L'utilisation d'un hémacytomètre pour compter les cellules

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

De nombreuses expériences biomédicales nécessitent la manipulation d'une quantité connue de cellules, afin d'obtenir des données précises, reproductibles et statistiquement pertinentes. Par conséquent, apprendre à compter les cellules est une technique particulièrement essentielle pour n'importe quel chercheur biomédicale. La façon la plus commune pour compter les cellules est d'utiliser un hémacytomètre - un instrument qui porte deux grilles gravées au laser, qui aide dans l'énumération d’un échantillon cellulaire sous un microscope à lumière simple. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour extrapoler le nombre de cellules dans la solution expérimentale.

Cette vidéo va vous montrer comment : ajuster la concentration de l'échantillon cellulaire afin que vous ne comptiez pas trop - ou trop peu - de cellules , comment utiliser un hémacytomètre de compter un petit ( ~ 10 μl) échantillon de cellules ; comment déterminer quel quadrant de la grille à utiliser pour le comptage; comment calculer le nombre total de cellules dans la solution expérimentale, en fonction du quadrant utilisé, et la façon de déterminer la viabilité de votre population cellulaire en utilisant l'exclusion au bleu de trypan. En outre, diverses situations expérimentales pour lesquels la détermination fiable et précise du nombre de cellules est nécessaire, sont également discutées, y compris par exemple, en utilisant un compteur de cellules automatisé.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. L'utilisation d'un hémacytomètre pour compter les cellules. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Le dénombrement des cellules est une étape importante dans de nombreuses expériences cellulaires pour déterminer le nombre de cellules et leur viabilité. En général, l'objectif du comptage est de déterminer combien de fois un échantillon d'une concentration cellulaire inconnue doit être diluée pour l’utilisation ulterieure. L'outil de laboratoire le plus courant pour compter des cellules est l'hémacytomètre.

L’hémacytomètre est un outil de comptage qui fut originalement créé pour le comptage des cellules du sang. Au centre de l’hémacytomètre se trouvent deux chambres de comptage, sur lesquelles on peut trouver une grille gravée au laser.

La grille est constituée de neuf principaux quadrants. Les quatre quadrants des coins sont divisés en 16 quadrants plus petits. Le quadrant central est divisé en 25 de ces petits quadrants, dont chacune est ensuite divisée en 16 micro-quadrants.

A l'extrémité de chaque chambre sont placees des brèches pour l'introduction des échantillons. C’est dans cette brèche que l’on vide l'échantillon de cellules à compter.

De part et d'autre des chambres de comptage se trouvent les supports de montage, sur lesquels repose la lamelle de quartz, generalement 0,1mm au-dessus de la chambre de comptage.

Puisque la surface de chaque grand carré est de 1 mm2, le volume contenu dans chaque grand carré est de 0,1 mm3 ou 1/10 000ième de ml.

Avant de compter, toujours prendre un moment pour nettoyer la chambre de comptage et la lamelle a l’aide d’éthanol et d’un tissu, afin d’éliminer les fibres et empreintes digitales, ou secher les residus d’eau.

Ensuite, ajouter avec précaution une petite quantité d'eau à chacun des supports de montage de la lamelle. La tension à la surface de l'eau va maintenir la lamelle en place.

Maintenant brasser doucement la suspension de cellules, ou mélanger dans la pipette de haut en bas, pour dissocier les amas de cellules. Utilisez une micropipette pour aspirer environ 10 μl de la suspension, puis remplir l'un des ports d'introduction avec l'échantillon. La solution sera aspirée dans la chambre de comptage par capillarité et devrait couvrir la grille au complet.

Pendant que les cellules se déposent, sélectionnez l'objectif, puis positionnez l’hémacytomètre sur la plateforme.

Regardez ensuite les cellules au microscope. S'il y a moins de 5 cellules dans chaque grands quadrants, vous aurez peut-etre besoin de centrifuger votre échantillon à nouveau et remettre le culot en suspension dans un plus petit volume. Si les cellules se chevauchent ou sont tout simplement trop denses pour être facilement distinguées les unes des autres, vous devrez peut-être diluer votre échantillon dans un volume plus grand. Assurez-vous de garder trace du facteur avec lequel vous avez dilué vos cellules. Vous en aurez besoin pour vos calculs plus tard.

Maintenant il est temps de compter les cellules!

Comme nous en avons parlé plus tôt, la chambre de comptage est recouverte d'une grille gravée au laser. Les lignes des quadrants rendent plus facile l’identification des cellules que vous comptez. Choisissez la taille de quadrant appropriee en fonction de la densité des cellules dans votre échantillon. Par exemple, s’il y a un petit nombre de cellules, compter toutes les cellules dans l'un des quadrants du coin. Pour les échantillons avec une quantité moyenne de cellules, choisissez l'un des 16 plus petits quadrants. Si il y a une très grande densité de cellules, compter les cellules dans l'un des 25 quadrants centraux. Peu importe le secteur que vous choisissez ou la densité de l'échantillon, comptez au moins 20 à 50 cellules par quadrant.

Toutes les cellules ne tomberont pas parfaitement dans les quadrants. Vous pouvez par exemple compter les cellules qui touchent les lignes du haut et de gauche, mais ignorer les cellules touchant les lignes du bas et de droite. Pour obtenir le résultat le plus précis possible, utilisez un compteur de cellules pour garder une trace des cellules comptees, puis prenez la moyenne du nombre de cellules dans quatre quadrants de la même taille.

Pour calculer le nombre de cellules dans un volume de 1 ml, multiplier le nombre de cellules comptées par 10 000, car, comme nous l'avons mentionné précédemment, chaque grand carré sur la grille represente 1/10 000ième de ml. Si vous comptiez l'un de ces grands quadrants, il suffit de multiplier ce nombre. Si vous comptiez l'un des petits carrés dans l'un des quadrants de coin, multipliez ensuite ce nombre par 16. Si vous avez compté toutes les cellules dans l'un des 25 quadrants centraux, multiplier ce nombre par 25. Si vous avez dilué votre suspension cellulaire avant de charger l’hémacytomètre, vous aurez également besoin de multiplier par le facteur de dilution.

Ensuite, pour calculer le nombre de cellules dans 1 ml de cet échantillon, nous multiplions les 20 cellules dans ce quadrant central par 104 et par 25 pour obtenir un total de 5 x 106 cellules par ml d'échantillon.

Maintenant que nous connaissons le nombre total de cellules dans 1 ml d’échantillon, nous avons besoin de multiplier ce nombre par le volume total de notre solution. Ainsi, par exemple, si nous avons 5 x 106 cellules par ml dans 2 ml, nous aurons un total de 1 x 107 cellules.

Alors, pour limiter les erreurs de comptage, les problèmes de répartition inégale des cellules, ou les erreurs de pipetage, charger l'autre côté de la chambre et compter votre échantillon de cellules une deuxième fois.

Compter les cellules au microscope est également un moment propice pour évaluer la viabilité des cellules dans votre échantillon. Le bleu de trypan, un colorant utilise pour déterminer la viabilité, est souvent mélangé avec l'échantillon avant d'être chargés dans l’hémacytomètre.

Les cellules vivantes excluent ce colorant, car elles sont très sélectives sur ce qu'elles autorisent au travers de leurs membranes. Une cellule morte, cependant, n'a pas de membrane intacte, ce qui permet au bleu de trypan de passer à travers et de marquer le cytoplasme.

Pour vérifier la viabilité de votre échantillon de cellules, diluez une partie de votre échantillon de la suspension cellulaire dans le bleu de trypan, puis vider l'échantillon coloré au bleu de trypan comme vous le faites avec l'échantillon cellulaire régulier. Sous contraste de phase, les cellules vivantes apparaissent lumineuses et dorées et doivent être comptées; ne comptez pas les cellules mortes qui sont ternes et bleues.

Calculer le nombre de cellules comme précédemment, mais cette fois en multipliant le nombre final par le facteur de dilution du bleu de trypan. Donc, si notre échantillon représentatif d'origine avait d'abord été dilué dans du bleu de trypan, nous aurions alors multiplié notre nombre total de cellules par notre dilution 1:10 bleu de trypan, pour un total de 1x108 cellules de notre échantillon.

Lorsque vous avez terminé le comptage, n'oubliez pas de nettoyer la lamelle et chambre de comptage!

Maintenant que vous êtes un professionnel du comptage de cellules, nous allons voir pourquoi le comptage des cellules peut etre utiles au cours de certaines experiences.

Après avoir isolé les cellules d'un tissu normal ou expérimental, il est important de savoir combien de cellules vous avez récupéré. Ici, les chercheurs voudront savoir combien de splénocytes ou cellules de la rate, ils ont isolé à partir de cette rate de souris.

Lorsque vous effectuez une expérience pour évaluer comment réagissent deux différentes populations de cellules, il est important de savoir combien vous mélangez de cellules de chaque type, comme dans cette expérience de co-culture avec des cellules B et T.

Vous aurez besoin de savoir combien de cellules vous avez pour bien d’autres types d’expérience cellulaires. Voici une expérience appelée ELISPOT, mise en place pour déterminer le nombre de cellules d’un échantillon qui sécrètent de l'interféron gamma, une protéine inflammatoire, en réponse au virus du papillome humain.

Lors d'une expérience dans laquelle l'ARNm doit être extrait ou isolé, à partir de vos cellules d'intérêt, il est important de savoir combien de cellules vous avez au départ, afin d'extraire une quantité suffisante d'ARNm pour l'expérience.

L' hémacytomètre est un moyen peu coûteux et un outil relativement facile à utiliser pour le comptage des cellules, mais il peut être fastidieux et presente le risque d’une erreur humaine.

Le compteur portatif automatique Scepter est, comme son nom l'indique, un dispositif de comptage à main qui a une précision de comptage améliorée par rapport à l' hémacytomètre. Il peut établir une mesure à la fois de la taille et du volume des cellules dans un échantillon cellulaire.

Le compteur de cellules automatisé TC10 évalue à la fois le nombre de cellules et la viabilité, calcule automatiquement le nombre total de cellules dans l'échantillon, et permet également aux cellules d'être vue sur son écran de lecture.

Vous venez de regarder l'introduction au comptage des cellules présenté par JoVE. Dans cette vidéo, nous avons examiné ce qu’est un hémacytomètre, comment compter les cellules et déterminer leur viabilité, et différentes raisons pour lesquelles vous pourriez avoir besoin de compter des cellules. Merci de votre attention et n'oubliez pas de ne pas compter les cellules bleues!

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