Separación de proteínas SDS-PAGE

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

Electroforesis del Gel de poli-acrilamida de sodio dodecil sulfato, o SDS-PAGE, es una técnica utilizada para separar mezclas de proteínas basadas en su tamaño y nada más. SDS, un detergente aniónico, se utiliza para producir una carga uniforme a lo largo de las proteínas que han sido linealizado. Primera carga en un gel hechos de poliacrilamida y aplicando un campo eléctrico sobre el gel, luego se separan proteínas SDS-revestida. El campo eléctrico actúa como la fuerza impulsora, dibujo las proteínas SDS cubierto hacia el ánodo con proteínas más grandes, más lentamente que las proteínas pequeñas. Para identificar las proteínas por tamaño, estándares de proteínas de tamaño conocido se cargan junto con las muestras y bajo las mismas condiciones.

Este video presenta una introducción a SDS-PAGE primero explicando la teoría detrás de él y más tarde demostrando su procedimiento paso a paso. Se discuten diversos parámetros experimentales, como la concentración de poliacrilamida y voltaje aplicado el gel. Aguas abajo como Coomassie y plata manchas se introducen los métodos y variaciones del método de tinción, como 2D electroforesis en gel se presentan.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. Separación de proteínas SDS-PAGE. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

SDS-PAGE es una técnica utilizada por muchos investigadores para separar mezclas de proteínas por tamaño. Realización de esta técnica es un primer paso esencial para muchos métodos de análisis de proteínas, como el immunoblotting. Por sí mismo, es una herramienta útil en la evaluación de pureza y tamaño de la proteína.

Para entender la técnica de SDS-PAGE, primero debe entender los componentes de su principio. SDS-PAGE es electroforesis del Gel de poli-acrilamida de sodio dodecil sulfato. Sodio dodecil sulfato, la primera parte de este o "SDS", es un detergente aniónico. Esto significa que se compone de un grupo hidrofílico con una carga negativa neta y una cadena larga hidrofóbica con carga neutra.

La cadena hidrofóbica mantas proteínas en proporción a su masa a un ritmo de 1,4 gramos de SDS por gramo de proteína. Esto proporciona las proteínas de la fuerza motriz necesaria para el tamaño por separación en un campo eléctrico.

Electroforesis en Gel de poli-acrilamida utiliza un hidrogel de poliacrilamida. La poliacrilamida es un polímero que forma una matriz muy regular a través del cual las proteínas pueden moverse. El es del gel más concentrado, más lento las proteínas que atraviesan a través de ella cuando se expone a un campo eléctrico. El proceso de utilización de un campo eléctrico uniforme espacialmente para influir en un movimiento de objetos se denomina electroforesis.

SDS-PAGE se realiza en las proteínas aisladas de diferentes fuentes, incluyendo las células en cultivo, tejidos, sangre, orina y levadura.

Las proteínas de estas diversas fuentes primero deben estar separadas de otros componentes celulares mediante técnicas de homogeneización y centrifugación, seguido a menudo por el uso de almacenadores intermediarios de la lisis.

Una vez que la proteína aislada, se mide a menudo su concentración, para asegurar igual carga de muestras, mediante la comparación de la cantidad de proteína en la muestra a los estándares de albúmina en un ácido Bicinchoninic o BCA, ensayo colorimétrico.

Un paso importante para recordar es la adición del buffer de carga. El tampón de carga tiene 3 funciones principales. En primer lugar, gracias a más agentes reductores y SDS, desnaturaliza las proteínas, que significa básicamente convierte las estructuras complejas de proteínas en una cadena lineal de aminoácidos. En segundo lugar, contiene glicerina, que asegura que la muestra no flota cuando está cargada en los pozos del gel. Y finalmente, más comerciales tampones de carga incluyen un colorante, como azul de bromofenol, que puede ser rastreado para medir el progreso del paso de electroforesis.

Después de añadir el tampón de carga, las muestras necesitan ser mezclado y luego hervida durante 5 minutos. Esto permite que los enlaces fuertes de di-sulfuro en las proteínas que se rompa con la ayuda de un agente reductor como el beta-mercaptoetanol. Una vez todos los enlaces de disulfuro se SDS pueden más uniformemente cubrir las proteínas.

A continuación, las muestras son girar rápidamente hacia abajo y entonces están listas para ser cargados en el sistema de gel para electroforesis.

Antes de que las muestras se pueden cargar, primero debe armarse el sistema de gel. Esto comienza con la compra o fabricación de un gel de poliacrilamida. Geles prefabricados se están volviendo más populares porque acrylimide es neurotóxico y puede causar daño cerebral. El cartucho de gel contiene pozos que se utilizan para cargar las muestras.

Una vez que los geles están asegurados en su lugar, las cámaras interiores y exteriores están llenos de un búfer que contiene la misma concentración de iones que se utiliza para hacer los geles. Esto crea un circuito eléctrico que pasa sin problemas del cátodo, a través del gel y en el ánodo.

A continuación, escalas de peso molecular normalmente se cargan en el gel, seguido de las muestras. Como funciona el gel, la escalera de extensión y crear bandas de proteínas visibles de tamaños conocidos. En los pasos finales, estas bandas se pueden utilizar para calcular el tamaño de cada proteína.

Una vez que se cargan todas las muestras, los terminales positivo y negativo en la caja de gel están conectados a una fuente de energía capaz de mantener una tensión constante durante un largo periodo de tiempo. Geles se inician normalmente en alrededor de 60V hasta que toda la muestra ha entrado en la región de gel llamada el "gel de apilamiento". Entonces, el voltaje se incrementa a alrededor de 200V durante 30 minutos a 1 hora dependiendo del tamaño y la concentración del gel y del tamaño de la proteína de interés.

Cuando es completa, el cassette está eliminado y abierto para exponer el gel. El gel entonces puede ser teñido con una mancha típica de proteína, como el coomassie tinte azul o plata, para visualizar las bandas de proteínas en el gel. Tinción de Coomassie puede detectar bandas con tan poco como 50 nanogramos de proteína, mientras que la plata puede detectar bandas con tan poco como 1 nanogramo de proteína.

En electroforesis en gel bidimensional, las muestras están separadas por dos propiedades separadas en geles, una dimensión a la vez. En primer lugar, las muestras son cargadas y dispuestas según sus puntos isoeléctricos en tiras de gradiente de pH localizada. Las proteínas en la franja de entonces se desnaturalizan y se colocan encima un gel de poliacrilamida al típico donde se asegura en lugar con solución de gel fresco. Entonces, segunda separación de dimensión se realiza por SDS-PAGE.

Mientras que la concentración isoeléctrica no es la única opción para 2-D electrophoresis del gel, es la más común. Electroforesis en gel bidimensional es una valiosa herramienta que proporciona penetraciones en los complejos de proteínas y sub-organelas organización.

Después de correr el gel, una muy común procede a transferir las proteínas desde el gel hacia una membrana de PVDF o nylon para análisis. Entonces puede utilizar anticuerpos específicos para sondear la membrana y proteínas de interés. Aquí se muestran resultados típicos immunoblot cuando el investigador utiliza 3 técnicas de amplificación de señal para determinar la que mejor demuestra la presencia de la proteína Pit-1 en una serie de diluciones seriadas.

Sólo has visto video de Zeus en la separación de proteínas mediante SDS-PAGE. Ahora debe comprender los pasos implicados en la solución de una proteína por tamaño usando esta técnica de gran alcance. ¡Como siempre, gracias por ver!

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