏的燃料棒中移除。它也可用于清除铀和从水或其他环境样品中删除它。

1.准备样品和列

  1. 在这个演示中,一种 2 蛋白混合物将阳离子交换柱上分离: 血红蛋白和细胞色素 C.添加 0.2 毫升平衡缓冲 (pH 8.1) 蛋白样品和涡拌匀。2 分钟要删除任何泡沫的离心机。
  2. 阳离子交换柱置于试管 5 分钟,使树脂来解决。夹紧测试管柱上环站,以确保它是直立。
  3. 打开顶盖的列,然后底部的上限。滴出来进试管的重力作用下的列中允许的缓冲区。
  4. 洗两次列列-卷 (在这种情况下,列卷是 0.3 毫升) 的平衡缓冲区。添加第二个列卷之前的平衡缓冲滴出入废瓶让第一列卷 (0.3 毫升)。这一步让平衡与平衡缓冲区的列。在这一步,不打扰树脂慢慢添加平衡缓冲区。

2.运行蛋白样品通过阳离子交换柱

  1. 将列放在标记为"未绑定 1"2 毫升离心管中。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。
  2. 一旦样品已加载到列的顶部,用冲洗 0.3 毫升的平衡缓冲区在列的顶部添加缓冲区并允许它滴,一路过关斩将。重复此步骤 4 x (共 5 洗) 并收集每个洗在单独、 2 毫升离心管中。标记为"未绑定 1 5"管。
  3. 为最后 2 洗、 离心 10 s 1,000 x g,以确保所有未绑定的物种脱落的列。任何将绑定到列的样品不应在这些洗,但并不受约束的示例将洗不。离心提供更多的力量来洗未绑定列的材料。
  4. 提出一种新型的标记的 2 毫升离心机集合管"绑定 1"的列。把 0.3 毫升的洗脱缓冲液 (高盐,pH 5.5) 放在上面的列。离心机产生的淋洗液为 10 1,000 x g s。
  5. 通过将列放置在新的离心管,加入 0.3 毫升,重复洗脱步骤 2 次数越多,离心 10 s.标签这些"绑定 2 和 3"。
  6. 任何颜色的变化或对分数的观察记录。血红蛋白是彩色的蛋白,看起来红棕色,而细胞色素 C 是略带红色的颜色。

3.结果: 阳离子交换的血红蛋白和细胞色素 C

  1. 细胞色素 C 有 10.5 和血红蛋白 6.8 pI pI。因此,当使用时 ph 值 8.1 平衡缓冲液,血红蛋白不绑定到列因为它带负电荷的离子。细胞色素 C 在此 ph 值带正电,并绑定到列,因为 ph 值 < pI。
  2. 血红蛋白是未绑定的馏分中观察到,因为它不绑定到列。
  3. 细胞色素 C 被观察在绑定的分数,因为它被绑定到阳离子交换柱。

Figure 1
图 1。非结合型的分数 (血红蛋白) 和绑定的分数 (细胞色素 C) 的图片。

离子交换色谱法广泛应用于分离和孤立的带电的化合物,特别是大型生物分子。

这种类型的高效液相色谱法使用列填充固定相珠,称它为树脂。技术分离物基于它们与带电树脂的亲和力。

有两种主要类型的这种技术。在阳离子交换色谱中,负电荷的树脂用于绑定带正电的分析物。同样,在阴离子交换,负电荷的分析物将绑定到带正电的树脂。未绑定的化合物洗通过列,并被分析物然后可以在一个单独的容器收集。

这个视频将介绍基本的离子交换层析,并证明了技术分离蛋白质混合物在实验室里。

固定相是成功分离的一个关键组成部分。强阳离子交换树脂通常功能强酸性官能团,如磺酸。弱阳离子交换树脂功能弱的人群,如羧酸。

同样,强阴离子交换树脂利用强碱,如第四纪的胺,而弱阴离子交换树脂使用二级或三级胺。树脂的选择将取决于样品混合物的性质和感兴趣的被分析物。

缓冲器,统称为流动相,也是重要的分离,特别是 ph 值。蛋白质,ph 值是基于其等电点或 pI 而选择的。在 ph 值等于蛋白质的 pI,蛋白质是中性的。以上 pI,它将有一个净的负电荷,下面 pI,它会有净正电荷。必须选择 ph 值的缓冲区,因此蛋白质是适当带电并且能够绑定到固定相。

离子交换色谱法一般是四个步骤。首先,包含任一阴离子或阳离子交换树脂填充的柱被平衡使用的缓冲区。对于阴离子交换色谱柱,这涉及到树脂,确保它带正电荷的质子给予。

接下来,该示例加载在列上。缓冲区必须具有低电导率,如带电的粒子媲美的相互作用与树脂的采样。化合物的相反的电荷将绑定到树脂。分子不收费的或带有相同的电荷,保持未绑定。

在第三步,列被洗与额外的缓冲区,从列,留下绑定删除未绑定的组件。

最后,第四步是绑定分析物的洗脱。这被完成由使用盐的梯度,在盐浓度逐渐增加,或使用高盐的洗脱缓冲液。

如低盐会最容易打扰他们对树脂的离子键,将第一次,洗脱弱约束的分子。更强烈绑定的化合物将洗脱盐浓度高。

现在,概述了离子交换色谱法的基本知识,让我们看看其使用两种蛋白质的分离。

首先,要准备分离蛋白质混合物,添加 0.2 毫升的绑定缓冲区和涡拌匀。然后,离心混合物来删除任何泡沫。制备阳离子交换柱,钳它垂直上环站,并允许树脂来解决。

打开顶盖的列,然后底部。允许要滴出来到管其下的重力作用下的缓冲区。

准备列中,平衡通过加载列卷的缓冲区,在这个案例的 0.3 毫升。让滴的列,入废瓶的缓冲区。缓冲区的列卷已退出后,重复平衡的步骤。

若要运行实验,放置标记"未绑定 1"所在列下面的 2 毫升离心管。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。

一旦样品已加载,洗柱体积的缓冲区,并允许它一路流过。重复上述步骤共 5 洗的。收集每次洗涤管,标记为"未绑定 1"至"5"。最后 2 洗,离心试验为 10 列 s 以确保所有未绑定的物种洗掉列。将列放在一个新的 2 毫升离心收集管和"绑定 1"的标签。负载 1 柱体积的洗脱缓冲液立柱的顶端。10 离心机在 1,000 x g s。

多次重复洗脱步骤 2 以确保绑定被分析物的集合。标签管"绑定的 2"和"3"。任何颜色的变化或对分数的观察记录。

在此示例中,血红蛋白和细胞色素 C 被分开。血红蛋白具有 pI 6.8,而细胞色素 C 具有 10.5 pI。在 ph 值 8.1 缓冲区中,血红蛋白带负电荷的离子和没有绑定到列。相反,细胞色素 C 在 ph 值 8.1 带正电并绑定到列。

血红蛋白,带褐色的彩色蛋白,被发现的未绑定的分数,而细胞色素 C,带红色的彩色蛋白,有人在绑定的分数。

有许多形式的液相色谱法,每个都有不同的能力来分离组分的混合物。

在此示例中,柱层析法用于分离单、 双链 DNA 的混合物。羟基磷灰石或医管局,是磷酸钙结晶形式通常使用作为固定相由于其带正电的钙离子。在这种情况下,医管局列是分离 DNA 的理想,因为它可以将绑定到 DNA 的负电荷的骨干。

另一种形式的柱层析法经常用于分离蛋白是固定化金属离子亲和色谱或 IMAC。在 IMAC,固定相具有一种配体与金属离子,将绑定到一个组氨酸标签蛋白的兴趣。

所有其他组件的混合物退出列。蛋白质是咪唑化合物,具有相似的结构,与组氨酸,并与金属离子结合更强烈的解决方案进行洗脱。

柱层析常见的应用是高性能液相色谱法或高效液相色谱法。高效液相色谱法鉴定和分离混合物中的生物和非生物化合物,广泛应用于分析化学。

高效液相色谱法是类似于柱色谱法证明在此视频中,除了因为它是自动化的而且在非常高的压力下操作。这允许使用较小的固定相磁珠,与更高的表面积与体积的比值。因此,在流动相中组件与固定相之间的相互作用得到改善是可能的。

你刚看了朱庇特的简介离子交换色谱法。现在,您应该了解它、 4 步骤和一些相关的技巧背后的概念。

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