Séparation de protéines avec SDS-PAGE

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

L'Electrophorèse sur Gel de Polyacrylamide en présence de Dodécylsulfate de Sodium, ou SDS-PAGE, est une techique largement utilisée pour la séparation de mélanges de protéines, basée sur leur taille et rien d'autre. SDS, un détergent anionique, est utilisé pour produire une charge égale à travers la longueur des protéines qui ont été linéarisées. Par, d'abord, leur chargement dans un gel fait de polyacrylamide et, ensuite, en appliquant un champ électrique au gel, les protéines enrobées au SDS sont alors séparées. Le champ électrique joue la force motrice, dirigeant les protéines enrobées au SDS vers l'anode avec les plus grosses protéines se déplaçant plus lentement que les petites protéines. En vue d'identifier les protéines par leur taille, les standards de protéines de tailles connues sont chargés en parallèle avec les échantillons et subissent les mêmes conditions.

Cette vidéo présente une introduction à la technique SDS-PAGE en expliquant tout d'abord la théorie sous-jacente et ensuite en montrant la procédure étape par étape. Une varité de paramètres expérimentaux, tels que la concentration de polyacrylamide et la tension appliquée au gel sont discutés. Les méthodes de coloration en aval comme Coomassie et silver stains sont introduites, et des variations de la méthode, telle que l'électrophorèse sur gel 2D sont présentées.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Séparation de protéines avec SDS-PAGE. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

SDS-PAGE est une technique utilisée par de nombreux chercheurs pour séparer des mélanges de protéines de différentes tailles. La réussite de cette technique est une étape de base essentielle pour de nombreuses méthodes d'analyse de protéines, comme l’immunotransfert (ou immunoblotting en anglais). En soi, c’est un outil utile pour évaluer la taille et la pureté des protéines. \

Afin de comprendre la technique SDS-PAGE, vous devez d'abord comprendre ses principaux composants. SDS-PAGE signifie Dodécyl Sulfate de Sodium et Electrophorèse avec un Gel de Polyacrylamide. La première partie, dodécylsulfate de sodium ou "SDS", est un détergent anionique. Cela signifie qu'il est composé d'un groupe hydrophile avec une charge nette négative et une longue chaîne hydrophobe de charge neutre.

Les longues chaînes hydrophobes recouvrent les protéines en proportion de la masse des protéines à un taux de 1,4 gramme de SDS par gramme de protéine. Ceci permet d'obtenir des protéines chargées négativement qui seront entrainées et séparées en fonction de leurs tailles dans un champ électrique.

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide utilise un hydrogel à base de polyacrylamide. Le polyacrylamide est un polymère qui forme une matrice très régulière à travers laquelle les protéines peuvent se déplacer. Plus le gel est concentré, plus les protéines le traverseront lentement lors de l’exposition au champ électrique. Le processus de déplacement d’objets dans l’espace sous l’effet d’un champ de force électrique uniforme est appelé électrophorèse.

SDS-PAGE est effectuée sur des protéines isolées à partir de nombreuses sources très différentes, y compris des cellules en culture, des tissus, du sang, de l'urine, et des levures.

Les protéines provenant de ces sources diverses doivent d'abord être séparées des autres composants cellulaires en utilisant des techniques, incluant l'homogénéisation et la centrifugation, souvent suivis par l'utilisation de tampons de solubilisation.

Une fois que les protéines sont isolées, la concentration protéique est souvent mesurée, pour s’assurer de charger une quantité égale de protéines pour chaque échantillon, en comparant la quantité totale de protéines dans l'échantillon à des standards d'albumine dans un test colorimétrique à l’aide de l’acide bicinchoninique, ou BCA.

Une étape importante à retenir est l'addition du tampon de chargement. Le tampon de chargement a trois fonctions principales. Tout d'abord, grâce au SDS et à des agents réducteurs supplémentaires, on dénature les protéines, ce qui signifie essentiellement qu'il défait les structures protéiques complexes en une chaîne linéaire d'acides aminés. Deuxièmement, il contient de la glycérine, qui assure que l'échantillon ne flotte pas quand il est chargé dans les puits du gel. Et enfin, la plupart des tampons de chargement commerciaux comprennent un colorant, tel que le bleu de bromophénol, qui peut être observé pour vérifier l'avancement lors de l'électrophorèse.

Après avoir ajouté le tampon de chargement, les échantillons doivent être mélangés et ensuite bouilli pendant 5 minutes. Ceci permet de rompre les fortes liaisons di-sulfure dans les protéines à l'aide d'un agent réducteur tel que le bêta-mercaptoéthanol. Une fois toutes les liaisons disulfures brisées, le SDS peut enrober d’avantage les protéines.

Ensuite, les échantillons sont centrifugés rapidement et sont alors prêts à être chargés dans le système de gel pour électrophorèse.

Avant que les échantillons puissent être chargés, le système de gel doit d'abord être assemblé. Ceci commence par l'achat ou la fabrication d'un gel de polyacrylamide. Les gels préfabriqués sont de plus en plus populaire parce que l’acrylimide est neurotoxique et peut provoquer des lésions cérébrales. La cassette du gel contient des puits qui sont utilisés pour charger les échantillons.

Une fois que les gels sont fixés à leur place, les chambres intérieures et extérieures sont remplies d'un tampon qui contient la même concentration en ions utilisée pour préparer les gels. Ceci crée un circuit électrique qui passe sans heurt depuis la cathode, à travers le gel et vers l'anode.

Ensuite, les standards de poids moléculaires sont généralement chargés dans le gel, suivit par les échantillons. Comme les échantillons avancent, l'échelle va se déplacer et créer des bandes visibles de protéines de tailles connues. A la fin, ces bandes peuvent être utilisées pour calculer la taille de chaque protéine.

Une fois que tous les échantillons sont chargés, les bornes positive et négative de la boîte de gel sont raccordées à une source d’alimentation capable de maintenir un voltage constant pour une longue période de temps. Les gels sont généralement ajustés aux alentours de 60 volts jusqu'à ce que la totalité des échantillons soit entrée dans la zone de gel appelée "zone de concentration". Ensuite, la tension est augmentée à environ 200 volts pendant 30 minutes à 1 heure selon la taille et la concentration du gel et de la taille de la protéine d'intérêt.

Quand l'électrophorèse est terminée, la cassette est enlevée et ouverte pour exposer le gel. Le gel peut ensuite être coloré avec un colorant générique pour les protéines, tels que le bleu de Coomassie ou la coloration à l'argent, pour visualiser les bandes de protéines dans le gel. La coloration de Coomassie permet de détecter des bandes avec au moins 50 nanogrammes de protéines, tandis que la coloration à l'argent peut détecter des bandes avec au moins 1 nanogramme de protéines.

Dans l’électrophorèse sur gel en deux dimensions, les échantillons sont séparés par deux propriétés différentes sur des gels, une dimension à la fois. En premier lieu, les échantillons sont chargés et agencés en fonction de leurs points isoélectriques et localisés sur des bandes de gradient de pH. Les protéines de différentes bandes sont ensuite dénaturées et sont placées dans un gel de polyacrylamide typique où elles sont maintenues en place par une solution de gel frais. Ensuite, la séparation de la seconde dimension est effectuée par SDS-PAGE.

Bien que l’établissement du point isoélectrique n'est pas la seule option pour une électrophorèse sur gel en deux dimensions, c’est la plus commune. L’électrophorèse sur gel à deux dimensions est un outil précieux qui permet de mieux comprendre les complexes protéiques et l'organisation des organites cellulaires.

Après l'exécution du gel, une étape suivante très courante consiste à transférer les protéines du gel sur une membrane en PVDF ou nylon pour l’analyse. Vous pouvez ensuite utiliser des anticorps spécifiques pour investiguer la membrane et chercher des protéines d'intérêt. Sont présentés ici des résultats typiques d'immunotransfert où le chercheur a utilisé trois techniques d'amplification de signal différentes pour déterminer celle qui représente le mieux la présence de la protéine Pit-1 à travers une série de dilutions.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la séparation des protéines par SDS-PAGE. Vous devriez maintenant comprendre les étapes impliquées dans la résolution d'une protéine par sa taille en utilisant cette technique puissante. Comme toujours, merci pour votre attention!

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